在植物汁液中產生蛋白質的方法

2023-05-01 21:32:36

專利名稱：:在植物汁液中產生蛋白質的方法本發明涉及產生能表達所需基因產物的遣傳上轉化過的植物的方法，也涉及具有相同能力的所說遺傳上轉化過的植物的克隆。具體的說，所涉及的植物是一類產生豐富汁液(fluid)的植物，並且，靶基因產物在所說汁液中被表達。更優選的，所說植物是橡膠(三葉橡膠屬)植物，所說的基因是編碼有藥用價值蛋白質產物的外源基因，所說的蛋白質產物能從植物產生的膠乳中獲得並能從中回收。以通過表達「外源」基因產生特異蛋白質為目的的各種微生物(如酵母、真菌和細菌)的遺傳轉化技術是眾所周知的。然而，微生物需要維治其生存和繁殖的合適條件，例如，通常需要小心控制環境溫度、pH值和通氣量，同時營養物必須以小心校準過的劑量加入到培養基中，並要移去廢產物。必須有嚴格的滅菌步驟以避免外來微生物的汙染。因而，微生物通常在複雜的發酵罐或生物反應器中培養，而且這些發酵罐或生物反應器被設置在昂貴維持的工廠中。上述費用被蛋白質終產物的高價格反映出來。最近，人們的注意力已轉向將外源基因引入到植物(例如菸草)中。本申請的基因轉化技術使得改進作物和可提取的、有價值的外源蛋白質(例如抗體)生物技術產物的各種重要的遺傳特徵相結合。與微生物不同，植物傾向於滿足自身的需要，僅需要陽光、水和基本的園藝投入，並且很容易在高效益的條件下培育。已開發出了幾種不同的技術能使外源基因引入到各種植物的品種中，這些技術包括——土壤桿菌屬微生物載體系統，該系統涉及用已插入外源基因的細菌(土壤桿菌屬)感染植物組織。用土壤桿菌屬微生物轉化植物細胞的許多方法是公知的(Vancanneytetal.，1990；Horschetal.，1985；Bevan，1984和Herrera-Estrellaetal.，1983)；——生物排列(biolistic)或粒子槍方法。這一方法通過用包衣DNA微粒轟擊(bombarding)可再生組織(例如分生組織或胚胎形成愈傷組織)使遺傳物質直接傳送到完整細胞或組織中。微粒透過植物細胞，作為被引入遺傳物質的惰性載體(Gordon-Kammetal.，1990和Sanfordetal，1987)。胚形成懸浮培養物微彈轟擊被證實能成功地產生黃楊屬植物(Daytonetal，1992)，棉花(Finer和McMullen，1990)、玉米(Gordon-Kammetal，1990)和大豆(McMullen和Finer，1990)的轉基因植物。影響經粒子轟擊的DNA傳送的各種參數己被限定(Kleinetal，1988；Wangetal，1988)；——通過將外源基因吸入到植物組織中(Simon，1974)；和——-electroporation然而，當採用這一方法時，靶產物的回收涉及到整個植物或至少植物的主要部分收穫和破裂。即使植物不是整體被採收，在可以進行下一次收穫之前它也需要長的恢復期再生長。此外，從植物例如菸草中(實際上也從大多數通常用於這些目的的微生物中)提取蛋白質產物涉及到組織固體的勻化作用。這會是相對困難和低效率的操作。巴西橡膠樹HeveabrasiliensisMuell-Arg屬於Euphorbiaceae家族，己被商業性開發用於產生天然橡膠約一個世紀。事實上在三葉橡膠屬中有九個品種，但Heveabrasiliensis被最廣泛地種植並獲得商業價值，因它給出最高的膠乳產量。膠乳傳統地用稱作「割膠」「的方法從橡膠樹抽取。這可以兩種技術進行，其一是樹皮切除技術，其中一塊樹皮從樹上割下以便膠乳流出(後續的割漿通過在相同切割處切除樹皮的一薄層進行)，其二是樹皮切入技術，按照這一技術在樹皮上鑽一個或多個孔使膠乳流出。因此，割膠是膠乳回收的非破環性方法，它可重複性地並在有規律的間隙(通常是每隔一天)進行。天然橡膠構成膠乳的約1/3，並且很容易用各種分離技術(如離心)抽提。產生豐富的樹液或流出物，即膠乳，橡膠樹是最重要的，膠乳可連續收穫而無有害影響，本發明利用橡膠樹的這一性質以及遺傳工程技術，提供了一種產生有藥用價值的蛋白質和其它靶產物的新的和有利的路線。按照本發明，這裡提供了一種產生遺傳上轉化過的產汁液植物的方法，該方法包括i)向植物組織插入控制靶產物表達的基因或基因片斷，和ii)從所說組織再生一種植物，該遺傳上轉化過的植物能夠在其所產生的汁液中表達靶產物。按照本發明的另一個實施方案，這裡提供了一種植物克隆，該克隆在其細胞中含有包括控制靶產物表達的一個啟動子和一個基因或基因片斷的染色體插入物，以便所說靶產物在其所產生的汁液中被表達或能夠被表達。