一種檢測乳品中黃麴黴毒素m1的試劑板的製作方法

2023-05-02 04:08:46 1

專利名稱：一種檢測乳品中黃麴黴毒素m1的試劑板的製作方法
技術領域：
本實用新型涉及一種檢測乳品中的黃麴黴毒素Ml的試劑板，特別是一種檢測乳品中黃麴黴毒素Ml的免疫膠體金快速檢測試劑板。
背景技術：
黃麴黴毒素(Aflatoxin，AFT)屬真菌毒素(Mycotoxin)，它主要是由黃麴黴和寄生麴黴所產生的，其他麴黴如片黴、青黴、鐮孢黴、根黴等也可產生AFT，AFT常見於花生及其製品、玉米、棉籽，以及一些堅果類食品和飼料中。1993年AFT被世界衛生組織(WHO)的癌症研究機構劃定一類致癌物，是一種毒性極強的劇毒素物質。據調查發現，黴菌影響世界上 40%的食品作物，並在代謝過程中產生毒素。聯合國糧農組織估計全世界穀物供應的25% 受黴菌毒素汙染。據報導全世界每年至少有2%的農作物因汙染黃麴黴毒素而報廢。動物牲畜食用被黃麴黴毒素汙染的飼料後，在其泌乳中發現有黃麴黴毒素Ml殘留。黃麴黴毒素危害性大，存在範圍廣，醫學專家指出黃麴黴毒素的最短致癌時間僅為M周。為了預防黃麴黴毒素中毒事件的發生，維護人類健康，世界上已有70多個國家和地區對食品中黃麴黴毒素的含量作了嚴格限量要求。美國聯邦政府有關法律規定，人類消費的牛奶中Ml的含量不能超過0. 5μ g/kg， 其他動物飼料中的含量不能超過300 μ g/kg。根據我國國家標準GB 2761-2005《食品中真菌毒素限量》的規定，鮮乳和乳製品中黃麴黴毒素Ml不得超過0. 5 μ g/kg。目前檢測乳品中黃麴黴毒素的方法主要有薄層色譜法(TLC)、高效液相色譜法 (HPLC)和酶聯免疫吸附法(ELISA)。薄層色譜法是檢測黃麴黴毒素的傳統常用方法，是應用最早、最廣的分析技術，曾是我國測定黃麴黴毒素的國家標準方法之一。該方法的優點在於所用的試劑、設備簡單，費用低廉，容易掌握，適用大量樣品的分離、篩選，一般的實驗室均可開展。但是薄層色譜法檢測黃麴黴毒素靈敏度低、重現差、操作煩瑣、時間長且安全性差等缺點，已越來越不適用現代分析的要求。高效液相色譜法是目前國內測定黃麴黴毒素使用最多、也是比較權威的方法，目前有國家標準出臺，靈敏度高、精度高、能同時分析多種黃麴黴毒素類型。但該法的樣品前處理相對複雜，檢測周期長、程序複雜、所需試劑繁多、操作時需要專門的技術人員，難以滿足現代檢測快速、簡捷、現場化的要求。酶聯免疫吸附法是應用抗原抗體特異性反應和酶的高效催化作用來測定黃麴黴毒素含量的免疫分析方法，具有特異性高、靈敏度高、快速、簡便等優點。但是ELISA法中酶的活性易受反應條件影響，由此易造成測定結果重複性較差。此外ELISA試劑壽命短，因此需要低溫保藏，而且該法在配製標準曲線時需要接觸到黃麴黴毒素標準品，操作不安全。

實用新型內容本實用新型針對乳製品中的黃麴黴毒素Ml殘留開展研究，提供一種用於現場快速篩選黃麴黴毒素陽性樣本的免疫膠體金快速檢測試劑板。本實用新型具有簡單、快速、靈敏度高等特點，無須儀器設備配合測定，檢測既可在實驗室中進行，也可在進行實地測定， 5 IOmin完成對樣品中黃麴黴毒素Ml的定性和半定量測定。本實用新型試劑板由上下兩塊塑料模板和背襯組成，背襯上依次緊密粘貼著樣品墊、膠體金結合墊、硝酸纖維素膜和吸水墊。其中樣品墊、膠體金結合墊、硝酸纖維素膜和吸水墊相鄰各部分間有l_2mm的重疊，其目的一方面是保證層析作用從樣品墊到吸水墊部位順利進行，另一方面是為了使樣品溶液與樣品墊有充分反應時間，樣品墊上的緩衝體系可以中和樣品溶液的酸鹼度，保證樣品溶液中的有效成分與膠體金結合墊上的金標抗體順利發生反應。