添加滲透壓保護劑提高丁二酸濃度和生產強度的方法
2023-05-23 12:50:56
專利名稱：添加滲透壓保護劑提高丁二酸濃度和生產強度的方法
技術領域：
本發明屬於有機酸生產技術領域，涉及一種添加滲透壓保護劑提高丁二酸濃度和 生產強度的方法。
背景技術：
丁二酸，俗稱琥珀酸，作為一種常見的天然有機酸，廣泛存在於動植物和微生物 中，許多厭氧微生物以丁二酸作為其能量代謝的主要末端產物。作為一種優秀的C4平臺化 合物，丁二酸可被廣泛用於藥物、精細化工產品以及可生物降解的聚合物前體，如可作為1， 4_ 丁二醇、四氫呋喃、脂肪酸、Y-丁內酯等的中間物，而這些化學製品都具有很大的市場 潛力。利用生物法轉化可再生資源生產丁二酸，成本低，汙染小，環境友好，且在發酵過 程中可吸收大量的CO2用於菌株的代謝，能夠有效減輕溫室效應，這也是丁二酸生產有別於 傳統有機酸生產的一個重要特點。生物法生產丁二酸的主要原料是葡萄糖和木糖等糖類物 質，其來源廣泛且價格低廉(玉米、廢乳清、工業生產廢料等)，可以減少石油、煤等不可再 生資源的消耗，大大緩解現今社會的能源短缺。美國能源部的報告表明，丁二酸的生物生產 法的應用每年將為全世界節約大約1. 034X1016J的能源。另外，生物法製備丁二酸的過程 中，吸收並固定大量的CO2溫室氣體，能夠減少溫室氣體的排放，緩解由溫室效應所導致的 全球氣候變暖的現狀。US5504004、US5573931、US5723322、EP0389103B1 公開了丁二酸生產 菌及其發酵方法，這些生產菌株大多是從瘤胃、狗的口腔等特徵性厭氧環境中篩選出來的， 在發酵過程中存在產物收率較低、副產物較多、丁二酸濃度偏低、生產強度較低的問題，因 此開發高效的丁二酸生產方法是目前丞待解決的問題。在丁二酸生產菌發酵產酸過程中，由於有主要產物丁二酸及其甲酸，乙酸，乳酸等 副產物的產生會降低發酵罐中的PH，為了維持菌體生長的最適pH，在發酵過程中需要用氫 氧化鈉、碳酸鈉、碳酸鎂等鹼來中和產生的酸，隨著在發酵過程中鹼的不斷流入，發酵罐中 金屬離子濃度的不斷升高必然導致滲透壓的升高，過高的滲透壓將影響菌體的生長和產 酸。而滲透壓保護劑比如甜菜鹼、海藻糖、脯氨酸、甘氨酸等滲透壓保護劑能夠很好的緩解 環境中滲透壓過高的問題，因此發酵過程中添加適當的滲透壓保護劑，從而提高了生產強 度。專利文件CN101457243公開了一種提高L-穀氨酸發酵產率的新工藝，發明了在發酵培 養基中添加甜菜鹼、脯氨酸的方法，來有效提高L-穀氨酸發酵產率。目前國內外還未見利 用滲透壓保護劑應用於丁二酸的發酵生產中。
發明內容
本發明所要解決的技術問題是提供一種添加滲透壓保護劑提高厭氧發酵產丁二 酸生產強度的方法，以提高丁二酸的生產強度與濃度。為了解決上述技術問題，本發明的技術方案是，一種添加滲透壓保護劑提高丁二 酸濃度和生產強度的方法，步驟如下
菌種活化菌種在斜面培養基中進行平板劃線後，在37°C厭氧培養箱中活化培養 24h ；種子培養活化培養後的菌種轉接到種子培養基中，37°C培養10 12h後作為種 子液；發酵罐培養將活化好的種子液和滅好的葡萄糖接入發酵罐中，接種量為體積比 3 10%，溫度為35 40°C，始終通入CO2氣體來保持厭氧環境，整個發酵過程中pH控制 在6. 5 7. 0，攪拌速度為100 300rpm，發酵30 48h。其特徵在於，在所述發酵罐培養的培養基中，添加有滲透壓保護劑，所述的滲透壓 保護劑的加入量為lg/L 6g/L。本發明所述的滲透壓保護劑選自甜菜鹼、海藻糖、甘氨酸或脯氨酸等中的一種或 多種。換言之，本發明菌種活化、種子培養與發酵罐培養等步驟，可以採用與傳統方法基 本相同的步驟，其主要區別是在發酵罐培養步驟中加入了滲透壓保護劑。本發明推薦接種量採用體積比7% ；攪拌轉速為200rpm，37°C發酵培養，0)2通氣 量為0. 25vvm。本發明推薦所述的滲透壓保護劑的加入量為1 5g/L ；最佳值為2. 