一種羰基還原酶突變體及其基因與應用的製作方法
2023-05-23 08:27:01
本發明屬於生物工程技術領域，具體涉及一種天藍色鏈黴菌羰基還原酶ScCR1突變體及其編碼基因，含有所述羰基還原酶突變體基因的重組表達載體和重組表達轉化體，該重組羰基還原酶及其製備方法，以及該羰基還原酶突變體在催化4-氯-3-羰基丁酸乙酯不對稱還原，製備光學純(S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯的應用。
背景技術：
(S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯[Ethyl(S)-(-)-4-chloro-3-hydroxybutyrate,(S)-CHBE]，分子式：C6H11ClO3，分子量：166.60，CAS號為86728-85-0。光學純(S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯[(S)-CHBE]是合成3-羥基-3-甲基戊二醯輔酶(HMG-CoA)還原酶抑制劑的重要醫藥中間體。從藥理作用分析看來，該HMG-CoA還原酶抑制劑是藥物阿託伐他汀的主要活性成分。阿託伐他汀，商品名「立普妥」，是他汀類血脂調節藥物，該藥物主要作用於肝臟，口服後，產生的水解物能夠競爭性抑制HMG-CoA還原酶，促進低密度脂蛋白受體的合成，由於HMG-CoA還原酶是膽固醇合成所需要的關鍵酶，所以會導致膽固醇的合成無法正常進行，最終不僅降低了總膽固醇水平，還降低了血清甘油三酯水平，因此能夠有效防治動脈粥樣硬化和冠心病。目前阿託伐他汀是降膽固醇類藥物的首選。
化學催化手性仲醇合成的方法主要是利用過渡態金屬或硼烷作為催化劑，與手性配體形成配合物後高效催化硼氫化物等氫供體向潛手性羰基基團的不對稱轉移，生成光學活性的手性仲醇。然而該方法操作難度大，反應條件苛刻，且產物中可能會殘留重金屬，因而化學法合成應用受到限制。目前，研究人員已開發多種生物法合成光學活性手性仲醇的方法，包括酶法動力學拆分和酶促不對稱還原法。其中，利用潛手性羰基化合物的不對稱還原合成光學活性手性仲醇的途徑，可實現理論100％的產率，是生產光學活性(S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯的重要方法。生物不對稱還原方法具有綠色高效、選擇性高、反應條件溫和以及操作簡單易於製備等諸多優點，因此近幾年來生物催化羰基不對稱還原合成手性仲醇的方法越來越受到重視。
採用酶法不對稱還原法製備(S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯，一般採用的是羰基還原酶，催化4-氯-3-羰基丁酸乙酯(簡寫為COBE)的不對稱還原。Kita等人用赭色擲孢酵母來源的羰基還原酶AR不對稱還原COBE合成(S)-CHBE，產物的對映體過量值(ee)為93％(J.Mol.Catal.B.Enzym.,1999,6:305-313)，Kataoka等用馬其頓假絲酵母來源的羰基還原酶CmMR不對稱合成(S)-CHBE，其產物的對映體過量值(ee)僅為92％(Enzyme Microb.Technol.,2006,38:944-951)。Ye等人通過對畢赤酵母中基因資料庫挖掘，篩選得到了兩種新型羰基還原酶PsCRI和PsCRII，其催化還原COBE後產物的對映體過量值(ee)均>99％(Appl.Microbiol.Biotechnol.,2011,89:513-522)。何等人用來源於重組大腸桿菌CCZU-Y10的PgCR在鄰苯二甲酸二丁酯-水兩相體系中催化COBE不對稱還原製備(S)-CHBE，底物濃度為1000mM,產物的ee值高於99％，轉化率高達99％(Appl.Biochem.Biotechnol.,2014,173:2042-2053)。
從天藍色鏈黴菌(Streptomyces coelicolor)中克隆得到的羰基還原酶ScCR1能夠催化多種高濃度羰基化合物的高立體選擇性不對稱還原，製備相應的光學手性醇，該酶已經在大腸桿菌(Escherichia coli)中重組過量表達(Bioresour Technol.2011,102:7023-7028)。但該酶對4-氯-3-羰基丁酸乙酯的活力中等，純酶的比活力僅有16U/mg，且該羰基還原酶的熱穩定性也不夠好，(保溫15min後殘餘活力僅有一半時對應的溫度)也只有47.4℃，表徵對底物耐受性的(保溫15min後殘餘活力僅有一半時對應的底物濃度)也僅為34mM。通過定點突變、隨機突變等蛋白質工程的手段對ScCR1進行催化性能(催化活力、穩定性)的改造，提高其催化活力及其反應穩定性，將具有較高的工業應用價值。