膠體金結合墊上包被有抗黃麴黴毒素Ml單克隆抗體與膠體金的結合物；硝酸纖維素膜上從樣品墊到吸水墊方向依次包被有黃麴黴毒素Ml-載體蛋白偶聯物和羊抗鼠 IgG，分別作為檢測線和控制線。偶聯黃麴黴毒素Ml的載體蛋白可為牛血清白蛋白(BSA)、 卵清蛋白(OVA)、血藍蛋白(KLH)。本實用新型試劑板應用層析式抗體免疫競爭原理，通過抗原和金標抗體反應顯色，特異性檢測乳製品中的黃麴黴毒素Ml殘留。如果樣品溶液含有黃麴黴毒素Ml殘留，黃麴黴毒素Ml先和膠體金顆粒上的抗體反應，因此當膠體金顆粒隨樣品溶液擴散至檢測線時，膠體金顆粒上抗體的活性位點因被樣品溶液中的黃麴黴毒素Ml佔據而無法與檢測線上黃麴黴毒素Ml特異性抗原結合；當樣品中的黃麴黴毒素Ml含量超過試劑板檢出限時，試劑板上的檢測線顯色較控制線淺甚至無顯色，判定為陽性。反之，當樣品中黃麴黴毒素Ml 含量在試劑板檢出限以下或無殘留時，試劑板上的檢測線顯色與控制線相近或偏深，判定為陰性。本實用新型試劑板的各部分組成成分與功能如下塑料模板，起固定試紙條及標示功能區(加樣孔、檢測區、控制區)的作用。背襯為一面塗有不乾膠的不吸水的韌性材料，如PVC板，起固定支持試紙其他組成部分的作用。樣品墊由玻璃纖維製成，起吸收樣品溶液與緩衝樣品溶液PH值的作用。膠體金結合墊由聚酯膜製成，其上標記有抗黃麴黴毒素Ml單克隆抗體與膠體金的結合物，是樣品溶液中的有效成分與金標抗體發生反應的場所。硝酸纖維素膜部分主要作用是將反應結果以肉眼可見的顏色表徵出來。吸水墊為濾紙，作為吸水部分其作用是將移動上來的多餘的溶液吸收。本實用新型試劑板具有如下有益效果(1)特異性好。本實用新型試劑板的抗黃麴黴毒素Ml單克隆抗體對黃麴黴毒素Ml 的交叉反應率均為100%，與其他種類的抗生素包括玉米赤黴烯酮、伏馬黴素、赭麴黴素、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇等藥物沒有交叉反應。(2)靈敏度高。根據我國國家標準GB 2761-2005《食品中真菌毒素限量》的規定， 我國食品中黃麴黴毒素Ml允許量標準為鮮乳及乳製品中黃麴黴毒素Ml限量不得超過 0. 5 μ g/kg。本實用新型試劑板的靈敏度可達到0. 5 μ g/kg，完全可以滿足市場的檢測需求。(3)操作簡便快速。本實用新型試劑板將免疫層析反應所需的大部分原料已整合到試劑條中，滴樣後抗原抗體反應在固相膜上快速進行，大大縮短了檢樣時間，滴樣後5
410分鐘內即可讀取結果。本實用新型試劑板的操作不需任何專業培訓，普通人員均可操作， 只需按說明滴樣後用肉眼判讀即可。(4)不依賴於實驗設備。本實用新型試劑板在直接滴樣跑板後，通過肉眼判斷硝酸纖維素膜上檢測線和控制線的顏色深淺對比來判讀結果，整個檢測過程無需用到任何實驗設備，真正做到了對實驗設備零要求，尤其適合於野外及現場操作，易於推廣。(5)成本低，效益好。本實用新型試劑板生產工藝簡單，可實現單個樣本檢測，生產成本低，大大降低了檢測費用。

圖1為黃麴黴毒素Ml免疫膠體金快速檢測試劑板結構示意圖，其中1為樣品墊，2 為膠體金結合墊，3為硝酸纖維素膜，4為檢測線，5為控制線，6為吸水墊，7為不乾膠，8為 PVC 板。圖2為黃麴黴毒素Ml免疫膠體金快速檢測試劑板操作示意圖，其中S為加樣孔， C為控制區，T為檢測區。圖3為黃麴黴毒素Ml免疫膠體金快速檢測試劑板結果判定示意圖，其中C為控制區，T為檢測區。
