一種基於水解過程的水溶性多糖分析方法
2023-05-01 22:29:06 1
專利名稱：一種基於水解過程的水溶性多糖分析方法
技術領域：
本發明涉及生化分析領域，是一種基於多糖水解過程的水解圖譜技術的實現多糖快速鑑別與定量分析的方法。
背景技術：
糖類是生物體內除蛋白質和核酸以外的又一類重要的物質，其蘊涵十分豐富的生物學信息，是細胞識別和信息遺傳等重要生物學功能的參與者。1988英國學者Rademacher 首次提出「糖生物學」學科(Glycobiology)概念，目前糖生物學已成為生命科學研究的前沿和熱點。多糖尤其水溶性多糖，在保健與醫療方面獨特的生理活性和功能，推動了該領域的快速進展。隨著科學儀器的飛速發展，有關多糖結構與功能關係方面研究備受關注。在研究領域，目前對多糖結構功能研究常用的大型儀器分析手段有氣質聯用、紫外及紅外光譜分析、核磁共振、高效液相、X射線晶體掃描、原子力顯微技術等。大型儀器分析手段使多糖結構與功能研究取得飛速發展。但由於多糖結構特點的複雜性，單一儀器分析手段又具有一定局限性。氣相色譜法測定糖類所遇到的主要困難是糖類本身沒有足夠的揮發性，必須將其轉化為揮發性衍生物才能進行測定。高效液相色譜法(HPLC)由於使用通用的示差折光檢測器靈敏度低而受到限制；若使用紫外或螢光檢測器來提高分析靈敏度，糖類化合物須先經過標記衍生，操作繁雜；並且衍生反應的發生總伴隨樣品的損失，這對目前越來越高的分析要求不利。傳統的電泳法及80年代後期迅速發展起來的高效毛細管電泳法能進行糖的分離檢測，但重複性相對較差，該技術的穩定性能達不到實際要求。核磁共振(NMR) 技術解決了糖苷鍵構型問題，但難以分辨非異頭質子的位移，解析方法十分繁雜。弄清楚一個多糖的結構往往需要數種大型儀器與化學分析方法結合，同時花費專業研究人員幾個月甚至整年的時間與精力。以上這些試驗方法由於測試周期長，根本無法在生產過程中使用。 生產領域多糖分析常常採用水解後測還原糖法、苯酚-硫酸比色和蒽酮-硫酸比色等方法， 多糖含量僅代表氧化後糖殘基的數量，這實際是一種粗略的方法，無法對多糖特點進行表徵。目前有關多糖分析的專利「用於多糖的定性與定量方法」(中國200910031276. 5)描述的是基於水解後的終產物特點進行多糖的表徵分析的。本發明是基於傳感器技術記錄的多糖水解過程中變化圖譜結合軟體分析進行多糖的鑑別與分析。本發明依靠傳感器技術(包括生物傳感技術和光度傳感技術)獲得水溶性多糖水解過程信息，根據過程變化特點來推演多糖的特徵，目前國內外未見相關報導。
發明內容
基於水解過程的水溶性多糖分析方法其主要特徵在於建立適合多糖水解過程中水解組分快速測定的的傳感器，主要有葡萄糖傳感器、還原性末端總數傳感器、半乳糖傳感器、木糖傳感器等；依據以上傳感器記錄水溶性多糖水解過程中以上參數的變化狀況，繪製該多糖在該特定條件下的水解圖譜；根據水解譜圖的不同實現不同多糖的快速鑑別；將各種多糖的在標準條件下的水解圖譜收錄到資料庫中，根據開發的比對軟體實現多糖特徵的快速比對分析、鑑別及定量分析。本發明具體內容如下1)多糖標準化水解。多糖水解方式主要為酸水解、酶水解及酸酶結合方式。水解譜圖是通過傳感器記錄的水解過程信息。標準水解模式是多糖水解濃度固定及水解條件精準控制下進行的，保證了在同樣條件下可圖譜可重複性。2)適合酶水解過程的葡萄糖傳感器、還原性末端傳感器、半乳糖傳感器、木糖傳感器是獲取水解過程數據的關鍵。其中葡萄糖傳感器、半乳糖傳感器、木糖傳感器等屬於固定化酶傳感器；還原性末端總數傳感器屬於光度傳感器。專利權單位多年從事生物傳感器研究與開發，有系列專利，傳感器的穩定性和準確度保障了水解數據的可靠性。3)水解過程圖譜的獲得及多糖水解圖譜庫建立。特定水解條件下水解過程的多參數變化曲線形成的圖譜作為多糖鑑別分析與定量的主要依據。4)基於水解圖譜比對分析軟體。比對分析軟體是基於單參數特徵及多參數相互關聯的特徵來進行軟體設計。5)輔助儀器解析。對於圖譜相近的情況難以實現特徵鑑別的可以同時進行儀器分析。儀器分析主要有氣質聯用、紫外及紅外光譜分析、核磁共振、高效液相、X射線晶體掃描、原子力顯微技術等手段。本發明具有以下特點1、本發明的分析方法以多糖水解過程的多參數變化圖譜為基礎的。2、本發明的標準化水解條件為精密控制的酸水解和酶水解條件。3、本發明的多糖水解圖譜是依據我方自主研製的適合水解過程的葡萄糖、半乳糖、木糖固定化酶傳感器及還原性末端數光度傳感器獲得。