在一個特別優選的實施方案中，本發明提供了一種三葉橡膠屬植物克隆，該克隆在其細胞中含有包括控制靶產物表達的一個啟動子和一個基因或基因片斷的染色體插入物，以便所說靶產物在其膠乳中被表達或能夠被表達。本發明還提供了產生前面提到類型的克隆的方法，該方法包括芽的稼接法種植、取出一個切條(takingacutting或另外進行一種適合遺傳上轉化的植物的營養繁殖。在另一個實施方案中，本發明提供了一種產生蛋白質或其它產物的方法，該方法包括i)從遺傳上轉化過的產汁液樹或植物或其克隆收穫汁液，和ii)從所說汁液中回收靶蛋白質或其它產物。該方法可用於三葉橡膠屬的所有品種，本文所提及的三葉橡膠屬植物和樹將相應地被理解，但Heveabrasiliensis是特別優選的。三葉橡膠屬植物很適合用於本發明中，因為它們產生的汁液(即膠乳)易於非破壞性的採收，易於處理，並且是天然蛋白質豐富的(而且因此可在轉基因植物中控制外源蛋白質產生)。然而，將會理解到其它產生(即保留或排出)豐富汁液或樹液的植物也適用於本發明，例子包括——龍舌蘭屬植物。一些品種能從它們挖空的樹心(hollowed-outpith)每天產生高達一升的流出物。——椰子樹。其花朵可被採收，導致流水物的大量流出。——植物器官，它們不排出但保留相當體積的汁液，例如，未成熟的椰子汁液(即「水」或「奶」)的液體胚乳可被大量收穫。本發明範圍內的方法分成三個主要階段i)植物的遺傳轉化過程，其中代表編碼靶蛋白質或其它產物的基因的DNA分子被插入到植物組織的遺傳補體中。所述基因也需要啟動子的伴隨是合意的。只要所謂的「通用」啟動子(它們是非組織特異性的，通常在所有植物組織包括樹液或汁液中啟動基因表達)可被使用，該啟動子就是更優選的汁液特異性的。就橡膠植物來說，該啟動子是最優選的膠乳特異性的。各種向植物引入基因的技術是已知的，如上述所提到的，這些技術中的任何一種均可被使用。特別優選的是土壤桿菌屬微生物載體系統，這一系統涉及用一種已插入所需基因進行生物排列或粒子槍轟擊的土壤桿菌屬微生物感染植物組織，按這一方法，所需基因以一種微粒形式被推進到植物組織中。帶有插入基因或基因片斷的植物組織被稱作轉化過的或轉基因組織。就橡膠植物來說，轉化在花葯派生的愈傷組織上完成，所說愈傷組織是從三葉橡膠屬植物上花的雄蕊柱狀物取得的。被轉化技術引入的啟動子和基因或基因片斷對所涉及的植物來說可以是自生的或外源的。通過修飾啟動子或插入自身基因的多重複制體來提高該基因的表達是可能的。外源基因可被導入，這些基因編碼多種以蛋白質為基體的產物，最優選的是具有藥用價值的蛋白質產物。ii)從轉化過的組織再生植物，種植並養護至成熟。例如，通過組織培養技術，三葉橡膠屬的轉化過的愈傷組織被再生，經胚胎階段到小植株，該植株是轉因基的，在其遺傳補體中帶有被插入的基因。以後，小植株成熟至完全發育的轉基因橡膠樹，由被插入基因表達的靶蛋白質和其它產物存在於其膠乳中。iii)在由植物或樹產生的汁液中的靶蛋白質或其它產物的採集及回收。就三葉橡膠屬植物來說，收穫的汁液理所當然的將是膠乳。一旦轉基因橡膠植物生長至足夠成熟(通常是在2-5年之後)，就採割它們，在有規律的時間間隔收穫膠乳。然後，離心膠乳，以分離出天然橡膠，含水C-漿液和所謂的「底組分」。靶蛋白或其它產物可以包含在膠乳的任何部分，並且能經一般方法(例如製備型柱層析)提取和純化，較好情況下它們存在於C-漿液或底組分(bottomfraction)中，後者主要包括黃色體，黃色體是含有其自身漿液(B-漿液)的膜結合泡囊。可通過使用洗滌劑(如TritonX-100)裂開它們的膜或通過交替冷凍或解凍使B-漿液從黃色體釋放。膠乳中可以結合到生物膜上的任何靶蛋白質或其它產物都可通過用洗滌劑(例如十二烷基硫酸鈉)加溶的方法收回。本發明提供了一種合成許多蛋白質產物和非蛋白質產物的新的和有利的路線。它特別適合於有藥用價值的蛋白質產品的製備，從原理上講，倘若編碼其表達的基因是已知的，該技術應能應用於實質上任何以蛋白質為基質的產物的合成。由被插入基因直接編碼的蛋白質產物能在植物體由自身催化不同終產物的產生是所期望的。然後，後面的(蛋白質的或非蛋白質的)產物作為有商業價值的終產物被收穫。可以由轉基因植物或樹產生的產物的例子如下(a)治療糖尿病的胰島素(b)治療血友病(haemophilia)的血凝塊因子(c)治療心臟病的血塊溶解激活劑(d)治療腫瘤的腫瘤壞死因子(e)治療貧血的紅細胞生成素(f)生產疫苗的病毒包衣蛋白(g)「PHB」，一種類似於聚丙烯的塑料，用於製造瓶子，包裝材料等。