技術實現要素：
本發明所要解決的技術問題是：羰基還原酶ScCR1催化還原4-氯-3-羰基丁酸乙酯活力低及反應穩定性差的問題。針對該問題，提供一種催化性能提高的羰基還原酶突變體蛋白質、編碼該突變體蛋白質的核酸序列，含有該核酸序列的重組表達載體和重組表達轉化體，該羰基還原酶突變體的製備方法及其在催化羰基不對稱還原，製備光學純手性醇中的應用。
本發明的目的可以通過以下技術方案來實現：
本發明採取的技術方案之一是：提供一種對4-氯-3-羰基丁酸乙酯催化活性提高，穩定性提高的羰基還原酶ScCR1突變體蛋白質。
對具有如序列表中SEQ ID No.2所示胺基酸序列的蛋白質進行突變，將第158位的異亮氨酸替換為纈氨酸，或者在此基礎上，對第168位的脯氨酸、第60位的丙氨酸分別或同時進行胺基酸殘基的替換，獲得由ScCR1衍生的且羰基還原酶活性提高的突變體蛋白質。
突變體ScCR1I158V所示的胺基酸序列組成的蛋白質是從由ScCR1構建的定點飽和突變庫中篩選得到。在篩選獲得對4-氯-3-羰基丁酸乙酯催化活力有明顯提高的突變體ScCR1I158V的基礎上，繼續對ScCR1I158V進行改造，主要採取隨機突變的手段以進一步強化該酶的催化活力並提高它的穩定性。
優選的，所述羰基還原酶突變體，為野生羰基還原酶ScCR1的胺基酸殘基發生如下任意一種情況的突變所獲得的突變體；
(1)野生型羰基還原酶ScCR1的胺基酸序列中第158位異亮氨酸替換為纈氨酸，命名為ScCR1I158V；
(2)野生型羰基還原酶ScCR1的胺基酸序列中第158位異亮氨酸替換為纈氨酸，且第168位脯氨酸替換為絲氨酸，命名為ScCR1I158V/P168S；
(3)野生型羰基還原酶ScCR1的胺基酸序列中第158位異亮氨酸替換為纈氨酸，且第168位脯氨酸替換為絲氨酸，且第60位丙氨酸替換為蘇氨酸，命名為ScCR1A60T/I158V/P168S。
所述突變體的獲得方法具體為：以來源於天藍色鏈黴菌(Streptomyces coelicolor)中的羰基還原酶野生酶ScCR1基因為模板，利用含有突變點的突變引物(選取需要進行突變的胺基酸位點上下遊各15～20bp的一段鹼基序列，將突變位點的鹼基替換為突變後胺基酸的密碼子，作為PCR正向引物，其反向互補序列即為PCR反向引物)構建定點飽和突變庫，對所得到的突變基因庫進行高通量篩選，得到對4-氯-3-羰基丁酸乙酯催化活力提高的突變體ScCR1I158V(kcat/KM為89s-1mM-1)；以突變體ScCR1I158V基因為模板，利用隨機突變引物進行易錯PCR構建隨機突變庫，對所得到的突變基因庫進行高通量篩選，得到活力提高的且穩定性提高的突變體ScCR1I158V/P168S(kcat/KM為196s-1mM-1,為49.2℃,為122mM)；以突變體ScCR1I158V/P168S基因為模板，利用隨機突變引物進行易錯PCR構建隨機突變庫，對所得到的突變基因庫進行高通量篩選，得到了穩定性顯著提高且催化活力提高的突變體ScCR1A60T/I158V/P168S(kcat/KM為234s-1mM-1,為53.6℃，為162mM)。
其中所述定點突變PCR擴增為本領域常規技術，PCR擴增程序(50μl)為：模板0.5～20ng，5μl 10×KOD plus buffer，5μl dNTP(各2.0mM),2μl MgSO4(25mM),一對突變引物各1μl(20μM)，1個單位的KOD酶(TOYOBO CO.,LTD.,Osaka，Japan)，加滅菌蒸餾水至50μl。
所述定點突變PCR擴增的程序為：(1)95℃變性3min；(2)98℃變性10sec，(3)55℃退火20sec，(4)72℃延伸90sec，步驟(2)～(4)共進行3個循環，(5)98℃變性10sec，(6)54℃退火20sec，(7)72℃延伸90sec，步驟(5)～(7)共進行3個循環，(8)98℃變性10sec，(9)53℃退火20sec，(10)72℃延伸90sec，步驟(8)～(10)共進行3個循環，(11)98℃變性10sec，(12)52℃退火20sec，(13)72℃延伸90sec，步驟(11)～(13)共進行21個循環，最後72℃延伸10min，12℃保藏產物。
