一種鄰苯二甲酸二辛酯的酶聯免疫檢測方法
2023-05-23 17:03:16
專利名稱：一種鄰苯二甲酸二辛酯的酶聯免疫檢測方法
技術領域：
本發明涉及一種酞酸酯殘留檢測方法，具體的說是對鄰苯二甲酸二辛酯的 一種酶聯免疫檢測方法，屬於免疫檢測技術領域。
背景技術：
鄰苯二甲酸二辛酯(Dioctylphthalate， DOP)是酞酸酯的一種。酞酸酯作為增 塑劑在塑料的加工生產中尤其是聚氯乙烯(PVC)的加工生產中被廣泛的使用。由 於酞酸酯增塑劑與塑料基質之間沒有形成共價鍵，而是以氫鍵和範德華力連接， 彼此保持各自獨立的化學性質，因而在接觸到包裝食品中所含的水、油脂時， 便會溶出。經過研究發現，酞酸酯是一種環境激素物質，它幹擾生物為保持體 內平衡並調節生長過程的正常激素的產生、釋放、轉移、代謝、反應和消除， 或在未受損的生物後代中引起不良的健康影響和內分泌功能的改變。美國環保 局將六種酞酸酯列入重點控制的汙染物名單中，我國優先汙染物黑名單中包括 鄰苯二甲酸二辛酯。目前，國內外有關鄰苯二甲酸二辛酯的檢測主要採用高效 液相色譜法(HPLC)、氣相色譜法(GC)、氣-質聯用法(GC-MS)、液-質聯用法(LC -MS)等，這些方法雖然靈敏但其需要昂貴的儀器設備，專業的操作人員，對檢 材的要求也比較高，並且需要進一步的樣本前處理才能進行，這已經不能達到 現代檢測對快速、方便、準確的要求。近年來，國內外已經開展了對酞酸酯類 免疫分析方法的研究，但國內外尚沒有針對鄰苯二甲酸二辛酯的酶聯免疫檢測 的報導，為了彌補這一空白，有必要針對鄰苯二甲酸二辛酯建立一種酶聯免疫 檢測方法。
發明內容
本發明的目的在於提供一種快速檢測鄰苯二甲酸二辛酯殘留的免疫學檢測 方法並且有較高的靈敏度和特異性。
本發明的技術方案如下利用胥傳來、徐麗廣、馬偉等(一種鄰苯二甲酸二 辛酯人工抗原的製備方法)合成的免疫原免疫得到多克隆抗體，以鄰苯二甲酸二
辛酯半抗原與OVA的偶聯物作為包被抗原，建立了鄰苯二甲酸二辛酯殘留的間
接競爭酶聯免疫法。
本發明通過以下步驟實現 (1)抗原的包被以鄰苯二甲酸二辛酯半抗原與卵清蛋白OVA的偶聯物作為包被抗原，以
0.05M、 pH 9.6的碳酸鹽緩衝溶液將包被抗原以1:5000 l:8000進行稀釋，作 為包被液，在酶標板的每孔中加入100pL， 4"C孵育過夜，然後用含0.1%明膠 的上述碳酸鹽緩衝液200pL/孔作為封閉液，封閉2h;
(2) 競爭反應
每孔分別加入以標準品稀釋液PBST稀釋的0.01ng/mL、 0.1ng/mL、 0.5ng/mL、 lng/mL、 5ng/mL、 10ng/mL、 20ng/mL系列濃度之一的鄰苯二甲 酸二辛酯標準品或處理好的樣品50pL到各自的酶標孔中，將免疫製備的鄰苯 二甲酸二辛酯多克隆抗體以抗體稀釋液含0.1%明膠、含0.05%吐溫-20、 pH
7.4、 0.01M的磷酸鹽緩衝溶液PBST，按1:6000 1:9000比例稀釋後，加入 酶標板中，每孔加50jiL， 37'C孵育lh後以PBST洗滌液洗滌3 5次；
(3) 加酶標二抗
以抗體稀釋液將辣根過氧化物酶標記的羊抗兔GAR-HRP以1:3000 1:5000 進行稀釋，每孔加100pL， 37t:溫育lh後以PBST洗滌液洗滌3 5次；
(4) 顯色
每孔加入顯色液100jiL， 37'C顯色15min;最後每孔加入終止液2M硫 酸溶液lOO]iL;用酶標儀450nm測吸光值A45，與所作標準曲線對比算出待 測樣品的鄰苯二甲酸二辛酯濃度。