本發明中的特異橡膠樹的使用具有許多明顯的優點，其中，下列特別值得注意——生產是連續的，因為含有靶蛋白或其它產物的膠乳在有規律的間隙收穫，並且產物回收簡單，因膠乳是一種汁液，靶產物的回收不涉及組織勻化。——該方法與環境協調，過程由太陽所驅動，因而是能量效率高的，並且基本上無汙染。——橡膠樹除要日常的園藝學養護外，不需要任何特別關注，因而它們的使用是低耗費的。——該技術能用於許多靶產物——從橡膠樹流出的乳膠完全沒有細菌和動物病毒，這一點與在使用遺傳上轉化過的微生物和動物時需採用的嚴格的滅菌操作正好相反。——橡膠樹易於克隆或營養繁殖，大多數通常是經芽的嫁接種殖。其它方法包括取出一個切條，壓條繁殖或組織培養。這樣，無數的遺傳性相同的植物(克隆)可從單個轉基因植物產生——所有這些都將在它們的膠乳中表達所需產物。——橡膠樹有實用的生命期，約30年，在此其間，除產生靶產物外，遣傳上轉化過的樹當然在其膠乳中連續產生天然橡膠，天然橡膠自身是有價值的商品。當其最終被砍伐時，該樹也產出了有價值的熱帶木材(橡膠木)，它是出口和製造家具非常需要的。適用於本發明的其它產汁液植物具有這些優點中的一些。附圖1，用色素底物X-gluc處理後三葉橡膠屬植物組織中的GUS活性。(A)對照愈傷組織。(B)從3周齡轟擊過的花葯愈傷組織取得的細胞。(C)對照胚狀體。(D)粒子轟擊後的胚狀體。所有照片放大倍數是25倍。附圖2，顯示與對照值(U.T.E)相比，在經轟擊過的三葉橡膠屬植物胚狀體(T.E)中GUS活性的杆狀圖。以平均值±s.d給出結果；n＝20個胚狀體。附圖3，與對照值相比在轟擊過的愈傷組織中的NPTII蛋白質水平。給出了含有NPTII基因的三種不同質粒(參見前述方法)的結果，以平均值±s.d.給出值；n＝x次重複。附圖4，顯示預先經質粒pDE10轟擊過的三葉橡膠屬植物組織中CAT活性的放射自顯影。表示了〔14C〕氯黴素(CAP)、〔14C〕1-乙醯基氯黴素(1-CAP)和〔14C〕3-乙醯基氯黴素(3-CAP)的位置。第1道用作陽性對照的商品CAT(Sigma)；第二道陰性對照(僅含緩衝液)；第3道對照(未經轟擊的)花葯愈傷組織，第4-6道用硫酸卡那黴素選擇3周後的不同轉化過的花葯愈傷組織；第7道從在硫酸卡那黴素存在下經轟擊的愈傷組織再生的胚狀物組織。附圖5，由X周齡抗菌選擇性的三葉橡膠屬植物愈傷組織中分離的DNA的gus基因的擴增。第1道1Kb梯。第2道500ngDNA，第3道100ngDNA。第4道20ngDNA.第5道4ngDNA.第6道0.8ngDNA。附圖6，(E)從附圖1所示的經粒子轟擊過的組織生長出的三葉橡膠屬植物的小植株，用色素底物X-gluc處理後的GUS活性。(F)對照根。(G)從轉化的胚狀體再生的根，所有照片放大25倍。附圖7，用從再生Heveabrasiliensis植物分離的基因組DNA的PCR進行的gus基因檢測。第1道1Kb梯，第2道從對照(未經轟擊的)植物獲得的4.0ngDNA；第3道從轉化的愈傷組織獲得的4.0ngDNA；第4道從轉化的胚狀體獲得的4.0ngDNA。第5道從轉化的三葉橡膠膠屬小植株的單葉分離出的4.0ngDNA。附圖8，(H)在X-gluc中培養的葉樣品的表面。未轉化的樣品端部未被染色，而轉化的樣品(下部)被染成藍色，照片放大倍數為10倍。(I)在X-gluc中培養的葉樣的截面，未轉化的樣品(端部)未被染色，而轉化的樣品(下部)被染成蘭色。照片放大倍數為31倍。現在以下列實施例進一步說明本發明，實施例1涉及用粒子槍法的Heveabrasiliensis的遺傳轉化，而實施例2和3分別說明了土壤桿菌屬微生物載體系統和吸入技術的用途，葡萄糖醛酸酶用作靶蛋自質的一個例子，但相同的步驟可通用於其它產物，只是用靶蛋白質的合適基因代替控制葡萄糖醛酸酶產生的基因。實施例中引用了下列縮寫詞MB＝三葉橡膠屬花葯培養起始培養基GUS/gus＝β-葡萄糖醛酸酶NPTII/nptII＝新黴素磷酸轉移酶CAT/cat＝氯黴素乙醯轉移酶PCR＝聚合酶鏈反應ELISA＝酶聯免疫吸附試驗CaMV＝花椰菜花葉病毒實施例1植物材料的組織培養從雄蕊柱狀物的單個花葯取出胚發生三葉橡膠屬植物花葯愈傷組織，將該愈傷組織在25℃置入並保持在MB培養基(Chenetal，1984)中，並在四周後用於在該培養基中的轉化，所有組織培養步驟基本上按照Chenelal，(1984)所描述的方案。