一種氧化鈰納米顆粒的製備方法以及其抗氧化應用的製作方法

2023-05-23 23:27:01 1

專利名稱：一種氧化鈰納米顆粒的製備方法以及其抗氧化應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及生物納米材料。具體的說是氧化鈰納米顆粒的製備方法及其抗氧化應用。
背景技術：
活性氧是指生物體內化學性質活潑、氧化能力很強的一類含氧的高反應活性分子，包括超氧陰離子自由基，羥基自由基，過氧化氫等。外界環境中的諸多因素，如日光曝曬，紫外線，電磁輻射，環境汙染，藥物濫用，吸菸酗酒以及精神壓力過大等都會引起活性氧產生。適量的活性氧是維持生命健康所必需的，然而一旦活性氧過量，將會引起脂質過氧化，蛋白質損傷，DNA鏈的斷裂，並造成老化或與老化相關的退行性疾病如癌症、心血管疾病、白內障、關節炎及巴金森氏症等，從而嚴重威脅機體的健康。近年來，許多的研究正致力於從自然界豐富的動物、植物中尋找具有強的抗氧化活性的天然成分，並且已發現廣泛存在於各種蔬菜、水果、茶或紅酒中的多酚及類黃酮可作為抗氧化劑，有效終止自由基鏈鎖反應。然而，這些天然成分的抗氧化作用與各種抗氧化酶相比，存在易消耗，無法再生並循環使用等缺點。當今世界，飛速發展的納米技術為新型抗氧化劑的研發提供了嶄新的思路。到目前為止，包括納米鉬，納米硒，納米氧化鈰等在內的諸多納米顆粒均已經被證實具有自由基清除活性。然而納米材料本身普遍存在的一個問題——生物安全性卻不容忽視。鐵蛋白(ferritin)是生物體中普遍存在的一種天然的含鐵的球形蛋白，該蛋白是由球形蛋白外殼以及殼內的鐵的氧化物納米顆粒這兩部分組成的。球形蛋白外殼由24 個亞基組成，其外徑為12nm，殼內的球形空腔的直徑為8nm。球形蛋白外殼上含有8個親水通道和6個疏水通道，這些通道可以允許外界環境中小的離子或者分子進入球形空腔內部。去掉了殼內鐵核的鐵蛋白簡稱為空腔鐵蛋白(apoferritin)，空腔鐵蛋白所具有的Snm 的球形空腔結構，作為一種天然的、優越的納米顆粒合成模板，已經被廣泛用於Pd，Ag，Ni， Co, CdS及等小粒徑納米顆粒的製備。

發明內容
本發提供了一種氧化鈰納米顆粒的製備方法，其具體步驟包括向鈰鹽與醋酸鈉的水溶液中加入冰醋酸，並攪拌混勻。這之後將該混合液水熱處理5 60h。最後將所得黃色沉澱離心、洗滌並乾燥，製得氧化鈰納米顆粒。上述步驟中，優選的條件為將2. 74 5. 48g (NH4) 2Ce (NO3) 6以及10 20g CH3COONa溶於50 IOOml去離子水中，然後向該溶液中加入10 50ml冰醋酸，並在室溫下攪拌1 證。這之後將該混合液轉移至聚四氟乙烯內襯中，用不鏽鋼水熱釜密封后，置於 200 300°C烘箱中加熱8 Mh。最後將所得黃色沉澱離心(1000 lOOOOg，10 120min) 並用去離子水及乙醇多次清洗，隨後在60°C烘箱中乾燥過夜，製得氧化鈰納米顆粒。本發明還提供一種生物相容性納米抗氧化劑的製備方法，其特徵在於，將製得的氧化鈰納米顆粒與apoferritin溶液混合，然後加酸緩慢調節溶液的pH至1. 5 3. 5，以使 apoferritin的亞基解離。這之後再向該溶液中緩慢滴加鹼溶液，以使溶液的pH值緩慢上升至7. 0 9. 0。經分離純化後最終得到apoferritin包裹的氧化鈰納米顆粒(以下簡稱 AFt-CeO2)。將氧化鈰納米顆粒與apoferritin溶液混合，其中，蛋白與鈰的摩爾濃度之比為 1 100 1 10000。然後加酸緩慢調節溶液的PH至1. 5 3. 5，並在該pH下持續攪拌 10 120min。這之後再向該溶液中緩慢滴加鹼溶液，以使溶液的pH值緩慢上升至7. 