其中所述易錯PCR擴增為本領域常規技術，PCR反應的體系(50μl)為：模板0.5～20ng，5μl 10×rTaq buffer，5μl dNTP(各2.0mM)，2μl MgSO4(25mM),5μl MnCl2(100μM)，一對突變引物各1μl(20μM)，1個單位的rTaq酶(TaKaRa，Japan)，1μl DMSO，加滅菌蒸餾水至50μl。
所述易錯PCR擴增的程序為：(1)95℃變性3min；(2)98℃變性10sec，(3)55℃退火20sec，(4)72℃延伸90sec，步驟(2)～(4)共進行3個循環，(5)98℃變性10sec，(6)54℃退火20sec，(7)72℃延伸90sec，步驟(5)～(7)共進行3個循環，(8)98℃變性10sec，(9)53℃退火20sec，(10)72℃延伸90sec，步驟(8)～(10)共進行3個循環，(11)98℃變性10sec，(12)52℃退火20sec，(13)72℃延伸90sec，步驟(11)～(13)共進行21個循環，最後72℃延伸10min，12℃保藏產物。
本發明採取的技術方案之二是：一種分離的核酸，所述核酸是編碼如技術方案之一所述突變體蛋白質的核酸。
本發明所述核酸的製備方法為本領域常規製備方法，所述製備方法較佳地包括：通過基因克隆技術獲得編碼所述羰基還原酶突變體的核酸分子，或者通過人工全序列合成的方法得到編碼所述羰基還原酶突變體的核酸分子。
本發明所述核酸較佳地為具有點突變的核酸分子，所述具有點突變的核酸分子的製備方法為本領域常規的製備方法，所述製備方法較佳地為：以技術方案一獲得的突變體DNA序列為模板，利用兩端引物進行PCR擴增所需目的基因，即得到帶有點突變的核酸分子：ScCR1I158V、ScCR1I158V/P168S和ScCR1A60T/I158V/P168S。
其中所述PCR擴增為本領域常規技術，PCR擴增程序(50μl)為：模板0.5～20ng，5μl 10×KOD plus buffer，5μl dNTP(各2.0mM),2μl MgSO4(25mM),一對突變引物各1μl(20μM)，1個單位的KOD酶(TOYOBO CO.,LTD.,Osaka,Japan)，加滅菌蒸餾水至50μl。
所述易錯PCR擴增的程序為：(1)95℃變性3min；(2)98℃變性10sec，(3)55℃退火20sec，(4)72℃延伸90sec，步驟(2)～(4)共進行3個循環，(5)98℃變性10sec，(6)54℃退火20sec，(7)72℃延伸90sec，步驟(5)～(7)共進行3個循環，(8)98℃變性10sec，(9)53℃退火20sec，(10)72℃延伸90sec，步驟(8)～(10)共進行3個循環，(11)98℃變性10sec，(12)52℃退火20sec，(13)72℃延伸90sec，步驟(11)～(13)共進行21個循環，最後72℃延伸10min，12℃保藏產物。
本發明採取的技術方案之三是：一種包含上述核酸的重組表達載體。
其中所述重組表達載體可通過本領域常規方法獲得，即：將本發明所述的羰基還原酶突變體基因的核酸分子連接於各種表達載體上構建而成。本發明所述載體優選地為質粒pET-28a(+)。較佳地，可通過下述方法製得本發明的重組表達載體：將通過PCR擴增所得的核酸產物與表達載體pET-28a分別用限制性內切酶Nde I和Hind III雙酶切，形成互補的粘性末端，經T4DNA連接酶連接，形成含有本發明的羰基還原酶基因的重組表達質粒pET28a-ScCR1I158V、pET28a-ScCR1I158V/P168S和pET28a-ScCR1A60T/I158V/P168S。
本發明採取的技術方案之四是：一種包含上述重組表達載體的重組表達轉化體。
其中所述重組表達轉化體的製備方法較佳地為：將上述重組表達載體轉化至宿主微生物中製得。其中所述宿主微生物較佳地為：大腸桿菌(E.coli)，更佳的為大腸桿菌BL21(DE3)或大腸桿菌DH5α。將前述重組表達質粒轉化至E.coli BL21(DE3)中，即可得本發明優選的基因工程菌株，即E.coli BL21(DE3)/pET28a-ScCR1I158V、E.coli BL21(DE3)/pET28a-ScCR1I158V/P168S和E.coli BL21(DE3)/pET28a-ScCR1A60T/I158V/P168S。轉化方法可選擇本領域常規方法，如電轉法，熱激法等，較佳地選擇熱激法進行轉化即可，熱激條件較佳的是：42℃，熱激90秒。