9g/ L0培養基加入了滲透壓保護劑之後，菌體濃度明顯比未添加的高，同時發酵周期得 到較大幅度縮短。其原理是根據微生物厭氧發酵產丁二酸的特性，在發酵體系中添加了適 量的滲透壓保護劑，而這些滲透壓保護劑大都是親水性的物質，它們能夠進入細胞，維持菌 體細胞在高底物、高產物和高金屬離子濃度時的滲透壓，防止菌體因滲透壓過高而失水死 亡。較高的菌體量保證了丁二酸的濃度與生產強度較大幅度的提高，從而降低了丁二酸生 產過程中的能耗，提高了生產效率。本發明所述的厭氧發酵生產丁二酸的微生物為從特徵厭氧環境中篩選出的丁 二酸生產菌株，包括產琥珀酸放線桿菌Actinobacillus succinogenes NJ113(CGMCC NO. 1716)，產琥珀酸放線桿菌 Actinobacillus succinogenes 130Z(ATCC55618)， 重組大腸桿菌Escherichia coli,產琥珀酸厭氧螺菌Anaerobiospirilum succiniciproducens(ATCC 53488)。以上菌種均為本領域早已公開使用，公開銷售的菌種， 公眾能夠通過公開途徑獲得這些菌種。本發明所述的菌種活化步驟中，菌株活化的斜面培養基為pH6. 0 8. 0的能提供 碳源、氮源及無機鹽的固體斜面培養基，培養時將菌體在斜面培養基中平板劃線後，在厭氧 培養箱中培養，培養箱含N2、CO2和H2的混合氣體，溫度為30 40°C，活化培養24 48h， 用於種子培養基接種和菌株保存。本發明所述的種子培養步驟中，種子培養的培養基為pH6. 0 8. 0的能夠提供碳 源、氮源及無機鹽的液體培養基，培養時在IOOmL的血清瓶中加入20 SOmL的種子培養 基，通入CO2氣體lmin，在115 121°C滅菌15 30min，冷卻後接入斜面培養菌株，在溫度 為30 40°C，搖床轉速為100 300rpm的條件下培養10 16h，用於發酵培養基接種。本發明所述的發酵步驟中，發酵培養的培養基為pH6. 0 8. 0的能夠提供碳源、氮 源及無機鹽的液體培養基，並加入滲透壓保護劑，3L發酵罐中裝1. 5L發酵培養基，接種量 為體積比3 10%，溫度為35 40°C，始終通入CO2氣體來保持厭氧環境，整個發酵過程
4中pH控制在6. 5 7. 0，攪拌速度為100 300rpm，發酵30 48h。本發明所述的滲透壓保護劑包括甜菜鹼、海藻糖、甘氨酸、脯氨酸等中的一種或多 種。本發明通過在丁二酸發酵體系中添加了適量的滲透壓保護劑，保護菌體細胞在高 底物、高產物和高金屬離子濃度時的滲透壓，維持菌體活力，實現丁二酸的濃度與生產強度 較大幅度的提高，降低丁二酸生產過程中的能耗，提高了生產效率，具有工業化應用價值。說明書附1為未添加脯氨酸的發酵進程曲線；圖2為添加了脯氨酸之後的發酵進程曲線。
具體實施例方式以下所述實施例對本發明做了詳細說明，但對本發明沒有限制實施例1菌種產琥珀酸放線桿菌Actinobacillussuccinogenes NJ113(CGMCC NO. 1716) 該菌已申請專利並獲得授權，專利授權公告號為Cm00537744C。斜面培養基(g/L)葡萄糖10(分消)，酵母膏 5，NaHCO3 10，NaH2PO4 · 2H20 9. 6， K2HPO4 · 3H20 15. 5，瓊月旨 20，pH 7. 0，121°C 滅菌 15min。種子培養基(g/L)葡萄糖10 (分消)，酵母膏 5，NaHCO3 10，NaH2PO4 · 2H20 9. 6， K2HPO4 · 3H20 15. 5，pH 7. 0，121°C 滅菌 15min。發酵培養基(g/L)葡萄糖60(分消)，酵母膏10，富馬酸二鈉1，KH2P0 3， MgCl2 · 6Η200· 3，CaCl2 0. 3，NaCl 1，脯氨酸 2. 9，pH 7. 0，121°C 滅菌 15min。菌種活化將凍存於_70°C冰箱的菌種融化後在斜面培養基中進行平板劃線後， 在37°C厭氧培養箱中活化培養24h後轉接到種子培養基中，200r/min，37°C培養10 12h 後作為種子液。3L發酵罐培養3L發酵罐培養時裝液量為1.5L，將活化好的種子液和滅好的葡 萄糖接入發酵罐中，接種量為7%，(ν/ν)，攪拌轉速為200rpm，37°C發酵培養，0)2通氣量為 0.25vvm。結果見表1、圖Α、圖B通過添加了 2. 9g/L的脯氨酸之後菌體濃度明顯比未添加 的高，同時發酵周期縮短了 30%。表1未添加脯氨酸與添加脯氨酸結果對比