0 9. 0，繼續在室溫下磁力攪拌1 2h。2h後，離心(8000 12500g，4°C 25°C，10 60min)， 並將收集到的上清液經凝膠過濾層析(如kphadex G-25柱層析)純化，最後將純化後的 AFt-CeO2溶液凍幹濃縮。本發明製得的氧化鈰納米顆粒的平均粒徑小於8nm，一般為4 5nm。本發明製備的蛋白包裹的氧化鈰納米顆粒(以下簡稱AFt-CeO2)，經自由基檢測試劑盒分析得知，其自由基清除活性具有濃度依賴性。隨著氧化鈰濃度的增加，AFt-CeO2的自由基清除能力越來越強。而且這種納米顆粒與蛋白複合物的自由基清除能力約為無蛋白包裹的氧化鈰納米顆粒的7倍，甚至高於相同蛋白濃度的天然的自由基清除劑SOD(超氧化物歧化酶)的活性。另外，細胞內的抗氧化實驗進一步證實，經apoferritin包裹之後， AFt-CeO2在細胞內的自由基清除活性遠遠高於無蛋白包裹的氧化鈰納米顆粒。本發明製備的蛋白包裹的氧化鈰納米顆粒，不僅可以提高氧化鈰的自由基清除活性，而且還使氧化鈰的細胞毒性大大降低。當鈰的濃度高於250uM時，無蛋白包裹的氧化鈰納米顆粒細胞毒性急劇增加。而對於AFt-CeO2,即使鈰的濃度介於250 IOOOuM範圍內時， 仍無明顯的細胞毒性。本發明製備的蛋白包裹的氧化鈰納米顆粒，主要通過籠形蛋白介導的細胞內吞的方式進入細胞，這種進入細胞的方式與天然的ferritin或apoferritin進入細胞的方式類似。而無蛋白包裹的氧化鈰納米則主要以巨胞飲的方式進入細胞。本發明具有如下優點1、利用水熱法合成了平均粒徑約為4. 5nm的氧化鈰納米顆粒。該顆粒形狀規則， 粒徑均一，分散性好。2、利用亞基解離與聚合的方法將上述氧化鈰納米顆粒裝填進apoferritin的球形空腔中。經電子能量損失譜分析證實，最終得到的AFt-CeA中鈰的平均價態為+3. 3，這要比無蛋白包裹的氧化鈰中鈰的價態(+4)低，這種鈰的價態的降低將有助於AFt-CeO2W 抗氧化活性的提高。3、製備得到的AFt-CeA在試劑盒實驗以及細胞內的自由基清除實驗中均表現出非常優越的抗氧化活性。試劑盒實驗證實，AFt-CeO2的自由基清除活性約為無蛋白包裹的氧化鈰的自由基清除活性的7倍，約為相同蛋白濃度的SOD的活性的3. 5倍。HepG2細胞內的自由基清除實驗證實，AFt-CeO2在細胞內的自由基清除活性約為無蛋白包裹的氧化鈰的 20倍。4、細胞毒性實驗證實，當鈰的濃度大於250uM時，無蛋白包裹的氧化鈰納米顆粒已經開始表現出比較強的細胞毒性，然而對於AFt-CeO2這種蛋白與納米顆粒的複合物，即使在鈰的濃度介於250 IOOOuM時，仍無明顯的細胞毒性。
5、細胞內吞實驗進一步證實AFt-CeO2主要通過籠形蛋白介導的細胞內吞途徑進入細胞，而無蛋白包裹的氧化鈰納米顆粒則主要以巨胞飲的方式進入細胞。


圖1. Apoferritin包裹的氧化鈰納米顆粒的製備路線圖；圖2.實施例1製備的氧化鈰納米顆粒的透射電鏡照片㈧及粒徑統計⑶；圖3.實施例2製備的蛋白包裹的氧化鈰納米顆粒的低分辨透射電鏡照片㈧，高分辨透射電鏡照片⑶及EDX (C)；圖4.蛋白包裹的氧化鈰納米顆粒與無蛋白包裹的氧化鈰納米顆粒的細胞毒性分析；圖5.利用試劑盒檢測AFt-CeA的自由基清除能力㈧AFt-CeA清除自由基的濃度依賴曲線。(B)不同物質自由基清除能力的比較。圖中4 {即即0作燈^^1，所用4 1以及SOD的蛋白濃度與所用的AFt-CeA中的蛋白濃度相同。而所用( 納米顆粒的鈰濃度與AFt-CeA中的鈰的濃度相同；圖6. AFt-CeO2在細胞內的自由基清除實驗。