本發明採取的技術方案之五是：一種羰基還原酶突變體的製備方法，其中包括如下步驟：培養上述的重組表達轉化體，從培養物中獲得重組羰基還原酶突變體。
其中所述製備方法較佳地為：將上述重組大腸桿菌接種至含有卡那黴素(50μg/ml)的LB培養基(蛋白腖10g/L，酵母膏5g/L，NaCl 10g/L，pH7.0)中，37℃振蕩培養過夜，按1％(v/v)的接種量接入裝有100mL LB培養基的500mL三角瓶中，置於37℃、180rpm搖床振蕩培養，當培養液的吸光密度OD600達到0.8時，加入終濃度為0.1mM的異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)進行誘導，誘導溫度為16℃，誘導24小時後，將培養液離心，收集細胞，並用生理鹽水洗滌兩次，得靜息細胞。將所得的靜息細胞懸浮於10mL緩衝液(pH 8.0)中，在冰水浴中超聲破碎，離心收集上清液，即為重組酶的粗酶液，粗酶液經聚丙烯醯胺凝膠電泳分析，重組蛋白在細胞中以部分可溶的形式存在，另外有部分蛋白存在於細胞碎片中。
本發明中催化潛手性羰基化合物進行不對稱還原反應形成光學活性手性醇的催化劑，可以是上述重組羰基還原酶突變體蛋白，或者是包含重組羰基還原酶突變體的轉化體靜息細胞。
本發明採取的技術方案之六是：上述蛋白質或上述重組大腸桿菌整細胞作為催化劑催化潛手性羰基化合物進行不對稱還原反應，形成手性醇中的應用。
所述的蛋白質優選本發明所述的羰基還原酶突變體或者是重組羰基還原酶突變體。所述的潛手性羰基化合物較佳地是4-氯-3-羰基丁酸乙酯(COBE)，還可以是2,3-二庚酮，1-苯基-1,2-丙二酮或2-甲基-2-庚烯-6-酮。
本發明所述的不對稱還原反應的各項條件可按本領域此類反應的常規條件進行選擇，較佳地，所述的應用包括下述步驟：反應在兩相體系中進行，兩相反應體系為甲苯與水，所述潛手性羰基化合物的濃度為50～200g/L(有機相)，異丙醇的摩爾濃度為底物濃度的1.0～1.5倍，所述羰基還原酶突變體用量為15～65kU/L，額外添加的NAD+的濃度是0～0.1mM，反應水相緩衝液pH為6.0～7.0，反應溫度為25～35℃。
本發明所用試劑和原料均市售可得。
本發明的積極進步效果在於：與野生型羰基還原酶相比，本發明所述羰基還原酶突變體具有更高的催化活性和穩定性，對底物4-氯-3-羰基丁酸乙酯(COBE)的還原活力由野生型的38.8U/mg的比活力提升至最高達260U/mg，並且穩定性也有大幅提高，Tm(蛋白解鏈溫度)由野生型的50.7℃提高到最高達58.1℃，對底物的耐受性也由野生型的34mM提高至最高達162mM。本發明所獲得的多個羰基還原酶突變體特別適用於催化還原COBE製備光學純的立普妥藥物前體化合物(S)-CHBE，具有很好的工業應用前景。
具體實施方式
下面結合具體實施例對本發明進行詳細說明。
實施例1
羰基還原酶ScCR1的定點突變
定點突變採用II Site-Directed Mutagenesis Kit(Stratagene,Catalog#200522)方案進行操作。
首先設計含有突變點的簡併突變引物如下：
5』-ACGTCGCCTCCNNKCTCGGCTCGGTCGGCT-3』，
5』-AGCCGACCGAGCCGAGMNNGGAGGCGACGT-3』。
其中N代表A、T、C、G四種鹼基的混合；K代表G、T兩種鹼基的混合；M代表A、C兩種鹼基的混合。
其中所用的模板為：野生型羰基還原酶重組質粒，包含如SEQ ID No.1所示的基因序列。
PCR擴增程序(50μl)為：模板0.5～20ng，5μl 10×KOD plus buffer，5μl dNTP(各2.0mM)，2μl MgSO4(25mM)，一對突變引物各1μl(20μM)，1個單位的KOD酶(TOYOBO CO.,LTD.,Osaka，Japan)，加滅菌蒸餾水至50μl。