具體實施方式
本實用新型試劑板的製備包括黃麴黴毒素Ml載體蛋白偶聯物的製備、抗黃麴黴毒素Ml單克隆抗體的製備、膠體金溶液、膠體金標記抗黃麴黴毒素Ml單克隆抗體的製備和黃麴黴素毒素免疫膠體金快速檢測試劑板的組裝。1.黃麴黴毒素Ml與載體蛋白的偶聯採用碳二亞胺法(EDC法)將黃麴黴毒素Ml與載體蛋白(牛血清蛋白BSA和卵清蛋白OVA)偶聯製備免疫抗原和包被抗原。稱取2mg黃麴黴毒素Ml和^ig CM0，溶解於400 μ L吡啶中，25°C避光振搖反應。 直至反應完全。將反應產物冷凍乾燥，所得殘渣用3mL超純水溶解，用0. lmol/L氫氧化鈉溶液調PH值至8. 0。分3次加入IOmL苯(4mL、3mL、3mL)，振蕩萃取有機相中未反應的黃麴黴毒素Ml。在水相中滴加0. lmol/L稀鹽酸調pH值至3.0，得沉澱，用乙酸乙酯抽提沉澱物， 真空乾燥得中間產物黃麴黴毒素Ml肟。稱取0.ang黃麴黴毒素Ml 肟，溶於 100 μ L DMF_^K (6 9，V/V)中，加入 2mg EDC, 避光混勻。再加入0. 5% C-BSA溶液，25°C避光、100r/min反應4h，補加EDC 2mg，繼續反應。將偶聯產物裝入透析袋，在O.Olmol/L PBS (pH 7.4)中置4°C透析3d，期間換透析液3 次(每24h更換一次)。用OVA替代BSA，採用同樣方法製備黃麴黴毒素Ml-卵清蛋白偶聯物。2.抗黃麴黴毒素Ml單克隆抗體的製備取6 8周齡雌性Balb/c小鼠，將作為免疫原的黃麴黴毒素Ml-BSA偶聯物與等體積的弗氏完全佐劑乳化，按100 μ g/只劑量皮下注射，之後每隔3周加強免疫1次，用不完全佐劑腹腔注射。融合前3d強化免疫1次，不用佐劑，劑量加倍。細胞融合按常規方法進行將Sp2/0多發性骨髓瘤細胞與免疫脾細胞按1 10的比例混合，在50%聚乙二醇作用下融合，HAT培養基懸浮，分種於96孔培養板中，37°C，5% CO2培養箱中培養。[0037]融合後，待細胞生長到培養孔面積的1/4時，採用分步篩選法篩選雜交瘤細胞。初篩選擇10mg/L黃麴黴毒素Ml-BSA包被酶聯板，被測孔加培養上清，孵育、清洗後，加入羊抗鼠IgG-HRPd 1000)，0PD顯色。篩選出的陽性孔再用黃麴黴毒素Ml-卵清蛋白偶聯物包被的酶聯板進行阻斷間接ELISA。將細胞培養上清與2X 10_3mol/L黃麴黴毒素Ml溶液等量混合，37°C感作lh，加入已包被的酶標板中。另外用PBS (0. 01mol/L、pH7. 4)替代黃麴黴毒素Ml溶液作對照，其餘步驟同上。若黃麴黴毒素Ml阻斷後的OD值降至對照孔的50%以下，則判為陽性孔。經2 3次檢測都呈陽性的孔，立即用有限稀釋法進行克隆化。體外培養將克隆化的細胞株擴大培養，細胞濃度達5 X IOVmL時停止換液，細胞全部死亡後收集培養液。體內誘生腹水給腹腔注射液體石蠟10天後的小鼠腹腔注射克隆化細胞株IO7個細胞，7天後抽取腹水。3.膠體金溶液的製備膠體金顆粒的平均大小為30nm，其製備方法為在IOOmL去離子水中加入ImL 1% 檸檬酸三鈉，煮沸後迅速加入ImL 氯金酸，繼續煮沸lOmin，冷卻後，4°C下保存備用。4.膠體金標記抗黃麴黴毒素Ml單克隆抗體的製備取已製備好的膠體金溶液IOOmL,用0. lmol/L碳酸鉀溶液調pH到8. 0。邊攪拌邊加入2mg抗黃麴黴毒素Ml單抗，攪拌20min，逐滴加入2mL 25mol/L聚乙二醇 20000 (PEG20000)，攪拌 15min。