高效內切葡聚糖酶RuCelB,其編碼基因、製備方法與應用的製作方法
2023-05-23 12:40:01 3
專利名稱：高效內切葡聚糖酶RuCelB,其編碼基因、製備方法與應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於生物工程領域，涉及一種內切葡聚糖酶及其製備方法和應用。本發明 還涉及了該內切葡聚糖酶的重組質粒和重組基因工程菌株。
背景技術：
纖維素是地球上分布最廣，含量最豐富的可再生性碳源化合物。但在植物細胞壁 中，纖維素分子聚集成的微纖維，包埋在半纖維素和木質素裡，形成網狀結構，造成纖維素 不容易降解，從而難以被充分轉化利用。纖維素分子的水解，至少需要三種纖維素酶的共同 作用，分別為內切型葡聚糖酶(即內切纖維素酶)、外切型葡聚糖酶(又稱為外切纖維素酶， 纖維二糖水解酶)和葡萄糖苷酶。內切型葡聚糖酶能在纖維素分子的無定型區隨機切 斷β -1. 4-糖苷鍵，產生大量的小分子纖維素，然後由外切型葡聚糖酶從這些小分子纖維 素的末端上兩個兩個的切下纖維二糖，最後，由β -葡萄糖苷酶將纖維二糖水解為葡萄糖。 因此內切型葡聚糖酶承擔著為外切型纖維素酶提供開放末端的任務，是纖維素降解過程的 第一步，在纖維素降解中具有極其重要的地位。已經得到的內切纖維素酶為數眾多，主要來源於細菌和真菌，也有少數來源於原 生動物和高等動物，其中真菌來源，尤其是絲狀真菌來源的內切纖維素酶活性較高，通過固 態發酵等方式，已經大規模用於工業生產，粗酶主要用於飼料添加劑行業。細菌來源的內 切纖維素酶活性較低，但由於他們一般的最適PH在中性至鹼性環境中，主要用於紡織洗滌 工業中。但總體而言，內切纖維素酶的酶活是比較低的，最高活性的內切纖維素酶也只有 428U/mg，遠遠低於其他生物多聚物水解酶(比如木聚糖酶)的活性，因此成了木質纖維素 降解過程中的限制酶。由於內切纖維素酶在生產生物能源過程中的重要作用，各種新型內切纖維素酶 不斷被探索出來，如S. Voget等報導了從土壤來源的內切葡聚糖酶Cel5A(Journal of Biotehnology,126 =26-36,2006) ；Soo-Jin Kim等報導了從土壤來源的內切葡聚糖酶 CelM2 (FEMS Microbiol Lett, 282 =44-51,2008) ；Yi Feng 等報導了從家兔盲腸中來源的 內切葡聚糖酶 Cel5G(Appl MicrobiolBiotechnol, 75 :319-328, 2007) ；Hao Pang 等報導了 從堆肥來源的內切葡聚糖酶Cel9B等等。雖然內切纖維素酶在降解纖維素方面非常重要， 但它的酶活相對於它所承擔的作用來說往往是比較低的，而且普遍使用可溶性底物來篩選 和評價酶活，但是使用可溶性底物測的比活數據並不能真正代表在水解木質纖維素時的活 性，因為真正對不溶性底物，尤其是結晶態的不溶性底物有活性的內切纖維素酶比較少，而 且對不溶性底物的酶活即便有也往往是非常低的，這種克隆策略和實際應用需求的矛盾造 成了大部分的內切纖維素酶鮮有實際應用價值。
發明內容
本發明的第一個目的是提供一種新型的高效的內切葡聚糖酶RuCelB及其編碼基 因。