丁二酸甲酸乙酸發酵周期(g/L)(g/L)(g/L)(h)未添加脯氨酸42.087.659.1233添加了 2.9 g/L脯氨酸41.017.359.2123實施例2本實施例採用與實施例1完全相同的菌種、發酵條件和實驗方法。在3L發酵罐中添加了 2. 9g/L的脯氨酸。結果見表2。經過48h發酵，添加2. 9g/ L的脯氨酸，丁二酸的產量比未添加脯氨酸的增加了 21. 7%。
表2未添加脯氨酸與添加脯氨酸結果對比
發酵周期殘糖丁二酸甲酸乙酸㈨(g/L)(g/L)(g/L)(g/L)未添加脯氨酸481646.238.911.2添加了 2.9g/L脯氨酸48256.749.813.2實施例3本實施例採用與實施例1完全相同的菌種、發酵條件和實驗方法在3L發酵罐中添加了 5. 35g/L的脯氨酸。結果見表3。添加5. 35g/L的甜菜鹼比 未添加甜菜鹼的發酵周期縮短了 18%。表3未添加甜菜鹼與添加甜菜鹼結果對比丁二酸甲酸乙酸發酵時間(g/L)(g/L)(g/L)(h)
未添加甜菜鹼 添加了 5.35g/L甜菜鹼42.08 41.037.65 7.419.12 9.3133 26實施例4本實施例採用與實施例1完全相同的菌種、發酵條件和實驗方法在3L發酵罐中添加了 5. 35g/L的甜菜鹼。結果見表4，通過添加5. 35g/L的甜菜 鹼比未添加甜菜鹼的丁二酸的濃度提高了 11.9%。表4未添加脯氨酸與添加脯氨酸結果對比
發酵時間殘糖丁二酸甲酸乙酸(h)(g/L)(g/L)(g/L)(g/L)未添加甜菜鹼485.546.258.6510.12添加了 5.35 g/L甜菜鹼480.2551.758.4810.32實施例5菌種產琥拍酸厭氧螺菌 Anaerobiospirilum succiniciproducens (ATCC 53488)。斜面培養基(g/L)葡萄糖10 (分消)，酵母膏5，蛋白腖5，NaHCO3 10， Na2HPO4 · 2H2015, KH2PO4 · 3H20 4，瓊月旨 20，pH 7. 0，121°C 滅菌 15min。種子培養基(g/L)葡萄糖10 (分消)，酵母膏5，蛋白腖5，NaHCO3 10， Na2HPO4 · 2H2015, KH2PO4 · 3H20 4，pH 7. 0，121°C 滅菌 15min。發酵培養基(g/L)葡萄糖60(分消)，酵母膏10，蛋白腖10，MnCl2O. 05，FeCl2 0. 05，K2HPO4 2. 0，CaCl2 0. 05，脯氨酸 2. 9，pH 7. 0，121°C 滅菌 15min。菌種活化將凍存於-70°C冰箱的菌種融化後在斜面培養基中進行平板劃線後，
6培養24h後轉接到種子培養基中，200r/min，37°C培養10 12h後作為種子液。3L發酵罐培養3L發酵罐培養時裝液量為1. 5L，將活化好的種子液和滅好的葡 萄糖接入發酵罐中，接種量為7%，(ν/ν)，攪拌轉速為200rpm，37°C發酵培養，0)2通氣量為 0. 25vvm0發酵結果見表5，通過添加了 2. 9g/L脯氨酸之後，在相同初糖濃度下，葡萄糖完全 耗完，發酵周期縮短了 23%。表5未添加脯氨酸與添加脯氨酸結果對比
「00581 發酵時間 il 丁二酸 _(h)(g/L)(g/L)
權利要求
一種添加滲透壓保護劑提高丁二酸濃度和生產強度的方法，其特徵在於，步驟如下菌種活化菌種在斜面培養基中進行平板劃線後，在37 ℃厭氧培養箱中活化培養24 h；種子培養活化培養後的菌種轉接到種子培養基中，37 ℃培養10~12 h後作為種子液；發酵罐培養將活化好的種子液和滅好的葡萄糖接入發酵罐中，接種量為體積比3~10 %，其特徵在於，在所述發酵罐培養的培養基中，添加有滲透壓保護劑，所述的滲透壓保護劑的加入量為1 g/L~6 g/L。