PCR擴增程序：(1)95℃變性3min；(2)98℃變性10sec，(3)55℃退火20sec，(4)72℃延伸90sec，步驟(2)～(4)共進行3個循環，(5)98℃變性10sec，(6)54℃退火20sec，(7)72℃延伸90sec，步驟(5)～(7)共進行3個循環，(8)98℃變性10sec，(9)53℃退火20sec，(10)72℃延伸90sec，步驟(8)～(10)共進行3個循環，(11)98℃變性10sec，(12)52℃退火20sec，(13)72℃延伸90sec，步驟(11)～(13)共進行21個循環，最後72℃延伸10min，12℃保藏產物。
擴增得到的PCR產物在37℃經內切酶Dpn I消化2h後轉化E.coli BL21(DE3)感受態細胞，並均勻塗布含有50μl/mg卡那黴素的LB瓊脂平板。37℃過夜培養後，挑選單克隆96株至深孔板進行培養及誘導表達。根據分光光度計法進行突變庫的活力篩選，得到的活力顯著提高的突變體，送上海美吉生物醫藥科技有限公司進行測序。測序結果用DNAMAN軟體與羰基還原酶ScCR1序列進行比對，158位突變為纈氨酸。得到的突變體命名為ScCR1I158V。
實施例2
羰基還原酶ScCR1的隨機突變
利用易錯PCR技術向羰基還原酶基因引入隨機核苷酸突變，其中所用引物如下：
上遊引物：GGAATTCCATATGACTGTCGAAACCGCCACC
下遊引物：CGCGGATCCCTAGACAGAACAGTAACCACCT
其中模板為：實施例1獲得羰基還原酶突變體質粒pET28a-ScCR1I158V。
PCR反應的體系(50μl)為：模板0.5～20ng，5μl 10×rTaq buffer，5μl dNTP(各2.0mM)，2μl MgSO4(25mM)，5μl MnCl2(100μM)，一對突變引物各1μl(20μM)，1個單位的rTaq酶(TaKaRa，Japan)，1μl DMSO，加滅菌蒸餾水至50μl。
所述易錯PCR擴增的程序為：(1)95℃變性3min；(2)98℃變性10sec，(3)55℃退火20sec，(4)72℃延伸90sec，步驟(2)～(4)共進行3個循環，(5)98℃變性10sec，(6)54℃退火20sec，(7)72℃延伸90sec，步驟(5)～(7)共進行3個循環，(8)98℃變性10sec，(9)53℃退火20sec，(10)72℃延伸90sec，步驟(8)～(10)共進行3個循環，(11)98℃變性10sec，(12)52℃退火20sec，(13)72℃延伸90sec，步驟(11)～(13)共進行21個循環，最後72℃延伸10min，12℃保藏產物。
PCR擴增產物純化之後，用Nde I和Hind III這兩個限制性內切酶分別對易錯PCR擴增產物和載體pET28a於37℃雙酶切12h，兩者的回收產物，用T4連接酶16℃下過夜連接，轉化E.coli BL21(DE3)感受態細胞，並均勻塗布於含有50μl/mg卡那黴素的LB瓊脂平板，37℃過夜培養，構建隨機突變體文庫，並進行篩選。篩選得到一個對COBE催化活力有大幅提高的突變體(對底物COBE的比活力高達168U/mg，而母本只有38.4U/mg)，經DNA測序發現其突變位點為P168S，命名為ScCR1I158V/P168S。
實施例3
隨機突變
利用易錯PCR技術向羰基還原酶基因引入隨機核苷酸突變，其中所用引物如下：
上遊引物：GGAATTCCATATGACTGTCGAAACCGCCACC
下遊引物：CGCGGATCCCTAGACAGAACAGTAACCACCT
其中模板為：實施例2獲得羰基還原酶突變體質粒pET28a-ScCR1I158V/P168S。
PCR反應的體系(50μl)為：模板0.5～20ng，5μl 10×rTaq buffer，5μl dNTP(各2.0mM)，2μl MgSO4(25mM)，5μl MnCl2(100μM)，一對突變引物各1μl(20μM)，1個單位的rTaq酶(TaKaRa，Japan)，1μl DMSO，加滅菌蒸餾水至50μl。
所述易錯PCR擴增的程序為：(1)95℃變性3min；(2)98℃變性10sec，(3)55℃退火20sec，(4)72℃延伸90sec，步驟(2)～(4)共進行3個循環，(5)98℃變性10sec，(6)54℃退火20sec，(7)72℃延伸90sec，步驟(5)～(7)共進行3個循環，(8)98℃變性10sec，(9)53℃退火20sec，(10)72℃延伸90sec，步驟(8)～(10)共進行3個循環，(11)98℃變性10sec，(12)52℃退火20sec，(13)72℃延伸90sec，步驟(11)～(13)共進行21個循環，最後72℃延伸10min，12℃保藏產物。
PCR擴增產物純化之後，用Nde I和Hind III這兩個限制性內切酶分別對易錯PCR擴增產物和載體pET28a於37℃雙酶切12h，兩者的回收產物，用T4連接酶16℃下過夜連接，轉化E.coli BL21(DE3)感受態細胞，並均勻塗布於含有50μl/mg卡那黴素的LB瓊脂平板，37℃過夜培養，構建隨機突變體文庫，並進行篩選。篩選得到一個穩定性有大幅提高的突變體，Tm(蛋白解鏈溫度為58.1℃，而母本的Tm為50.7℃；對底物COBE的耐受性為162mM，而母本的為34mM。經DNA測序發現其突變位點為A60T，命名為ScCR1A60T/I158V/P168S。
實施例4
重組表達載體的構建和重組表達轉化體的製備
將實施例1、2和3中所得的羰基還原酶突變體基因DNA片段在37℃分別用限制性內切酶Nde I和Hind III雙酶切12h，經瓊脂糖凝膠電泳純化，利用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收目標片段。將目標片段在T4DNA連接酶的作用下，與同樣經Nde I和Hind III雙酶切後的質粒pET28a，在4℃連接過夜得到重組表達質粒。
將上述重組表達質粒轉化到E.coli DH5α感受態細胞中，轉化條件為45℃熱激90秒，在含有卡那黴素的抗性平板上對陽性重組進行篩選，挑取單克隆，菌落PCR驗證陽性克隆。培養重組菌，待質粒擴增後提取質粒，重新轉化至E.coli BL21(DE3)感受態細胞中，轉化液塗布到含有卡那黴素的LB平板上，37℃倒置培養過夜，即獲得陽性重組轉化體E.coli BL21(DE3)/pET28a-ScCR1突變體，菌落PCR驗證陽性克隆。
實施例5
羰基還原酶ScCR1突變體的表達、純化和酶活性與穩定性測定
將實施例4中所得羰基還原酶突變體的表達菌株接種於100ml含50μl/mg卡那黴素的LB液體培養基中，37℃200rpm培養至OD600達到0.6～0.8，降溫至16℃並加入終濃度為0.1mM的IPTG，繼續培養20h進行誘導表達。6000×g離心10min收集菌體，並用生理鹽水洗滌兩次，得靜息細胞。將所得的靜息細胞懸浮於pH 6.5的緩衝液中，在冰浴中超聲破碎，離心收集上清液，即為重組羰基還原酶突變體的粗酶液。將粗酶液凍幹，即為凍幹粗酶粉。
用磷酸鈉緩衝液(50mM，pH8.0，含500mM NaCl和5mMβ-巰基乙醇)重懸所得靜息細胞，超聲破碎，30000×g離心45min離心後取上清，即可得到羰基還原酶突變體蛋白的粗酶液。使用Ni親和柱(1ml)純化羰基還原酶突變體蛋白，具體方法如下：
(1)用磷酸鈉緩衝液(50mM，pH8.0，含有500mM NaCl和5mMβ-巰基乙醇)平衡親和Ni柱；
(2)將上述方法所得的羰基還原酶突變體蛋白的粗酶液以1ml/min的流速通過Ni柱，使目的蛋白掛載到Ni柱上；
(3)用含有0～50mM咪唑的磷酸鈉緩衝液(50mM，pH8.0，含有500mM NaCl和5mMβ-巰基乙醇)洗脫與Ni柱沒有結合能力的雜蛋白；
(4)用含有200mM咪唑的磷酸鈉緩衝液(50mM，pH8.0，含有500mM NaCl和5mMβ-巰基乙醇)洗脫目的蛋白；
(5)用磷酸鈉緩衝液(50mM，pH8.0，含有500mM NaCl和5mMβ-巰基乙醇)平衡Ni柱，以備後用。
(6)用垂直電泳儀進行SDS-PAGE檢測收集到的蛋白樣品。取20μl樣品加入5μl 5×SDS上樣緩衝液進行處理，上樣量均為10μl，標準分子量蛋白(Protein Molecular Weight Marker)，購於美國Thermo公司。SDS-PAGE膠濃度為12％，選用110V電壓進行濃縮電泳，再改為200V電壓進行分離電泳。結果表明通過上述方法純化獲得高純度的突變體蛋白，分子量大小在26kDa左右。