本發明的第二個目的是提供一種製備這種新型高效內切葡聚糖酶RuCelB的方法。本發明的第三個目的是提供這種新型高效內切葡聚糖酶RuCelB在纖維素降解中 的應用。本發明提供了一種具有內切葡聚糖酶活性的多肽，該多肽含有SEQ ID NO. 2的第 25-336位的胺基酸殘基序列。簡稱為RuCelB。例如，該多肽序列如SEQ ID NO. 2所示。SEQ ID NO. 2中，1- 位為信號肽，25-336位為有活性的內切葡聚糖酶RuCelB氨 基酸，第35-310位胺基酸殘基為纖維素酶超家族的結構域。相應的，內切葡聚糖酶RuCelB其核苷酸編碼序列可以含有SEQ ID NO. 1中第 72-1008位的DNA序列所示。也可以是SEQ ID NO. 1所示的序列。本發明所提供的內切葡聚糖酶RuCelB，來源於犛牛瘤胃未培養微生物，其胺基酸 殘基序列包括1)序列表中的SEQ ID N0. 2的氨基端的第1_336或25_336位胺基酸殘基序列； 其中，1-24位為信號肽，25-336位為有活性的內切葡聚糖酶RuCelB胺基酸，第35-310位氨 基酸殘基為纖維素酶超家族的結構域。2)將序列表中的SEQ ID N0. 2的氨基端的第1_336或第25_336位胺基酸殘基序 列經過一個或若干個胺基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有內切葡聚糖酶活性的 蛋白質。3)與序列表中的SEQ ID N0. 2的胺基酸序列的同源性達到90%及以上且具有內 切葡聚糖酶活性的蛋白質。本發明還提供了內切葡聚糖酶RuCelB的編碼基因(RuCelB)，該核苷酸序列包括1)序列表中SEQ ID NO. 1的第1-1008或73-1008位DNA序列，分別對應於氨基端 的第1-336或25-336位胺基酸殘基序列；2)編碼序列表中SEQID N0. 2蛋白質序列的多核苷酸序列。由於保守性變異也能夠具備本發明所述的內切葡聚糖酶活性，因此與內切葡聚糖 酶胺基酸序列相比，被性質相似或相近的、多至10個胺基酸殘基替換而形成多肽也具有相 同功能。本發明也包括這些保守性變異多肽的核苷酸編碼序列。內切型葡聚糖酶，能在纖維素分子的無定型區隨機切斷β -1. 4-糖苷鍵，產生大 量的小分子纖維素，然後由外切型葡聚糖酶從這些小分子纖維素的末端上兩個兩個的切下 纖維二糖，最後，由葡萄糖苷酶將纖維二糖水解為葡萄糖。本發明還提供了內切葡聚糖酶RuCelB的製備方法，可以按照SEQ ID Ν0. 2的第 25-336位的胺基酸殘基序列人工合成。也可以，取青海犛牛的瘤胃內容物，構建瘤胃未培養細菌宏基因組文庫；篩選能夠 水解羧甲基纖維素鈉的陽性克隆；進一步通過構建亞克隆、測序、同源比對的方法獲得內切 葡聚糖酶RuCelB的全長cds序列；將內切葡聚糖酶編碼基因克隆入重組表達載體，導入宿 主細胞，獲得重組表達的內切葡聚糖酶。本發明還提供了內切葡聚糖酶RuCelB的重組質粒，即把內切葡聚糖酶RuCelB的 核苷酸編碼基因序列克隆入大腸桿菌表達載體、酵母表達載體、枯草桿菌表達載體、乳酸菌表達載體、絲狀真菌表達載體、昆蟲表達載體或者哺乳動物細胞表達載體所得的重組質粒。所述的重組表達載體可以是大腸桿菌表達載體、酵母表達載體、枯草桿菌表達載 體、乳酸菌表達載體、絲狀真菌表達載體、昆蟲表達載體或者哺乳動物細胞表達載體等。所述的宿主細胞可以是大腸桿菌(如hcherichia coliBL21、E. coli JM109、 Ε. coli DH5 α 等)、酵母菌(如 Saccharomyces cere visiae、Pichia pas toris、 Kluyveromyces lactis 等)、枯草桿菌(如 Bacillus subtilis R25、Bacillussubtilis 9920 等)、乳酸菌(如 Lactic acid bacteria COCClO 1 等)，絲狀真菌(如 Trichoderma viride, Trichoderma reesei, Aspergillus niger 等)、昆蟲細胞(如 Bombyx mori,如 tharaea eucalypti)，哺乳動物細胞(如 CHO, CHL 等)等。