植物表達載體下列質粒用於轉化含有β-葡萄糖醛酸酶(gus)基因的pBI22I.I(Jefferson，1987)，含有gus和nptII基因的pMON9793(Gas-set，MonsantoCompany，未出版)，含有Cat和nptII基因的pDE10(Rhodes，Norwich，UK)和含有nptII基因的pHP23(Paszkowski和Saul，1988)。這些基因在強CaMV35S啟動子控制下。重組質粒在大腸桿菌中生長，所說大腸桿菌是經鹼解(alkalilysis)分離並經氯化絕/溴化3.8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶鎓密度梯度離心(Sambrook，FritschandManiatis，1989)純化的。質粒DNA由其在260nm的吸收和凝膠電泳定量。微彈轟擊質粒DNA如現有技術(Gordon-Kammetal，1990)所描述的沉澱在鎢粒子上。該沉澱混合物包括在總體積575μL中的1.30mg鎢粒子、25μg質粒DNA，1.1MCaCl2.2H2O和8.7mM亞精胺。在以上述順序加入各組分後，混合物在4℃旋渦攪拌10分鐘，在500xg下離心5分鐘，然後棄掉550μL上清液，底部沉澱重新懸浮在剩下的25μL上清液中，並且其中的1μL鎢懸浮物被裝入微彈，用生物排列粒子槍(spearlineprecisionEngineeringLtd，UK)朝靶加速。花葯愈傷組織放置在Whatman1號濾紙片(7cm)的中央，該濾紙片在轟擊之前再放到含有MB培養基的塑料佩特裡細菌培養皿(9cm直徑)的中央。將愈傷組織培養物放置在微彈終止板下5cm，且在終止板和組織之間的中途設置一個100-μm網眼不鏽鋼篩以幫助鎢粒子分散。每塊板轟擊一次，然後將愈傷組織在25℃下的生長室中避光培養一會兒。轉化體的挑選在轟擊後25℃的避光培養後，從濾紙上輕輕移去愈傷組織並放置在含有MB培養基的新鮮的板上，在25℃避光繼續培養10天。將轟擊過的愈傷組織轉移到含有100μg硫酸卡那黴素/ml的MB選擇培養基上。在轟擊並轉移到含100g硫酸卡那黴素/ml的分化培養基上以及在25℃有光(250μEm-2s-1)培養四周後分離抗菌抑制性克隆。這刺激了芽和根的生長，然而，即使沒有抗菌選擇，僅有小部分(3％)的體細胞胚胎分化成小植株(Chenatal.，1981b)。酶試驗NPTII轉化組織的NPTII活性用ELISA試劑盒(5Prime-3Prime，Inc.，由CPLaborartories，UK獲得)測定，每個試驗使用約400μg的提取蛋白質。GUS三葉橡膠屬的轉化花葯愈傷組織、胚狀體和根中。β-葡萄糖苷酸酶活性的組織化學分析按Jefferson(1987)的方案使用底物5-溴-4-氯-3-吲哚基葡糖苷酸(X-gluc)來完成。在加入X-gluc18-36小時後測定組織被染成藍色的細胞，使用NikonSZM-U1∶10倍雙筒顯微鏡用KodacolorTungsten160T膠片顯微照相，用底物4-甲基-umbelliferyl-β-D-葡糖苷酸完成GUS活性的螢光測定試驗(Jeffersonetal.，1987)。CAT按Gormanetal.，1982所描述的方法測定CAT活性。使用1單位的細菌CAT酶(Sigma)用轟擊過的組織樣品平行作陽性對照。陰性對照包括CAT緩衝液和未經轟擊的胚狀體的提取物樣品。DNA分離和PCRDAN分離基因組DNA使用如Draperetal.，(1988)描述的蛋白酶方法分離。50mg凍幹的三葉橡膠屬植物組織用碾槌和研缽磨成極細的粉末。然後，粉末狀組織與400μL蛋白酶緩衝液(100mMTris-HClPH8.5，100mMNaCl，50mMEDTApH8.0，2.0％SDS，0.1mg蛋白酶KmL-1)充分混合併且以偶然輕輕轉動在37℃下培養1-2小時。用80μL苯酚和80μL24∶1(V/V)氯仿/異戊醇提取組織/緩衝液勻漿。離心分離水相併重複提取步驟。第二次提取後合併的水相用0.54體積的異丙醇在-20℃下沉澱過夜。第二天，沉澱用70％乙醇洗滌並重新懸浮在50μLTE緩衝液(10mMTris-HClPH8.0，1.0mMEDTAPH8.0)中。為三葉橡膠屬植物基因組DNA的限制性，在限制性緩衝液中經常包括2μL10×BSA/亞精胺)2.5mgBSAmL-1，40mM亞精胺以克服雜質出現引起的問題。