具體實施例方式下面結合實施例對本發明作進一步的描述，但本發明並不僅僅限制於如下所述的實施例中。實施例1、水熱法製備粒徑均一的氧化鈰納米顆粒。稱取2. 74g (NH4)2Ce (NO3)6以及IOg CH3COONa溶於70ml去離子水中，然後向該溶液中加入IOml冰醋酸，並在室溫下攪拌lh。這之後將該混合液轉移至聚四氟乙烯內襯中， 用不鏽鋼水熱釜密封后，置於220°C烘箱中加熱12h。最後將所得黃色沉澱離心(6000g， IOmin)並用去離子水及乙醇多次清洗，隨後在60°C烘箱中乾燥過夜。實施例2、水熱法製備粒徑均一的氧化鈰納米顆粒。稱取5. 48g (NH4) 2Ce (NO3) 6以及20g CH3COONa溶於140ml去離子水中，然後向該溶液中加入20ml冰醋酸，並在室溫下攪拌lh。這之後將該混合液轉移至聚四氟乙烯內襯中， 用不鏽鋼水熱釜密封后，置於220°C烘箱中加熱12h。最後將所得黃色沉澱離心(lOOOOg， 20min)並用去離子水及乙醇多次清洗，隨後在60°C烘箱中乾燥過夜。實施例3、水熱法製備粒徑均一的氧化鈰納米顆粒。稱取1. 63g Ce (NO3)3以及IOg CH3COONa溶於70ml去離子水中，然後向該溶液中加入IOml冰醋酸，並在室溫下攪拌lh。這之後將該混合液轉移至聚四氟乙烯內襯中，用不鏽鋼水熱釜密封后，置於220°C烘箱中加熱Mh。最後將所得沉澱離心(10000g，20min)並用去離子水及乙醇多次清洗，隨後在60°C烘箱中乾燥過夜。上述實驗中，Ce(NO3)3也可以用其他無機鈰鹽代替。實施例4、利用本發明製備的氧化鈰納米顆粒製備納米抗氧化劑。取5ml apoferritin溶液與氧化鈰納米顆粒粉末混合，蛋白與鈰的摩爾濃度之比為1 5000。然後利用IM的HCl緩慢調節溶液的pH至2. 0，並在該pH下持續攪拌30min。 這之後再向該溶液中緩慢滴加IM的NaOH，以使溶液的pH值從2. 0緩慢上升至8. 0。當pH值升至8. 0之後，繼續在室溫下磁力攪拌2h。池後，離心(12500g，4°C，20min)，並將收集到的上清液經kphadex G-25柱子純化，最後將純化後的AFt-CeO2溶液凍幹濃縮。本發明蛋白包裹的氧化鈰納米顆粒的細胞毒性檢測。利用常規的細胞毒性檢測方法(MTT法)檢測AFt-CeA的細胞毒性。最終的實驗結果如圖4所示當鈰的濃度大於250uM時，無蛋白包裹的氧化鈰納米顆粒已經開始表現出比較強的細胞毒性，然而對於AFt-CeA這種蛋白與納米顆粒的複合物，即使在鈰的濃度介於250 IOOOuM時，仍無明顯的細胞毒性。利用自由基檢測試劑盒分析本發明蛋白包裹的氧化鈰納米顆粒的抗氧化活性。利用購自日本同仁化學研究所的超氧化物歧化酶檢測試劑盒分析AFt-Ceh的自由基清除活性，並與apoferritin，CeO2以及SOD的自由基清除能力進行了比較，實驗步驟完全按照該試劑盒的操作手冊進行。最終的實驗結果如圖5所示=AFt-CeA的自由基清除活性具有明顯的濃度依賴關係；AFt-CeO2的自由基清除活性約為無蛋白包裹的氧化鈰的自由基清除活性的7倍，約為相同蛋白濃度的SOD的活性的3. 5倍。本發明蛋白包裹的氧化鈰納米顆粒在細胞內的抗氧化活性。 將HepG2細胞接種於兩塊6孔板中，使兩塊板每個孔中的初始細胞密度相同。然後培養至每個孔中的細胞密度約為70%後，向每個孔中加入不同量的( 或者AFt-CeA (每個孔中鈰的終濃度在0 200uM範圍內變化)，並與H印G2細胞共孵育12小時。12小時後， 用PBS清洗每個孔三遍，以除去未進入細胞的游離的( 或者AFt-Ce02。然後向每個孔中加入含600μΜ H2O2的DMEM培養液(含10%的新生牛血清)2ml並繼續培養12小時。