20，OOOrpm 離心 15min，棄上清液，加入 IOmL pH 7. 4 的 PBS 緩衝液(含0. 4mol/L PEG)清洗2次。將沉澱用IOmL #2% BSA的PBS緩衝液(pH 7. 4) 溶解，用0. 22 μ m無菌過濾器過濾後，4°C保存備用。5.黃麴黴毒素Ml免疫膠體金快速檢測試劑板的組裝用點膜機把適當濃度的黃麴黴毒素Ml-載體蛋白偶聯物及羊抗鼠IgG噴在硝酸纖維素膜上，分別作為檢測線和控制線，37°C烘箱乾燥他。以同樣方法，將製備好的金標記黃麴黴毒素Ml單克隆抗體包被在膠體金結合墊上。檢測試劑組成為一個PVC背襯，在其上按順序粘上樣品墊、膠體金結合墊、硝酸纖維素膜和吸水墊。用切割機將貼好的大卡切割成4mm寬的條，裝入塑料模板中製成檢測試劑板，再放入帶乾燥劑的鋁箔袋中密閉儲存。6.黃麴黴毒素Ml免疫膠體金快速檢測試劑板檢測實施操作方法6. 1樣品製備打開溫浴器電源及加熱開關，預熱，使加樣槽實際溫度維持在50°C左右，將盛有原奶的的離心管和試劑板放於試管架上預熱5分鐘，移液器取100 μ L預熱的原奶加入酶標孔中，用滴管將孔中金標充分混勻，反應1分鐘，靜置待檢。6. 2檢測步驟吸取待檢樣品溶液100 μ L滴加到加樣孔中，加樣後開始計時；結果應在3 5min 讀取，其他時間判讀無效。觀察時，試劑板水平放置於觀察者正面。6. 3結果判斷讀取結果時，將試劑板水平置於觀察者正面。陰性㈠T線顯色(檢測線，靠近加樣孔一端)比C線(控制線)深或一樣深，表示樣品中黃麴黴毒素Ml殘留含量低於檢測限或不含黃麴黴毒素Ml殘留。陽性⑴Τ線顯色比C線淺，或T線無顯色，表示樣品中黃麴黴毒素Ml殘留含量
6高於檢測限，T線顯色比C線越淺，表示樣品中黃麴黴毒素Ml含量越高。 無效未出現C線，可能是操作不當或試劑板已失效。應再次閱讀說明書，並用新
的試劑板重新測試。
權利要求1.一種檢測乳品中黃麴黴毒素Ml的試劑板，由上下兩塊塑料模板和背襯組成，背襯上依次緊密粘貼著樣品墊、膠體金結合墊、硝酸纖維素膜和吸水墊，其特徵在於樣品墊、膠體金結合墊、硝酸纖維素膜和吸水墊各部分之間有l_2mm的重疊，膠體金結合墊上包被有抗黃麴黴毒素Ml單克隆抗體與膠體金的結合物，硝酸纖維素膜上從樣品墊到吸水墊方向依次包被有黃麴黴毒素Ml載體蛋白偶聯物和羊抗鼠IgG，分別作為檢測線和控制線。
2.根據權利要求1所述的試劑板，其特徵在於偶聯黃麴黴毒素Ml的載體蛋白可為牛血清白蛋白、卵清蛋白、血藍蛋白。
3.根據權利要求1所述的試劑板，其特徵在於背襯為一面塗有不乾膠的PVC板，樣品墊由玻璃纖維製成，膠體金結合墊由聚酯膜製成，吸水墊為濾紙。
專利摘要本實用新型涉及一種檢測乳品中黃麴黴毒素M1的試劑板，可用於檢測乳品中的黃麴黴毒素M1。本實用新型試劑板由上下兩塊塑料模板和背襯組成，背襯上依次緊密粘貼著樣品墊、膠體金結合墊、硝酸纖維素膜和吸水墊。硝酸纖維素膜從樣品墊到吸水墊方向上依次噴有檢測線和控制線，可將反應結果以肉眼可見的顏色表徵出來。該試劑板可進行半定量直觀檢測，整個操作過程僅需20min，且無需任何昂貴實驗設備輔助，利於大規模樣本篩選，適合工商部門、檢驗檢疫機構、奶站以及乳製品生產加工企業對原料及產品中的黃麴黴毒素M1進行大規模快速檢測。
文檔編號G01N33/577GK202033368SQ20102069572
公開日2011年11月9日 申請日期2010年12月29日 優先權日2010年12月29日
發明者周崇盈, 張少恩, 桑麗雅 申請人:杭州南開日新生物技術有限公司