PCR每一個PCR反應在含有10mMTris-HClPH8.8，50mMKCl、1.5mMMgCl2、50μL礦物油、200μMdATP、200μMdTTP、200μMdCTP、200μMdGTP、Taq聚合酶(0.5-1.0U)、DNA(2-10ng)和寡核苷酸引物5』GGTGGGAAAGCGCGTTACAAG3』和5』GTTTACGCGTTGCTTCCGCCA3』(分別在GUS基因的400-420和1599-1579位，Jeffersonetal，1986)的50μL溶液中進行。在PCR反應中每個引物使用100ng，Taq聚合酶從AmershamInternationalplc獲得。變性溫度是92℃(持續1分鐘)，退火溫度是55℃(持續1.5分鐘)，伸展溫度是72℃(持續2.0分鐘)，反應設定為30個循環，使用可程序化的熱控器(TheHybaidThermalReactor)。經使用TBE(0.9MTris-HCl，25mMEDTA，0.9mMH3BO3)作為顯層緩衝液(rμnningbuffer)將樣品在1.0％瓊脂糖/溴化3.8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶鎓膠上顯層(running)後檢測DNA。結果轉化和再生在為研究過渡基因表達所建立的將基因引入到大麥胚胎的方法(M.G.K.Jones，Rothamsted，UK)之後採用了生物排列方案。供粒子轟擊的新使用的花葯愈傷組織是高度胚形成三葉橡膠屬植物克隆派生的(克隆登記號11)。一段將轟擊過的愈傷組織轉移到選擇培養基中，卡那黴素抗性的微愈傷組織表現出生長緩慢，然而，這些轉化過的愈傷組織顯得健壯並在黑色和正在死亡的未經轟擊的愈傷組織中間呈白色(附圖1)。使用質粒pMON9793轟擊後一旦加入X-gluc，呈現藍色的抗菌選擇性的愈傷組織和胚胎的百分率在愈傷組織中達90％，胚胎中達80％。使用pBI221.2但未用卡那黴素選擇時，呈藍色的百分率愈傷組織達60％，胚胎達70％(表2)，使用質粒pMON9793時在轟擊過的愈傷組織和胚胎中所表現出的高轉移效率很可能是由於卡那黴素選擇。表2表達GUS活性的愈傷組織和胚胎的百分率質粒10轉化體10愈傷組織數9表達GUS愈傷組織數8百分率90pMON979310花葯愈傷組織10胚胎6pBI221.27花葯愈傷組織60胚胎70GUS的組織化學試驗常說明在保持未經卡那黴素選擇的愈傷組織中的酶活性的異型，但是在經卡那黴素選擇後的細胞中表現出同型。當使用X-gluc時，沒有對照(未經轟擊的)花葯愈傷組織、胚胎或根染成蘭色。這些實驗的結果總結在示於附圖1的顯微照片中。使用螢光活性試驗(附圖2)證實了從GUS活性的組織化學染色所獲得的結果。90％被分析的轉化過的胚胎中被證實有GUS螢光活性，與未經轟擊的對照值相比轉化過的胚胎中的GUS活性總共增加4倍。使用ELISA技術(附圖3)對轉化過的愈傷組織中的NPIII水平定量。總的來說，NPTII蛋白質水平高出本底對照值約4倍，範圍從每mg總蛋白質28到32ngNPTII。除了使用gus作為報告基因(reportergene)外，我們還使用cat基因控制基因向三葉橡膠植物的傳遞。這些實驗的結果總結在附圖4所示的放射自顯影照片中。很明顯含有cat基因的質粒能通過轟擊傳遞並在三葉橡膠屬植物愈傷組織和胚胎組織中有效地被表達。在未經轟擊的對照組織(附圖4第3道)中僅觀察到CAT活性的很低水平。用PCR技術完成三葉橡膠屬植物愈傷組織中轉移的報告基因出現的直接檢測。Hamilletal.，(1991)的方法被用於擴增gus的內序列。使用至少0.8ng模板DNA經30個擴增循環後在瓊脂糖/溴化3.8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶鎓膠上可見單個帶(附圖5)，該擴增帶大小與gus基因相同。最後，在粒子轟擊後，我們設法再生兩個三葉橡膠屬小植株(無菌生長)(附圖6)。該小植株表現得很正常，以X-gluc處理後其根染成蘭色。用在源於愈傷組織的DNA上完成的相同的PCR方案證實了在這些小植株的一個中出現gus基因。如附圖7所示，用少至4.0ng三葉橡膠屬植物葉片DNA達到了gus基因的成功擴增。我們不能使用上描述的相同的PCR條件在任何對照(未經轟擊的)愈傷組織、胚胎或小植株中擴增gus基因。這些結果說明，如由報告基因試驗、卡那黴素抗性轉化體回收和PCR技術使用所測定的，微彈/微粒能將外源DNA轉入到Heveabrasiliensis細胞中。