顯色液配方A液0.933 g檸檬酸，3.68gNa2HP04'12H20， 18 |iL30°/。H2O2 用超純水定容至100 mL; B液60mg3,3;5,5^四甲基聯苯胺溶於lOOmL乙二 醇中；使用前將A液與B液以5:1體積比混合。
標準品稀釋液PBST為含0.15mol/LNaCl、含0. 5%吐溫-20的0.01mol/L、 pH7.4 PBST溶液。
更詳細的步驟為
主要溶液配製
1) 配製磷酸鹽0.01M(PBS)緩衝液 Na2HP04.12H20 3.62 g KH2P04 0.2 g NaCl 0.2g KC1 8.0g 加超純水稀釋至1000 mL;
2) 配製碳酸鹽(CBS)緩衝溶液(0.05M) pH9.6 Na2C03 1.59g
NaHC03 2.93g加超純水稀釋至1000 mL;
3) 配製PBST溶液含0.05% Tween-20的PBS溶液。
4) 配製封閉液含0.1%明膠的碳酸鹽緩衝液。
5) 配製抗體稀釋液含0.iy。明膠的PBST溶液。
6) 顯色液
A液0.933 g檸檬酸，3.68gNa2HP(V12H20， 18 |^L30%H2O2用超純水定 容至100 mL;
B液60 mg3,3 5，5Z-四甲基聯苯胺(TMB)溶於100 mL乙二醇中； 使用前將A與B以5:1體積比混合。
7) 終止液2M的H2S04。
間接競爭ELISA實驗方法的步驟如下
預先將鄰苯二甲酸二辛酯的標準品配製成100pg/mL的甲醇溶液作為工作 母液，在4。C保存待用。配製PBST溶液(0.01mol/L， pH7.4， 0.15mol/LNaCl， 0.5%Tween-20)，以此為基礎配製系列反應液，用以稀釋競爭物標準液和抗血清。
a、 包被用設定濃度的包被原包被酶標板，100|iL/ L， 4"C過夜。
b、 洗滌用PBST洗滌酶標板3次，每次3min,200pL/孔，然後甩幹酶標板。
c、 封閉含0.1%明膠的碳酸鹽緩衝液，200nL/孔37。C封閉2h。
d、 洗滌同b。
e、 競爭用PBST將鄰苯二甲酸二辛酯稀釋成O.Ol， 0.1， 0.5， 1， 5， 10， 20ng/mL系列濃度，另設一個PBST空白對照，50pL /孔。然後每孔加入50pL 稀釋8100倍的抗血清，於37。C溫育lh。
f、 洗滌同b。
g、 加酶標二抗(羊抗兔GAR隱HRP， 1:4000 )， lOO(iL /孔，37 C反應lh。
h、 洗滌同b。
i、 顯色加底物TMB100pL/孔,顯色15min。 j、終止:加終止液100pL/孔。
k、測定用酶標儀檢測450nm的吸光值。 本發明的有益效果
本發明建立了鄰苯二甲酸二辛酯的間接ELISA方法，為鄰苯二甲酸二辛酯 殘留檢測提供了一種快速高效的檢測手段，由於採用的是多克隆抗體，費用較 低且穩定性和重複性較好。靈敏度為O.Ol ng/mL，線性範圍為0.1 19ng/mL， 半數抑制量(ICs。)為1.56ng/mL。免疫反應的高特異性和高親和性使ELISA具有極高的選擇性和靈敏性，樣本前處理過程簡單。
圖l鄰苯二甲酸二辛酯的標準抑制曲線。 具體實施方案
以下通過實施例進一步說明本發明。
一、 儀器
TGL - 40B臺式低速離心機，上海安亭科學儀器廠； KFLOW純水機，凱佛隆公司； ZD-9556水平搖床，太倉科教器材廠；
