一種產透明質酸的重組畢赤酵母及其構建方法
2023-05-23 10:14:31
一種產透明質酸的重組畢赤酵母及其構建方法
【專利摘要】本發明公開了一種產透明質酸的重組畢赤酵母及其構建方法，屬於生物工程【技術領域】。本發明採用獸疫鏈球菌來源的透明質酸合酶hasA和枯草芽孢桿菌來源的UDP-葡萄糖脫氫酶tuaD，分別置於組成型啟動子GAP和TEF1下表達，在畢赤酵母GS115中實現了透明質酸的生產。本發明為高效製備透明質酸奠定了一定的基礎，適合於工業化生產應用。
【專利說明】一種產透明質酸的重組畢赤酵母及其構建方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種產透明質酸的重組畢赤酵母及其構建方法，屬於生物工程技術領 域。
【背景技術】
[0002] 透明質酸（Hyaluronic Acid, HA)，是一種高分子粘性多糖，以其獨特的分子結構 和理化性質，使其具有良好的保溼性、粘彈性、滲透性和延展性，是目前發現的自然界中保 溼性最好的物質，同時無任何免疫原性和毒性，被廣泛應用於化妝品、食品和醫藥等行業領 域。透明質酸以其獨特的分子結構和理化性質在機體內顯示出多種重要的生理功能，如潤 滑關節，調節血管壁的通透性，調節蛋白質，水電解質擴散及運轉，促進創傷癒合等。
[0003] HA廣泛地存在於各種動物組織內，如雞冠、關節滑液、軟骨、眼玻璃體等，同時發現 HA也存在於產氣桿菌、綠膿桿菌和A、B、C溶血性鏈球菌等部分細菌中。由於動物提取工藝 複雜、效率低以及存在病毒種間交叉感染和其它風險性的感染，因此，微生物發酵法開始逐 漸替代提取法生產HA。基於食品安全和醫療衛生越來越高的要求以及消費者的偏好，應用 食品安全級的微生物發酵生產HA日益受到青睞。
[0004] 本發明在畢赤酵母中構建HA代謝合成途徑，實現分泌發酵透明質酸，由於畢赤酵 母可實現高密度發酵，胞外分泌雜質相對少，產品易於分離純化，同時，本發明更換的啟動 子為組成型強啟動子，不需要甲醇誘導表達。該發明操作過程簡單，且產品純度高，易於實 現工業化生產製備透明質酸。
【發明內容】
[0005] 本發明提供了一種產透明質酸的重組畢赤酵母，是在畢赤酵母中導入兩個關鍵酶 基因，即編碼透明質酸合酶的hasA和UDP-葡萄糖脫氫酶的tuaD，完善了畢赤酵母代謝合成 HA的途徑，實現了直接以葡萄糖為碳源發酵產HA。
[0006] 這兩個基因還可以分別置於組成型強啟動子下控制表達。
[0007] 在本發明的一種實施方式中，所述畢赤酵母為Pichia pastoris GS115。
[0008] 所述透明質酸合酶編碼基因hasA可以來源於獸疫鏈球菌（Streptococcus zooepidemicus)、馬鏈球菌(Streptococcus equi)或類馬鏈球菌(Streptococcus equissp)。在本發明的一種實施方式中，編碼所述透明質酸合酶的基因hasA來源於獸疫鏈 球菌。
[0009] 所述UDP-葡萄糖脫氫酶可以來源於鏈球菌屬（Streptococcus species)、大腸杆 菌（Escherichia coli)和芽孢桿菌（Bacillus)。在本發明的一種實施方式中，編碼所述 Μ)Ρ-葡萄糖脫氫酶的基因tuaD來源於枯草芽孢桿菌（Bacillus subtiIis)。
[0010] 在本發明的一種實施方式中，所述畢赤酵母組成型強啟動子分別為三磷酸甘油醛 脫氫酶啟動子GAP和翻譯延伸因子l-α啟動子TEF1。
[0011] 在本發明的一種實施方式中，編碼所述透明質酸合酶的基因hasA的核苷酸序列 如 SEQ ID NO. 1 所示。
[0012] 在本發明的一種實施方式中，編碼所述UDP-葡萄糖脫氫酶的基因tuaD的核苷酸 序列如SEQ ID NO. 2所述。
[0013] 在本發明的一種實施方式中，所述GAP啟動子的核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所示。
[0014] 在本發明的一種實施方式中，所述TEFl啟動子的核苷酸序列如SEQ ID NO. 4所 /Jn 〇
[0015] 本發明還提供了一種構建所述重組畢赤酵母的方法，是將編碼透明質酸合酶的基 因hasA與啟動子GAP融合，將編碼UDP-葡萄糖脫氫酶的基因tuaD與啟動子TEFl融合，將 兩個融合片段再融合後連接表達載體PPIC9K，轉化畢赤酵母得到。
[0016] 本發明還提供了一種應用所述產透明質酸的重組畢赤酵母發酵產透明質酸的方 法，是以甘油、甲醇、山梨醇或葡萄糖等作為碳源，在20-30°C下，發酵48-96h。所得明質酸 分子量大於l〇 6Da。