被帶到細胞中的DNA明顯地從微彈表面釋放並經某些被動或主動機制轉送到其基因可被表達的核中去。實施例2I愈傷組織轉化經選擇的三葉橡膠屬栽培品種的雄性花用Chlorox(5.25％a.i.次氯酸鈉)消毒5分鐘，接著用無菌蒸餾水洗滌幾次。花葯從雄蕊柱狀物切下並接種到MB培養基(20花葯/陪氏盤)中。培養物在25℃下避光培養。經土壤桿菌屬微生物遺傳轉化4周齡的三葉橡膠屬植物花葯愈傷組織用帶有葡萄糖苷酸酶和新黴素磷酸轉移酶基因的根瘤病土壤桿菌感染。後者具有對抗生素卡那黴素的抗性。愈傷組織浸在根瘤病土壤桿菌的經一夜培養的PH值為5.8的懸浮物中1分鐘，用含有7％蔗糖但沒有補充激素的MB培養基稀釋，以給出最終估計為3.7×108細胞/ml的細菌密度。菌群密度的估計通過測定培養一夜的培養物對在600nm的吸收來進行。過量的細菌懸浮物用無菌Whatman1號濾紙從愈傷組織吸收，該濾紙轉移到佩德裡平碟供2天的共培植。將上述愈傷組織轉移到含有抗生素氨噻頭孢菌素(250ug/ml)和鐵卡黴素(500ug/ml)的MB培養基中以殺滅其中土壤桿菌屬微生物。一周以後，上述愈傷組織置於選擇性平碟MB，Km100ug/ml)上，但仍保留氨噻頭孢菌素和鐵卡黴素。在一周間隙的後續繼代培養中，氨噻頭孢菌素和鐵卡黴素的濃度逐漸減低。II.轉化小植株的再生上述愈傷組織培養物置入MB培養基中並培養一周，然後每7天再移於到新鮮培養基(MB)中，3周後，培養物轉移到選擇分化培養基上。這一階段持續約2個月，其中包括30天後轉移到新鮮培養基中。培養物再在25℃避光培養。起始培養基(MB)和分化培養基兩者均含有硫酸卡那黴素(100ug/ml)以選擇轉化過的細胞。在分化培養基中大約60天後，發育的胚狀體轉移至發育培養基中以形成莖幹和根。該小植株種植在土壤中，然後養護至成熟。在用土壤桿菌屬微生物媒介插入GUS基因後，Heveabrasiliensis小植株成功地再生，該小植株表現得正常，且葉子的樣品經用X-gluc處理後染成蘭色，表明GUS基因的表達。當用X-gluc進行相似的處理時，從體外培養的未轉化過的三葉橡膠屬植物得來的葉子樣品不被染色。這些結果示於附圖8中。實施例3除了以如下的吸入方法，而不用土壤桿菌屬微生物載體系統完成遺傳轉化外，基本上按照實施例2的方法。4周齡的三葉橡膠屬花葯愈傷組織以將該組織置於37℃恆溫箱中30分鐘的方法脫水，該愈傷組織在含有編碼葡萄糖苷酸酶基因的DNA溶液(在無菌水中的100ugpBI221.1DNA)中吸漲30分鐘。該培養物轉移到MB培養基中，接著轉移到分化培養基中，然而與實施例2不同，培養基中不包含硫酸卡那黴素。參考文獻ChenZ(1984).-Rubber(Hevea)InSharpWR.EvansDA，AmmiratoPVandYamadhY(cds).Handbookofplantcellculture，Vol2Cropspecies，Macrnillan，NewYork:54(，571.DaytonWH，RichardBMandScottAM(1992).ExpressionofforeigngenesintransgenicYellow-PoplarPlants.PlantPhysiol.98114-120DraperD，ScottR.ArmitagePandWaldenR(1988).InPlantGeneticTransformationandGeneExpression-ALaboratoryManual.FinerJJandMcMullenMD(1990).Transformationofcotton(GossyDiumhirsutumL)vi2particlebombardment.PlantCellRep.8586-589.Gordon-KammWJ，SpencerTM，ManganoML.AdamsTR.DainesRJ，StartWG.OBrienJV，ChambersSA，AdamsWR，WilletsNG，RiceTB，MackeyCJ，KruegerRW.KauschAPandLemauxPG(1990).TransformationofmaizecellsandregeneuationoffertiletransgenicPlants.PlantCell2603-618.GormonCM，MoffatLFandHowardBH(1982).Mol.Cell.Biol.21044-1051.HamillJD.RounsleyS.SpencerA.ToddGandRhodesMJC(1991).Theuseofpolymerasechainreactioninplanttransformationstudies.PlantCellReports10221-224HarrisRR，DeRobertisGA.PierceDA，MoynihanMRandEvereitNP(1990).Heterogeneityofx-glucstainingintransgenicmaizecallus(abstract).InVitroCellDev.Biol.26(partII)69.JcffersonRA(1987).AssayingchimaericgenesinplantsTheGUSgenefusionsystem.PlantMolecBiol.Reporter5389-405.JeffersonRA，BurgessSMandHirshD(1986).BetaglucuronidasefromE.coliasagencfusionmarker.Proc.Natl.Acad.Sci.USA868447-8451.JeffersonRA，KavanagbTAandBevanMW(1987).GISfusionsbetaglucuronidaseasasensitiveandversatilegenefusionmarkerinhigherplants.EMBOJ63901-3902.KleinTM，FrommME，WeissingerA，TomesD，SchaafS，SiettenMandSanfordJC(1987).Transferofforeigngenesintointactmaizecellswithhigh-velocitymicroprojectiles.Proc.Natl.Acad.Sci.854305-4309.KleinTM，GradzielT，FrommMEandSanfordJC(1988).FactorinfluencinggenedeliveryintoZeamayscellsbyhigh-velocitymicroprojectile.Bio/technology6559-573.KleinTM，KornsteinL，SanfordJCandFrommME(1989).GenetictransformationofmaizeccllsbyparticlebombardmentPlantPhysiol.91404-444.McMullenMDandFinerJJ(1990).Stabletransfornationofcottonandsoybeanembryogenicculturesviamicroprojectilebombardmeut(abstract).J.CellBiochem14E285.MeijerEGM，SchilperoortRA，RuebS，vanOs-RuygrokPEandHensgensLAM(1991).Transgenicricccelllinesandplantsexpressionoftransferredchimaericgenes.PlanMol.Biol.16807-820.PaszkowskiJandSaulM(1988)-Directgenetransfertoplarts.InWeissbachA，Weissbach(eds).MethodsinEnaymology，vol188668-685.NewYorkAcademicPress.PlattSGandYangN-S(1987).Dotassayforneomycinphosphotransferaseactivityincrudecellextracts.Anal.Biochem.162529-535.SambrookJ，FritschEF.andManiatisTMolecularCloningALaboratoryManual.2ndedn.ColdSpringHarborLaboratory，ColdSpringHarbor，NY(1989).SanfordJC，KleinTM，WolfEDandAllenN(1987).Deliveryofsubstancesintocellsandtissuesusingaparticlebombardmentprocess.ParticleScienceandTechnology527-37.WangY-C，KleinTM.FrommME.CaoJ.SamfordJCandWuR(1988).Transientexpressionofforeigngenesinrice，wheatandsoybeancellsfollowingparticlebombardment.PlantMol.Biol.11433-Vancanneyt，G.