CHO是指Chinese hamster ovary cell，中國倉鼠卵巢細胞。CHL是中國倉鼠肺細 胞。本發明的RuCelB來源於中國犛牛瘤胃微生物，通過對瘤胃宏基因組cosmid文庫 的活性篩選，獲得能夠水解羧甲基纖維素鈉(CMC)的陽性克隆，進一步通過構建亞克隆、測 序、同源比對的方法獲得內切葡聚糖酶RuCelB的全長cds序列，該基因編碼區長lOllbp， 編碼了 336個胺基酸，分子量38. 4kD，屬於纖維素酶超家族。在大腸桿菌中重組表達獲得 內切葡聚糖酶RuCelR，經酶學特性分析發現該酶的最適反應溫度60°C，最適反應pH6. 5，以 羧甲基纖維素鈉為底物的比活高達158.8U/mg。RuCelB對β _1，4吡喃葡萄糖苷鍵具較專 一的高活性，能水解CMCkarboxylmethylcellulose)，4_甲基傘形酮β -D-1,4-葡萄糖苷 (Mu-G2)，Whatman NO. Ifilter paper，但是不能水解 β-(1，3)，β _(1，6)糖苷鍵。本發明的內切葡聚糖酶RuCelB可廣泛應用於纖維素的降解。例如，用於三糖底物 MU-纖維二糖的降解。本發明的內切葡聚糖酶RuCelB在製備生物燃料、飼料添加劑等多方 面有廣泛的應用。本發明提供了一種新型的高效的內切葡聚糖酶RuCelB。從BRENDA資料庫上可以 看到，內切纖維素酶的酶活大部分是幾十個單位/mg，而根據BRENDA上已登記的酶活數據 排序，本發明的RuCelB的酶活(158.8U/mg)排在第八位，屬於相當高活性的內切纖維素酶 了，而且該酶能夠對濾紙也有降解能力，同時又具有較好的熱穩定性，具有良好的工業應用 的價值。本發明的內切葡聚糖酶RuCelB可廣泛應用於纖維素的降解，包括纖維素生物轉 化、化工、紡織、食品、生物能源、飼料添加、醫藥工業方面應用等領域。
圖1 重組內切葡聚糖酶RuCelB表達、純化的蛋白SDS-PAGE電泳圖。各泳道 加入的樣品分別是泳道1 :150mmol的咪唑洗脫收集液，上樣量lul，泳道2 同泳道1， 上樣量;3ul，泳道3 :BL21(DE3)/pET2Ia-RuCelB重組菌破壁後上清；泳道4 :BL21(DE3)/ PET21a-RuCelB重組菌破碎後上清經鎳柱純化的流出液；M 蛋白marker，條帶自上至下大 小為 116kD，66. 2kD，45kD，35kD，25kD，18. 4kD, 14. 4kD。圖2 :內切葡聚糖酶RuCelB的最適反應溫度曲線。圖3 內切葡聚糖酶RuCelB的最適反應pH值曲線。圖4 內切葡聚糖酶RuCelB的耐溫性曲線。「50」、「55」和「60」分別表示50、55、 60這三種溫度(攝氏度)。從圖中可以看到，在50°C，55°C溫浴Ih後酶活基本不變，在60°C中開始緩慢喪失活性。圖5 內切葡聚糖酶RuCelB的圓二色曲線。其中，ellipticity是橢圓率，boltzm arm fit指伯爾茲曼擬合。圖6 內切葡聚糖酶RuCelB降解纖維二糖及MU-纖維二糖的TLC分析圖。其中， 11 葡萄糖；12 纖維二糖；13 纖維二糖+RuCelB ；14 :MU_纖維二糖；15 =MU-纖維二糖 +RuCelB0