Costar96孔8x12可拆酶標板，上海吉泰生物科技有限公司； MuLdska Mks酶標儀，Thermo Labsystems公司； 可調試移液器，Thermo Labsystems公司；
渦旋混合器，上海滬西儀器分析廠。
二、 試劑
辣根過氧化物酶標記的羊抗兔GAR-HRP，康成生物工程公司； 四甲基聯苯胺(TMB)，華美生物工程公司； 其他試劑均為分析純試劑。
三、 步驟
1.免疫原和包被原的合成
合成免疫原和包被原(鄰苯二甲酸二辛酯半抗原與牛血清白蛋白BSA和卵 清蛋白OVA偶聯物)用重氮化法偶聯，具體步驟如下
① 製備A液取0.023mmol半抗原於25mL燒杯中，加入2mL二甲基甲 醯胺、0.2mL水和0.2mL的lmol/L鹽酸，形成黃色溶液，冷卻至0-5"C。然後 逐步滴加lmol/L亞硝酸鈉溶液，用澱粉碘化鉀試紙監測，直到試紙變藍灰色停 止滴加，低溫下攪拌lh，此液為A液。
② 製備B液稱取150mg的牛血清蛋白(102mg的卵清蛋白)溶於6mL的 pH9.0硼酸鹽緩衝液，低溫保存。此液為B液。
硼酸鹽緩衝液0.2mol/L硼酸硼酸12.37g加水至1000mL， 0.05mol/L硼 砂硼砂19.07g加水至1000mL，將上述兩溶液以體積比2:8的比例混合即為pH 9.0的硼酸鹽緩衝液。
③ 在低溫攪拌下，將A液逐滴地滴加到B液，並用lmol/L的氫氧化鈉溶 液調節pH，使pH保持在9， 4"C條件下，攪拌過夜，即得到人工抗原混合液。
④ 將人工抗原混合液移入透析袋中，用6xlL的去離子水透析4-6天。最後使用凍幹法將透析袋中的液體製成粉末，即得到人工抗原鄰苯二甲酸二辛酯-牛血清蛋白(或包被原鄰苯二甲酸二辛酯-卵清蛋白)。 抗體效價測定步驟
(1) 將包被原用碳酸鹽緩衝液作系列稀釋包被96孔酶標板，100 ^L/孔，
於4'C冰箱過夜。次日取出酶標板回至室溫，每孔注入200 pLPBST溶液，搖 床上振蕩3min，用力甩掉洗滌液，在吸水紙上拍幹，繼續洗滌2次。以下 洗滌方法相同。
(2) 充分洗滌後，用封閉緩衝液封閉酶標板，200pL/孔，於37"C溫育 箱內溫育2h後取出烘乾待用。
(3) 將陽性血清系列稀釋對應加入到酶標板的前7行列，第8行加入陰性 血清，100pL/孔，37。C孵育lh後洗滌、拍幹。
(4) 每孔加入100(iL， 1:4000稀釋的標記的羊抗兔GAR-HRP， 37"孵育 lh後洗滌、拍幹。
(5) 每孔加入100pL顯色液(TMB與底物液比例為1:5),暗處37。C反應 15min，取出後每孔加入100pL終止液(2 mol/L的硫酸)，酶標儀測定吸光值A45。
抗體特異性測定步驟
a、 包被用設定濃度的包被原包被酶標板，100hL/孔，4'C過夜。
b、 洗滌用PBST洗滌酶標板三次，每次3min， 200^iL/孔，甩幹酶標板。
c、 封閉含0.1%明膠的碳酸鹽緩衝液，200pL/孔.37X:封閉2h。
d、 洗滌同b。
e、 競爭用PBST將鄰苯二甲酸二辛酯母液稀釋成O.Ol， 0.1， 0.5， 1， 5， 10， 20ng/mL系列濃度，另設一個PBST空白對照，50pL/孔。然後每孔加入 50pL稀釋4000倍的抗血清，於37。C溫育lh。
f、 洗滌同b。
g、 加酶標二抗(羊抗兔GAR-HRP， 1:4000 ), 100pL / L， 37 C反應lh。