，Schmidt，R.，O′Connor，A.，Sanchez.Willmitzer，L.andRocha-Sosc，M.(1990).Constructionofanintron-containingmarkergeneSplicingoftheintronintransgenicplantsanditsuseinmonitoringearlyeventsinAgrobacterium-mediatedplanttransformation.Mol.GenGenet，220，245-250.HorschRB，FryJE，HoffmannNL，EichholtzD，RogersSGandFraley，RT(1985).Asimpleandgeneralmethodfortrahsferringgenesintoplant.Science227，1229-1231.BevarM(1984).BinaryAgrobacteriumvectorsforplanttransformation.Nucl.AcidsRes.12.8711-8721.Herrera-EstrellaL，DepickerA，VanMontaguMandSchell，J.(1983).ExpressionofchimaericgenestrarsferredintoplantcellsusingaTiplasmidderivedvector.Nature303，209-213.simon，E.W.(1974).Phospholipidandplantmembranepermeability.NewPhytol.73.377-420.Chen，Z.，Qian，C.，Qin，M.，xu，X.，Xiao，Y.，Lin，M.D.Z.，Wu.S.andHuan，N.(1981b).Recentadvencesinanthercultureofrubbertreeandsugarcane.InAnn.Rep.Inst.GeneticsAcadenieSinica，Beijing，China，p.103.權利要求1.一種產生遺傳上轉化過的三葉橡膠屬植物的方法，包括i)向植物組織插入控制靶蛋白產物表達的啟動子和編碼靶蛋白產物的基因或其片段，和ii)從所說組織再生一種植物，該遺傳上轉化過的植物在其所產生的膠乳中表達靶蛋白產物。2.如權利要求1的方法，其中的植物是Heveabrasiliensis。3.如權利要求1或2的方法，其中啟動子和基因或基因片段的插入是用土壤桿菌屬微生物載體系統完成的。4.如權利要求1或2的方法，其中啟動子和基因或基因片段的插入是用生物排列或粒子槍法完成的。5.如權利要求1的方法，其中的啟動子和/或基因或基因片段對該植物來說是外源性的。6.如權利要求1的方法，其中的啟動子和/或基因或基因片段對該植物來說是自身性的。7.如權利要求1的方法，其包括適當遺傳轉化過的三葉橡膠屬植物的芽接、扦插或其他營養繁殖。8.一種產生蛋白質的方法，包括i)從遺傳上轉化過的含有編碼所述蛋白的基因或基因片段的三葉橡膠屬樹或植物或其克隆收穫膠乳，和ii)從所說的膠乳中回收靶蛋白質。專利摘要一種產生遺傳上轉化過的產汁液植物的方法，包括i)向植物組織插人控制靶產物表達的基因或基因片斷，和ii)從所說組織再生一種植物，該遺傳上轉化過的植物能夠在其所產生的汁液中表達靶產物。本發明也提供了遺傳上轉化過的產汁液植物的克隆，所說植物在其細胞中含有染色體插入物，以便在該植物所產生的汁液中表達靶產物。本發明還描述了一種產生蛋白質或其它靶產物的方法，該方法包括i)從遺傳上轉化的產汁液樹或植物或其克隆收穫汁液，和ii)從所說汁液中回收靶蛋白質或其它產物。文檔編號C12N15/82GKCN1078042SQ93121262公開日2002年1月23日申請日期1993年11月16日發明者P·阿羅加來,K·F·程,W·Y·萬阿部都來哈曼,H·Y·楊,S·A·布菲,H·瓊斯,R·J·斯萊特申請人:馬來西亞橡膠研究所委員會,赫特福德大學導出引文BiBTeX,EndNote,RefMan專利引用(1),非專利引用(1),