具體實施例方式實施例1中國犛牛瘤胃微生物宏基因組DNA文庫的構建於西寧市的一個屠宰場採集2頭中國青海犛牛的瘤胃內容物，使用3層紗布過 濾，濾液經離心收集瘤胃微生物菌體，凍存於_80°C待用。取100-200ul菌體樣品，Iml PBS 洗 2 3 次，加入 650uL DNA 抽提緩衝液(Tris-HCl, IOOmM pH8. 0 ；Na2EDTA IOOmM pH8. 0 ； Na3PO4 Buffer IOOmM pH8. 0 ；NaCl 1. 5M ；CTAB 1 % ;ρΗ8· 0)，混勻後，置 _80°C 中，然後放 置在65°C水浴中融化，重複三次；冷卻後加入3-4yL溶菌酶(100mg/L)於搖床中水平振 蕩(37 °C，225rpm)約30min ；加入2-3 μ L蛋白酶K(20mg/mL)後繼續振蕩約30min ；加入 50-70uL SDS (20% )，混勻後，65°C保溫l_2h，每隔10 20min上下顛倒離心管混勻；12， OOOrpm室溫離心lOmin，收集上清液，加入400-500ul的酚氯仿異戊醇05 24 1) 抽提兩次；氯仿異戊醇04 1)抽提一次後加入0.6倍體積的異丙醇，室溫放置 15-20min 後，12000rpm 離心 15min ；沉澱用 70% 乙醇漂洗，乾燥後用 60-100 μ L TE (ρΗ8. 0) 溶解，加入1 μ LRNAase去除RNA。抽提的瘤胃宏基因組大小在30 401Λ左右，符合構建宏 基因組cosmid文庫要求。構建瘤胃未培養細菌宏基因組文庫的方法參照Epicentre公司pTOB: TNCCosmid Cloning Kit試劑盒產品說明書。抽提的宏基因組DNA經End-ItepairEnzyme Mix末端補 平，和試劑盒中的去磷酸化載體pWEB: :TNC連接，連接產物用MaxPlax Lambda Packaging Extracts包裝後、侵染宿主菌Ε. coli EP 1100，侵染產物塗平板，37°C培養12 IMi長出 菌落，即為該批樣品的宏基因組文庫。內切葡聚糖酶的活性篩選採用CMC平板+剛果紅染色的方法。將宏基因組文 庫在96孔板中擴增培養後，凍融法破細胞，點樣於CMC平板上，37°C反應60分鐘後加 入剛果紅染色15min，用IM NaCl脫色，能產生透明圈的即為具有內切葡聚糖酶活性的 陽性克隆。含有RuCelB基因的cosmid克隆6C6即是以此法在該文庫中篩到的。實施例2瘤胃微生物來源的RuCelB基因的克隆及其序列分析採用亞克隆的方法將6C6上的內切葡聚糖酶基因克隆至pGEMllz載體上將篩選 到的陽性克隆6C6的cosmid質粒用Sau3A I部分酶切為2-51Λ片段，連接入經BamHI酶切 並去磷的pGEMllz載體中，轉化DH5 α，以實施例1中描述的方法對亞克隆文庫進行功能篩 選，得到的亞克隆以Τ7和SP6通用引物測序，通過同源比對確定該內切葡聚糖酶基因的編 碼區序列，其基因核苷酸序列如SEQIDN0 1所示，並命名為RuCel IB。該基因cds編碼336個胺基酸，ORF序列如SEQ ID NO 2所示，理論分子量為 38. 4kD。用SMART分析結構域，顯示N端開始M個胺基酸是信號肽序列，第35-310位氨基 酸為纖維素酶超家族功能域。通過NCBI的blastp分析，RuCelB與水牛宏基因組來源的內切纖維素酶同源性最高，胺基酸序列一致性(identity)為83%。實施例3RuCelB基因在大腸桿菌中的重組表達為了將RuCelB基因序列克隆入大腸桿菌表達載體pET_21a進行重組表達，設計 了一對引物其中正向引物加入了 6個His密碼子，跳過信號肽，從蛋白的25位開始擴增， 序列為 RuCelBF :ATAGAATTCCATCATCACCATCATCACGGCAACGGCTGGGTC,反向引物為 RuCelBR TGTAAGCTTACCCGCCT GTCCCTG，下劃線標註的是限制性內酶序列。