2.根據權利要求1所述的添加滲透壓保護劑提高丁二酸濃度和生產強度的方法，其 特徵在於，所述的厭氧發酵生產丁二酸的微生物選自產琥珀酸放線桿菌Actinobacillus succinogenes NJl 13、產琥珀酸放線桿菌 Jciiflo^ciBiAs succinogenes 130Z、重組大腸 木幹菌 Escherichia cc^i，或產Jl^i白酸厭氧 累菌 Anaerobiospirilum succiniciproducens。
3.根據權利要求1所述的添加滲透壓保護劑提高丁二酸濃度和生產強度的方法，其特 徵在於，所述的滲透壓保護劑選自甜菜鹼、海藻糖、甘氨酸、脯氨酸中的一種或多種。
4.根據權利要求1所述的添加滲透壓保護劑提高丁二酸濃度和生產強度的方法，其特 徵在於，所述的菌種活化步驟中，菌株活化的斜面培養基為PH6. (Γ8. O的能提供碳源、氮源 及無機鹽的固體斜面培養基，培養時將菌體在斜面培養基中平板劃線後，在厭氧培養箱中 培養，培養箱含N2、CO2和H2的混合氣體，溫度為3(T40 rpC,活化培養24、8 h，用於種子培 養基接種和菌株保存。
5.根據權利要求1所述的添加滲透壓保護劑提高丁二酸濃度和生產強度的方法，其特 徵在於，所述的種子培養步驟中，種子培養的培養基為PH6. (Γ8. O的能夠提供碳源、氮源及 無機鹽的液體培養基，培養時在IOOmL的血清瓶中加入2(T80 mL的種子培養基，通入CO2氣 體1 min，在115 121 rpC滅菌15 30 min，冷卻後接入斜面培養菌株，在溫度為30 40 ？ C， 搖床轉速為ΚΚΓ300 rpm的條件下培養l(Tl6 h，用於發酵培養基接種。
6.根據權利要求1所述的添加滲透壓保護劑提高丁二酸濃度和生產強度的方法，其 特徵在於，所述的發酵步驟中，發酵培養的培養基為PH6. (Γ8. O的能夠提供碳源、氮源及無 機鹽的液體培養基，並加入滲透壓保護劑，3 L發酵罐中裝1.5 L發酵培養基，接種量為體 積比7%，溫度為35、0 ？ C，始終通入CO2氣體來保持厭氧環境，整個發酵過程中pH控制在 6. 5 7.0，攪拌速度為100 300 rpm，發酵30 48 h。
7.根據權利要求6所述的添加滲透壓保護劑提高丁二酸濃度和生產強度的方法，其特 徵在於，所述發酵罐培養的條件是攪拌轉速為200 rpm，37°C發酵培養，CO2通氣量為0. 25 vvm0
8.根據權利要求廣7之一所述的添加滲透壓保護劑提高丁二酸濃度和生產強度的方 法，其特徵在於，所述的滲透壓保護劑的加入量為廣5 g/L。
9.根據權利要求8所述的添加滲透壓保護劑提高丁二酸濃度和生產強度的方法，其特 徵在於，所述的滲透壓保護劑的加入量為2. 9 g/L。
全文摘要
添加滲透壓保護劑提高丁二酸濃度和生產強度的方法，步驟是，菌種活化菌種在斜面培養基中進行平板劃線後，在37℃厭氧培養箱中活化培養24h；種子培養活化培養後的菌種轉接到種子培養基中，37℃培養後作為種子液；發酵罐培養將活化好的種子液和滅好的葡萄糖接入發酵罐中，接種量為體積比3~10%，特徵是，在發酵罐培養基中添加有滲透壓保護劑，滲透壓保護劑的加入量為1g/L~6g/L。本發明通過添加滲透壓保護劑，保護菌體細胞在高底物、高產物和高金屬離子濃度時的滲透壓，維持菌體活力，實現丁二酸的濃度與生產強度較大幅度的提高，降低丁二酸生產過程中的能耗，提高了生產效率，具有工業化應用價值。
文檔編號C12R1/19GK101955978SQ20101026807
公開日2011年1月26日 申請日期2010年8月31日 優先權日2010年8月31日
發明者奚永蘭, 姜岷, 張敏, 方曉江, 李建, 歐陽平凱, 鄭曉宇, 韋萍 申請人:南京工業大學