[0017] 在本發明的一種實施方式中，碳源採用葡萄糖。
[0018] 在本發明的一種實施方式中，發酵溫度控制為30°C。
[0019] 在本發明的一種實施方式中，發酵時間控制為96h。
[0020] 在本發明的一種實施方式中，挑取重組畢赤酵母單克隆，以YH)培養基活化，然後 接種於發酵培養基，200rpm、3(TC培養96h。
[0021] 所述發酵培養基含：酵母提取物10g/L，蛋白腖20g/L，3g/LK2HP0 4,11. 8g/LKH2P04， 1XYNB(13. 4g/L)，500X 生物素 lml/L(4Xl(T4g/L)，甘油 lml/L，添加 2g/L 的 MgSO4,葡萄 糖濃度為5%。
[0022] 本發明利用畢赤酵母產透明質酸酶，與其他工程菌相比，該發明具有非常大的應 用優勢。首先，本發明過程中使用的宿主為分泌型真核表達宿主，胞外分泌雜質少，產品易 於分離純化；其次，以葡萄糖等廉價碳源為底物，可進行高密度發酵獲得高轉化率，再次，畢 赤酵母表達系統無內毒素及其它熱源物質，不會對產物的醫用食品安全帶來隱患。基於應 用分析，本發明方法在工業上用於製備透明質酸具有潛在而非常廣泛的價值。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0023] 圖1所示為重組質粒構建示意圖。
【具體實施方式】
[0024] 實施例1透明質酸合酶hasA基因和UDP-葡萄糖脫氫酶tuaD基因的克隆
[0025] 本發明所用的透明質酸合酶hasA基因來源於為獸疫鏈球菌Streptococcus zooepidemicus ATCC 35246 和 UDP-葡萄糖脫氧酶基因來源於 Bacillus subtilis， Streptococcus zooepidemicus 菌株在接種與 5ml M17 液體培養基，在 37°C 200rpm 培 養 16h。Bacillus subtilis 接種於 5mlLB 液體培養基，在 37°C 200rpm 培養 16h。Pichia pastoris GS115接種於5ml ΥΗ)液體培養基，置於200rpm 30°C培養24h。分別收集菌體， 採用細菌基因組提取試劑盒提取三菌株的基因組DNA。
[0026] 根據已公布的基因組信息序列，分別設計引物hasA-F/hasA-R、tuaD-F/tuaD-R, 以提取的基因組DNA為模板，採用標準的PCR擴增體系和程序，分別擴增獲取hasA和tuaD 基因。以Pichia pastorisGS115基因組為模板,設計引物gap-F/gap-R和tef-F/tef-R分 別擴增GAP和TEFl啟動子。
[0027] 引物序列信息：5' -3'方向
[0028] hasA-F ：TGAACAACTATTTCGAAACGATGAGAACATTAAAAAACCTCATAAC
[0029] hasA-R ： TGTCTAAGGCGAATTAATTCTTATAATAATTTTTTACGTGTTCCCCAGTC
[0030] tuaD-F ： CATTTTAGTTATTCGCCAACATGAAAAAAATAGCTGTCATTGGAACAGG
[0031] tuaD-R ： CCGGAATTCTTATAATAATTTTTTACGTGTTCCCCAGTCAGC
[0032] gap-F ： CTTGATTCGAGCTCTTTTTGTAGAAATGTCTTGGTGTCCTC
[0033] gap-R：AGGTTTTTTAATGTTCTCATCGTTTCGAAATAGTTGTTCAATTG
[0034] tef-F：GAACACGTAAAAAATTATTATAAGAATTCCGGATAACTGTCGCCTCTTTTATCTGCCGC
[0035] tef-R ：ATGACAGCTATTTTTTTCATGTTGGCGAATAACTAAAATGTATGTAG
[0036] 序列表所示為本發明所述核苷酸序列信息：
[0037] (I)SEQ ID NO. 1序列信息為獸疫鏈球菌來源的透明質酸合成酶編碼序列；
[0038] (2) SEQ ID NO. 2序列信息為枯草芽孢桿菌來源的UDP-葡萄糖脫氫酶編碼序列；
[0039] (3) SEQ ID NO. 3序列信息為畢赤酵母組成型啟動子GAP的基因序列；
[0040] (4) SEQ ID NO. 4序列信息為畢赤酵母組成型啟動子TEFl的基因序列。
[0041] 實施例2重組質粒PAPT9K的構建