h、 洗滌同b。
i、 顯色加顯色液10(HiL/孔，顯色15min。 j、終止加終止液100nL/孔。
k、測定用酶標儀檢測450nm的吸光值。 試驗結果如下
1、 標準曲線本實驗所獲得的抗體檢測的線性範圍是為0.1 19ng/mL。
2、 靈敏度靈敏度是所得90%最大吸光值所對應的標準品的濃度，WIC9Q 為0.01ng/mL。
權利要求
1、一種鄰苯二甲酸二辛酯的酶聯免疫檢測方法，其特徵在於步驟如下(1)抗原的包被以鄰苯二甲酸二辛酯半抗原與卵清蛋白OVA的偶聯物作為包被抗原，以0.05M、pH9.6的碳酸鹽緩衝溶液將包被抗原以1∶5000～1∶8000進行稀釋，作為包被液，在酶標板的每孔中加入100μL，4℃孵育過夜，然後用含0.1％明膠的上述碳酸鹽緩衝液200μL/孔作為封閉液，封閉2h；(2)競爭反應每孔分別加入以標準品稀釋液PBST稀釋的0.01ng/mL、0.1ng/mL、0.5ng/mL、1ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL系列濃度之一的鄰苯二甲酸二辛酯標準品或處理好的樣品50μL到各自的酶標孔中，將免疫製備的鄰苯二甲酸二辛酯多克隆抗體以抗體稀釋液含0.1％明膠、含0.05％吐溫-20、pH7.4、0.01M的磷酸鹽緩衝溶液PBST，按1∶6000～1∶9000比例稀釋後，加入酶標板中，每孔加50μL，37℃孵育1h後以PBST洗滌液洗滌3～5次；(3)加酶標二抗以抗體稀釋液將辣根過氧化物酶標記的羊抗兔GAR-HRP以1∶3000～1∶5000進行稀釋，每孔加100μL，37℃溫育1h後以PBST洗滌液洗滌3～5次；(4)顯色每孔加入顯色液100μL，37℃顯色15min；最後每孔加入終止液2M硫酸溶液100μL；用酶標儀450nm測吸光值A450，與所作標準曲線對比算出待測樣品的鄰苯二甲酸二辛酯濃度。
2、 根據權利要求l所述的鄰苯二甲酸二辛酯的酶聯免疫檢測方法，其特徵 在於顯色液配方A液0.933 g檸檬酸，3.68 gNa2HP04'12H20， 18 }iL30%H2O2 用超純水定容至lOOmL; B液60mg3，3^,5C四甲基聯苯胺溶於100mL乙二 醇中；使用前將A液與B液以5:1體積比混合。
3、 根據權利要求l所述的鄰苯二甲酸二辛酯的酶聯免疫檢測方法，其特徵 在於標準品稀釋液PBST為含0.15mol/LNaCl、含0. 5%吐溫-20的0.01mol/L、 pH7.4PBST溶液。
全文摘要
一種鄰苯二甲酸二辛酯的酶聯免疫檢測方法，屬於免疫檢測技術領域。本發明利用合成的鄰苯二甲酸二辛酯免疫原免疫得到多克隆抗體，以鄰苯二甲酸二辛酯為標準品，以鄰苯二甲酸二辛酯半抗原與OVA的偶聯物作為包被抗原，建立了鄰苯二甲酸二辛酯的間接競爭酶聯免疫分析方法。本發明建立了鄰苯二甲酸二辛酯的間接競爭ELISA方法，為鄰苯二甲酸二辛酯的殘留檢測提供了一種快速高效的檢測方法，由於採用的是多克隆抗體，費用較低且穩定性和重複性好。靈敏度為0.01ng/mL，線性範圍為0.1-19ng/mL。免疫反應的高特異性和親和性使ELISA具有極高的選擇性和靈敏度。
文檔編號G01N33/543GK101419231SQ20081019534
公開日2009年4月29日 申請日期2008年10月14日 優先權日2008年10月14日
發明者徐麗廣, 李灼坤, 胥傳來, 偉 馬 申請人:江南大學