圖1樹舌多糖水解過程中葡萄糖、還原糖末端數雙參數水解圖譜；圖2平行測定樹舌多糖水解過程中葡萄糖、還原糖末端數雙參數水解圖譜；圖3靈芝多糖水解過程中葡萄糖、還原糖末端數雙參數水解圖譜；圖4蟲草胞外多糖水解過程中葡萄糖、還原糖末端數雙參數水解圖譜。
具體實施例方式實施例1)樹舌、靈芝、蟲草胞外多糖的提取分別取培養了 7天的樹舌、靈芝、蟲草發酵液，5000rpm，離心lOmin，並用4層紗布過濾，分離菌絲體。菌絲體洗滌兩次，每次用磁力攪拌器攪拌池，離心，並用4層紗布過濾， 合併上清液。將上消夜倒入1.5倍體積的無水乙醇中，靜置。樹舌多糖和靈芝多糖成膠團狀析出，因此可以用玻璃棒直接挑出，而蟲草多糖沉澱後，倒出上清液，沉澱用lOOOOrpm，離心lOmin，棄上消液。將多糖置於60°C烘箱中烘乾，即得粗多糖樣品。2)多糖的水解精密稱取0. IOOOg樣品，於試管中，加入10. OmL蒸餾水充分溶解，再加入10. OmL 0. 08mol/LH2SO4,混勻，沸水浴5h。前半個小時每隔5min，以後每隔IOmin取0. 50mL的水解液，將水解液迅速冷卻並加入0. 50mL0. 08mol/L的NaOH，調整pH至7，終止水解反應，5h後即得一系列不同多糖水解過程的多糖水解圖譜。3)多糖水解過程的信息獲得應用生物傳感分析儀SBA-40D型(山東省科學院生物研究所研製)、全自動還原糖測定儀S⑶-IV型(山東省科學院生物研究所研製)實時記錄水解過程的變化量，形成水解圖譜。4)水解圖譜的比對分析分析樹舌多糖、靈芝多糖、蟲草多糖的水解過程可知，前期水解液中還原糖、葡萄糖的含量迅速增加，而後期趨於平緩；在精密控制水解條件下，由圖1、圖2知同一種多糖的水解圖譜是穩定可以重複的；比較樹舌多糖、靈芝多糖、蟲草胞內多糖、蟲草胞外多糖的水解圖譜之間區別非常明顯。每一種多糖的水解圖譜特徵明顯，同種多糖水解過程葡萄糖、還原糖測定數值穩定，從多糖水解過程中葡萄糖、還原糖末端數的雙參數水解圖譜可以實現不同來源的多糖的鑑別與分析。
權利要求
1.基於水解過程的水溶性多糖分析方法其主要特徵在於建立適合多糖水解過程中水解組分快速測定的的傳感器，主要有葡萄糖傳感器、還原性末端總數傳感器、半乳糖傳感器、木糖傳感器等；依據以上傳感器記錄水溶性多糖水解過程中以上參數的變化狀況，繪製該多糖在該特定條件下的水解圖譜；根據水解譜圖的不同實現不同多糖的快速鑑別；將各種多糖的在標準條件下的水解譜圖收錄到資料庫中，根據開發的比對軟體實現多糖特徵的快速比對分析、鑑別及定量分析。
2.基於權利要求1所述的多糖分析方法是建立在多糖水解過程譜圖基礎上的，主要根據特定水解條件下水解過程的多參數變化曲線形成的譜圖作為多糖鑑別分析與定量的主要依據。
3.基於權利要求1所述的多糖水解譜圖是通過傳感器記錄的水解過程信息，主要有葡萄糖傳感器、還原性末端傳感器、半乳糖傳感器、木糖傳感器等；其中葡萄糖傳感器、半乳糖傳感器、木糖傳感器等屬於固定化酶傳感器；還原性末端總數傳感器屬於光度傳感器。
4.基於權利要求1所述的多糖水解方式主要為酸水解方式和酶水解方式兩種方式。
5.基於權利要求1所述的標準水解模式是多糖水解濃度及酶解(酸解)、溫度、酸鹼度水解條件與方式有系統規定前提下，並在緊密水解裝置精準控制下進行的。
6.基於權利要求1所述水解圖譜是在同樣條件下可重複實現的。
7.基於權利要求1比對分析軟體是基於單參數特徵及多參數同一水解過程相互關聯的特徵來進行軟體設計的。
全文摘要
本發明涉及一種多糖分析方法，其主要特徵是根據建立的葡萄糖傳感器、還原性末端總數傳感器、半乳糖傳感器、木糖傳感器等適合多糖水解過程中水解組分快速測定的傳感器，記錄標準水解條件下水溶性多糖水解過程中以上參數的變化曲線，形成該多糖標準的水解圖譜。依據建設的各種多糖在標準條件下的水解譜圖和相應的比對分析軟體實現不同多糖的快速鑑別及定量分析。
文檔編號G01N1/28GK102253167SQ201110097208
公開日2011年11月23日 申請日期2011年4月19日 優先權日2011年4月19日
發明者史建國, 孟慶軍, 張利群, 楊俊慧, 楊豔, 鄭嵐, 馬耀宏 申請人:山東省科學院生物研究所