通過PCR反應擴增出 RuCelB基因片段，經過膠回收後用EcoR I和Hind III雙酶切，回收片段後，與同樣是EcoR I和HindIII雙酶切的pET-21a載體連接，連接產物轉化大腸桿菌ToplO菌株，得到的轉化 子利用上述引物進行煮菌PCR鑑定，將含有11Λ擴增片段的轉化子檢測酶活和測序鑑定，將 正確的轉化子命名為I^oplO/pETZla-RuCelB。隨後提取該轉化子的質粒，轉化大腸桿菌表達 菌株E. coli BL21(DE3)進行重組表達。該重組表達的思路也同樣適用於其他各種通用表達載體和表達菌株。可以 是大腸桿菌(如 Escherichia coliBL2U Ε. coli JM109、Ε· coli DH5 α 等)、酵母菌 (如 Saccharomyces cerevisiae、Pichia pastoris、Kluyveromyceslactis 等)、枯草 桿菌(如 Bacillus subtilis R25、Bacillus subtilis 9920 等)、乳酸菌(如 Lactic acidbacteriaCOCClOl 等)，絲狀真菌(如 Trichodermaviride, Trichoderma reesei, Aspergillus niger 等)、昆蟲細胞(如 Bombyxmori，Antharaea eucalypti)，喃乳動物細 胞(如CHO，CHL等)等。表達後的蛋白經破壁後，使用Ni-NTA柱進行純化，純化的蛋白SDS-PAGE電泳圖如 圖1所示。實施例4RuCelB的酶學活性分析以CMC為底物測定該酶的活性，以每分鐘催化CMC生成Iumol還原糖定義為一個 酶活單位⑶。為測定RuCelB酶的最適反應條件，以CMC為底物，在不同溫度-80°C ) 下檢測其相對活性，結果顯示RuCelB的最適反應溫度為60°C (如圖2)。在最適溫度下，測 定最適pH，所用的緩衝液範圍為pH3. 5-6. 5用50mmol檸檬酸緩衝液，pH6. 0-8. O用50mmol 磷酸鈉緩衝液，pH8. 0-9. O用50mMTris · HCl緩衝液，結果顯示RuCelB的最適反應pH為 6.5(如圖 3)。為測定RuCelB的比活，在最適溫度和最適pH下檢測酶活，結果表明重組RuCelB 對CMC的比活為158. 8U/mg蛋白。為檢測RuCelB的底物特異性，還使用了下列的底物barley glucan ( β > 3/4 糖苷鍵)，Laminarin(β-1- > 3/6 糖苷鍵)，Avicel，xylan, Whatman NO. Ifilter paper, 螢光底物4-甲基傘形酮β -D-I，4-纖維二糖糖(Mu-G》，pNPG，分析RuCelB對這些底物的 水解能力。結果顯示，RuCelB能使濾紙水解出還原糖，能使Mu-G2顯示螢光，但是不能水解 barley glucan, Avicel, Laminarin, xylan 和 pNPG，這說明 RuCelB 對 β_1，4 吡喃葡萄糖 苷鍵具較專一的高活性，但還是不能水解結晶狀態的纖維素，對β_(1，3)，β-(1，6)糖苷 鍵則完全沒有活性。實施例5RuCelB的耐熱性分析將純化的RuCelB稀釋於最適pH的緩衝液中，分別置於50°C，55°C，60°C，分別保 溫10、20、30、40、50、60min，以置於4°C不溫育的稀釋酶液為對照(100% )酶活，測試殘餘活性，結果如圖4所示，在50°C，55°C溫浴Ih後酶活基本不變，在60°C中開始緩慢喪失活性。 同時，用圓二色儀測定RuCelB在35°C -90°C的CD值，選取220nm處的OD值處理數據，所得 圖形如圖5所示，計算得它的Tm值為60°C。實施例6金屬離子對RuCelB活性的影響在pH6. 5，60°C條件下，測定二價金屬陽離對RuCelB水解CMC的影響。反應體系 為300uL 1% CMC,5mmol或IOmmol的金屬離子，IuL的酶液，60°C反應5分鐘後加入1倍 體積的DNS煮沸，570nm分光光度法測定還原糖生成量，結果如表1所示，對照為不加任何二 價金屬陽離子時RuCelB的活性，將其定為100%，在添加金屬離子後RuCelB的活性，以相對 活性表示。結果顯示金屬離子對RuCelB均有不同程度的抑制效應。表一金屬離子對RuCelB活性的影響