12小時後，PBS清洗每個孔三遍，然後向每個孔中加入含20 μ M DCFH-DA的DMEM培養液(含10% 的新生牛血清)2ml，對細胞染色半小時。半小時後，用PBS清洗每個孔三遍，然後收集細胞並用流式細胞儀分析每個孔中細胞的螢光強度。通過螢光強度的高低來判斷細胞內活性氧物質的含量。螢光強度越高，說明細胞內的活性氧含量越多。從圖6可以看出，AFt-CeO2與 CeO2對細胞內活性氧的清除均具有濃度依賴關係，但是前者對細胞內活性氧的清除能力要遠遠強於後者。AFt-CeO2清除掉細胞內50%的活性氧只需要6. 8 μ M的AFt-CeR (6. 8 μ M指的是AFt-CeA中鈰的濃度)，而CeA清除掉相同量的細胞內活性氧則需要132 μ M的Ce02。
權利要求
1.一種氧化鈰納米顆粒的製備方法，其步驟包括1)向鈰鹽與醋酸鈉的水溶液中加入冰醋酸，攪拌混勻；2)將上述混合液水熱處理5 60h，得到黃色沉澱物；3)將黃色沉澱物離心、洗滌並乾燥，製得氧化鈰納米顆粒。
2.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，步驟1)具體包括將2.74 5. 48g (NH4)2Ce (NO3) 6以及10 20g CH3COONa溶於50 IOOml去離子水中，然後向該溶液中加入10 50ml冰醋酸，並在室溫下攪拌1 釙。
3.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，步驟2)具體包括將混合液轉移至聚四氟乙烯內襯中，用不鏽鋼水熱釜密封后，置於200 300°C烘箱中加熱8 Mh。
4.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，步驟3)具體包括將所得黃色沉澱離心，並用去離子水及乙醇多次清洗，隨後在60°C烘箱中乾燥過夜。
5.一種生物相容性納米抗氧化劑的製備方法，其特徵在於，將如權利要求1所述方法製備的氧化鈰納米顆粒與apoferritin溶液混合，然後加酸緩慢調節溶液的pH至1. 5 3. 5，以使apoferritin的亞基解離，然後再向該溶液中緩慢滴加鹼溶液，以使溶液的pH值緩慢上升至7. 0 9. 0，經分離純化後最終得到apoferritin包裹的氧化鈰納米顆粒。
6.如權利要求5所述的方法，其特徵在於，氧化鈰納米顆粒與apoferritin溶液混合， 其中，蛋白與鈰的摩爾濃度之比為1 100 1 10000。
7.如權利要求5所述的方法，其特徵在於，氧化鈰納米顆粒與apoferritin的混合溶液用酸調節PH時，優先選用鹽酸，濃度0. 1 5M。
8.如權利要求5所述的方法，其特徵在於，氧化鈰納米顆粒與apoferritin的混合溶液加鹼調節PH時，優先選用氫氧化鈉，濃度0. 1 5M。
全文摘要
本發明公開了一種氧化鈰納米顆粒的製備方法及其抗氧化應用，屬生物納米材料領域。本發明氧化鈰納米顆粒的製備方法是向鈰鹽與醋酸鈉的水溶液中加入冰醋酸，並攪拌混勻，這之後將該混合液水熱處理5～60h，最後將所得黃色沉澱離心、洗滌並乾燥，製得氧化鈰納米顆粒。同時，利用蛋白的亞基解離與重新聚合的性質，通過控制球形蛋白外殼的開合，將上述氧化鈰納米顆粒裝填進球形空腔蛋白——apoferritin的空腔中，製得生物相容性納米抗氧化劑。本發明不僅可以提高氧化鈰納米顆粒的生物相容性，降低其細胞毒性，還可以顯著提高氧化鈰納米顆粒的抗氧化活性。
文檔編號C01F17/00GK102285678SQ20111015367
公開日2011年12月21日 申請日期2011年6月9日 優先權日2011年6月9日
發明者嚴純華, 劉祥友, 袁荃, 馬丁 申請人:北京大學