通過檢測340nm處吸光值變化的方式進行重組羰基還原酶活力測定。具體方法如下：於1ml反應體系(50mM磷酸鈉緩衝液，pH 6.5)中，加入終濃度為2mM的底物4-氯-3-羰基丁酸乙酯(COBE)，終濃度為0.1mM的NADH，30℃保溫2分鐘後加入適量純酶溶液或細胞破碎後的粗酶液，迅速混勻，檢測340nm處吸光值的變化。酶活力的計算公式為：酶活力(U)＝EW×V×103/(6220×l)；式中，EW為1min內340nm處吸光度的變化值；V為反應液的體積，單位ml；6220為NADH的摩爾消光係數，單位L/(mol·cm)；l為光程距離，單位cm。每單位(U)羰基還原酶的定義為上述條件下，每分鐘催化1μmol NADH氧化所需的酶量。對各突變體進行測活，結果參見表1。
羰基還原酶突變體穩定性表徵：根據文獻(Angew.Chem.Int.Ed.2006,27,7745-7751)測定羰基還原酶的值，用類似方法測定羰基還原酶的值。
表1 ScCR1及其突變體性質
實施例6-8
ScCR1A60T/I158V/P168S催化不同羰基化合物的不對稱還原
於1ml反應體系(50mM磷酸鈉緩衝液，pH 6.5)中，加入終濃度為2mM的底物2,3-二庚酮，1-苯基-1,2-丙二酮和2-甲基-2-庚烯-6-酮，終濃度為0.1mM的NADH，30℃保溫2分鐘後加入適量實施例4獲得的突變體ScCR1A60T/I158V/P168S酶液，迅速混勻，檢測340nm處吸光值的變化。同時參考Bioresour.Technol.2011,102,7023-7028的方法，測定產物的ee值。，結果見表2。
表2 ScCR1A60T/I158V/P168S對不同羰基化合物的活性和立體選擇性
實施例9
ScCR1A60T/I158V/P168S催化4-氯-3-羰基丁酸乙酯的不對稱還原
稱取40mg如實施例5製備的ScCR1A60T/I158V/P168S凍幹粗酶粉溶解於5mL的KPB緩衝液(pH 6.5)，加入5mL含有濃度為200g/L底物COBE的甲苯，1.5倍底物當量的輔底物異丙醇，在磁力攪拌下分別於30℃進行反應，反應時間為2小時。反應結束後用等體積乙酸乙酯進行萃取，萃取兩次，合併萃取液，加無水硫酸鈉乾燥過夜，之後分析測定底物轉化率和還原產物的ee值，分別為99.9％和>99％(S)。而相同條件下，使用野生型酶ScCR1催化反應的底物轉化率僅為70.1％。
實施例10
(S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯的十克級製備
反應在500mL的反應器中進行，稱取1.24g如實施例5製備的ScCR1A60T/I158V/P168S靜息細胞催化劑，其活力約為8.1U/mg靜息細胞，加入150mL KPB緩衝液(50mM,pH6.5)，加入150mL甲苯和30g底物COBE，16.4g異丙醇，終濃度0.1mM的NAD+，在30℃恆溫，200rpm機械攪拌下反應，反應9h後反應轉化率達到99％，使用乙酸乙酯萃取反應得到的產物，加入適量無水硫酸鈉乾燥過夜，旋轉蒸發除去溶劑，得到28.5g產物(S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯，分離得率為95％，光學純度高於99％。
上述對實施例的描述是為了便於該技術領域的普通技術人員能理解和使用發明。熟悉本領域技術的人員可以容易地對這些實施例做出各種修改，並把此說明的一般原理應用到其他實施例中而不必經過創造性的勞動。因此，本發明不限於上述實施例，本領域技術人員根據本發明的揭示，不脫離本發明的範疇所作出的改進和修改都應該在本發明的保護範圍之內。
華東理工大學
一種羰基還原酶突變體及其基因與應用
2
PatentIn version3.3
1
792
DNA
Streptomyces coelicolor
野生型羰基還原酶
1
atgagcacca ccggaaccac ccccgccacc accgggtacg ccgccgagtt cgccggccgt 60
accgccctcg tcaccggtgc cgcctccggt atcggcctgg ccaccgcccg ccggctcggc 120
gccggcggcg cccgggtcgt cgtcgccgac ttcaacgccg agggcgccga gaaggccgcc 180
gccgagctgc gggccggtgg cgtcgaggcc gccgcggtcg agctggacgt cacccgtccg 240
gagtccgtcg aggcggccgt cgggttcgcc gtcgacacgt tcggctcgct ggacctcgcc 300