權利要求
1.一種具有內切葡聚糖酶活性的多肽，其特徵在於，該多肽含有SEQ IDN0.2的第 25-336位的胺基酸殘基序列。
2.如權利要求1所述的多肽，其特徵在於，該多肽序列如SEQIDNO. 2所示。
3.如權利要求1所述的多肽的編碼基因，其特徵在於，其核苷酸編碼序列含有SEQID NO. 1中第72-1008位的DNA序列。
4.如權利要求3所述的編碼基因，其特徵在於，其核苷酸編碼序列如SEQID NO. 1所7J\ ο
5.權利要求1所述的多肽的製備方法，其特徵在於，按照SEQID NO. 2的第25-336位 的胺基酸殘基序列人工合成所述的多肽。
6.權利要求1所述的多肽的製備方法，其特徵在於，取犛牛的瘤胃內容物，構建瘤胃未 培養細菌宏基因組文庫；篩選能夠水解羧甲基纖維素鈉的陽性克隆；通過構建亞克隆、同 源對比方法獲得內切葡聚糖酶編碼基因；將內切葡聚糖酶編碼基因克隆入重組表達載體， 導入宿主細胞，獲得重組表達的內切葡聚糖酶。
7.如權利要求6所述的製備方法，其特徵在於，所述的重組表達載體是大腸桿菌表達 載體、酵母表達載體、枯草桿菌表達載體、乳酸菌表達載體、絲狀真菌表達載體、昆蟲表達載 體或者哺乳動物細胞表達載體中的任意一種。
8.如權利要求6所述的製備方法，其特徵在於，所述的宿主細胞是Escherichia coliBL21> Ε. coli JM109、Ε· coli DH5 α、Saccharomycescerevisiae、Pichia pastoris、 Kluyveromyces lactis、Bacillus subtilisR25、Bacillus subtilis 9920、Lac tic acid bac teria COCC 101> Trichodermaviride, Trichoderma reesei> Aspergillus niger> Bombyx mori>An tharaeaeuciilypti、CHO CHL 巾白勺禾中。
9.權利要求1所述的多肽的應用，其特徵在於，將其用於纖維素降解。
10.權利要求1所述的多肽的應用，其特徵在於，將其用於三糖底物MU-纖維二糖的降解。
全文摘要
本發明屬於生物工程領域，涉及一種新型內切葡聚糖酶RuCelB、其編碼基因、製備方法與應用。RuCelB含有SEQ ID NO.2的第25-336位的胺基酸殘基序列。通過對犛牛瘤胃微生物宏基因組cosmid文庫的活性篩選，獲得能夠水解羧甲基纖維素鈉的陽性克隆，進一步通過構建亞克隆、測序、同源比對的方法獲得RuCelB的全長cds序列；重組表達獲得RuCelB。RuCelB以羧甲基纖維素鈉為底物的比活高達158.8U/mg，對濾紙、纖維三糖等底物也具有降解能力。本發明的RuCelB可廣泛應用於纖維素的降解，包括纖維素生物轉化、化工、紡織、食品、生物能源、飼料添加、醫藥工業方面應用等領域。
文檔編號C12R1/865GK102041252SQ20091019770
公開日2011年5月4日 申請日期2009年10月26日 優先權日2009年10月26日
發明者包蕾, 呂紅, 周峻崗, 袁漢英 申請人:復旦大學