gtcaacaacg ccggcatcgg cggccccagc gccccgaccg gcgagtacga cgtggcggcc 360
taccagcgcg tcgtgcgcac caacctcgac ggcgtcttct actcgatgcg ctacgaactg 420
cccgccatcg aggcggccgg caagggcggc tcgatcgtga acgtcgcctc catcctcggc 480
tcggtcggct tcgccggctc ccccgcctac gtcgccgcca agcacggcgt ggtcgggctg 540
acgaaggcgg ccgccgccga gtacgccgcc cgcggcatcc ggatcaacgc ggtcggtccg 600
ggcttcatcg acacccccct gctcaagacc atggacgagg ccgcctacaa ggggctggtc 660
gccctgcacc cggccggccg cctcgggcgc tccgaggagg tcgcggagct gatcgccttc 720
ctgctgtccg accgcgcgtc cttcgtcgcg ggcagctatc acctggtcga cggcgcctac 780
accgccgtct ga 792
2
263
PRT
Streptomyces coelicolor
突變型羰基還原酶
2
Met Ser Thr Thr Gly Thr Thr Pro Ala Thr Thr Gly Tyr Ala Ala
5 10 15
Glu Phe Ala Gly Arg Thr Ala Lys Val Thr Gly Ala Ala Ser Gly
20 25 30
Ile Gly Leu Ala Thr Ala Arg Arg Leu Gly Ala Gly Gly Ala Arg
35 40 45
Val Val Val Ala Asp Phe Asn Ala Glu Gly Ala Glu Lys Ala Ala
50 55 60
Ala Glu Leu Arg Ala Gly Gly Val Glu Ala Ala Ala Val Glu Leu
65 70 75
Asp Val Thr Arg Pro Glu Ser Val Glu Ala Ala Val Gly Phe Ala
80 85 90
Val Asp Thr Phe Gly Ser Leu Asp Leu Ala Val Asn Asn Ala Gly
95 100 105
Ile Gly Gly Pro Ser Ala Pro Thr Gly Glu Tyr Asp Val Ala Ala
110 115 120
Tyr Gln Arg Val Val Arg Thr Asn Leu Asp Gly Val Pro Tyr Ser
125 130 135
Met Arg Tyr Glu Leu Pro Ala Ile Glu Ala Ala Gly Lys Gly Gly
140 145 150
Ser Ile Val Asn Val Ala Ser Ile Leu Gly Ser Val Gly Phe Ala
155 160 165
Gly Ser Pro Ala Tyr Val Ala Ala Lys His Gly Val Val Gly Leu
170 175 180
Thr Lys Ala Ala Ala Ala Glu Tyr Ala Ala Arg Gly Ile Arg Ile
185 190 195
Asn Ala Val Gly Pro Gly Phe Ile Asp Thr Pro Leu Leu Lys Thr
200 205 210
Met Asp Glu Ala Ala Tyr Lys Gly Leu Val Ala Leu His Pro Ala
215 220 225
Gly Arg Leu Gly Arg Ser Glu Glu Val Ala Glu Leu Ile Ala Phe
230 235 240
Leu Leu Ser Asp Arg Ala Ser Phe Val Ala Gly Ser Tyr His Leu
245 250 255
Ver Asp Gly Ala Tyr Thr Ala Val
260