[0042] 採用上述擴增的DNA片段hasA、tuaD、GAP和TEF1，分別採用融合PCR進行啟動子 和目的基因的融合。具體操作程序如下：hasA和GAP片段各取2 μ 1混合於PCR管內，加入 無菌水21 μ 1和25 μ 12x super pfu Master Mix (杭州寶賽生物科技有限公司），混勻後 置於 PCR 儀，按如下程序運行：94°C 3min，[94°C 30s，50°C 30s，72°C lmin] X 10, 72°C 5min。 無引物自融合PCR結束後，立即加入引物gap-F和hasA-R各I μ 1，混勻後按如下程序運行： 94°C 3min，[94°C 30s，55°C 30s，72°C lmin] Χ32, 72°C 5min。PCR 產物經 1% 的瓊脂糖凝膠 電泳後，切膠回收目標條帶，獲得GAP-hasA片段。
[0043] 同理，按上述操作融合PCR獲得TEFl-tuaD片段。回收的兩個融合片段 GAP-hasA和TEFl-tuaD，在按上述融合PCR操作，將兩片段進行融合，獲得目標片段 GAP-hasA-TEFl-tuaD。由於在引物gap-F和tuaD-R兩端分別引入了 SacI和NotI限制性酶 切位點，將載體PPIC9K進行SacI和EcoRI雙酶切，去掉AOX啟動子和α -因子信號肽，重組 目標片段GAP-hasA-TEFl-tuaD同樣採取SacI和EcoRI雙酶切，回收後與已雙切的pPIC9K 載體連接，轉化大腸桿菌JM109宿主，對鑑定出的陽性克隆提取質粒進行測序，比對分析重 組質粒PAPT9K構建成功，質粒構建示意圖如附圖1所示。
[0044] 實施例3重組畢赤酵母產HA的菌株構建
[0045] 重組質粒PAPT9K採用Sail線性化後，按畢赤酵母操作手冊，電轉Pichia pastoris GS115宿主，以MD平板（組氨酸缺陷型篩選標記）篩選陽性重組子。同時，為篩 選多拷貝插入的宿主，以含有不同濃度抗生素g418的YH)平板進行高拷貝篩選。本發明中 採用的發酵重組菌株為4mg/ml篩選出來的陽性重組菌株，命名為PAPTGS115。
[0046] 實施例4重組畢赤酵母PAPTGS115菌株的搖瓶發酵
[0047] 挑取PAPTGS115重組菌單克隆接種於5ml YH)培養基，置於200rpm3(TC過夜培養。 16h後接種於250ml三角搖瓶（裝液量25ml)中，發酵培養基為BMGY :酵母提取物10g/L， 蛋白腖 20g/L，3g/LK2HP04,11. 8g/LKH2P04,1 X YNB (13. 4g/L)，500 X 生物素 lml/L (4 X l(T4g/ L)，甘油lml/L，添加2g/L的MgS04,葡萄糖濃度為5 %。按I %的接種量轉接與BMGY搖瓶， 置於 200rpm30°C培養 96h。
[0048] 收集發酵液，IOOOOrpm下室溫離心lOmin。發酵液上清轉移置另一離心管中，加入 2倍體積的無水乙醇充分混勻沉澱發酵液中的透明質酸。室溫下靜置lh，再IOOOOrpm下室 溫離心20min，去除乾淨液體，白色沉澱加入發酵液等體積的IMNaCl溶液充分溶解，適當稀 釋後，採用Bitter-Muir硫酸咔唑法檢測HA酸含量，對照組為Pichia pastoris GS115同 等條件下發酵液的回收物。經測定PAPTGS115重組菌株的HA產量為0. 36g/L。
【權利要求】
1. 一種產透明質酸的重組畢赤酵母，是在畢赤酵母中導入透明質酸合酶基因hasA和 Μ)Ρ-葡萄糖脫氫酶基因tuaD。
2. 根據權利要求1所述的重組畢赤酵母，其特徵在於，兩個基因分別以組成型強啟動 子控制表達。
3. 根據權利要求1所述的重組畢赤酵母，其特徵在於，以畢赤酵母（Pichia pastoris) GS115為宿主。
4. 根據權利要求1所述的重組畢赤酵母，其特徵在於，所述透明質酸合酶基因hasA來 源於獸疫鏈球菌（Streptococcus zooepidemicus)、馬鏈球菌（Streptococcus equi)或類 馬鏈球菌（Streptococcus equissp) 〇
5. 根據權利要求1所述的重組畢赤酵母，其特徵在於，所述UDP-葡萄糖脫氫酶來 源於鏈球菌屬（Streptococcus species)、大腸桿菌（Escherichia coli)或芽抱桿菌 (Bacillus)〇
6. 根據權利要求1-5任一所述的重組畢赤酵母，其特徵在於，編碼所述透明質酸合酶 的基因hasA的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示，編碼所述UDP-葡萄糖脫氫酶的基因tuaD 的核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
7. 根據權利要求2所述的重組畢赤酵母，其特徵在於，hasA、tuaD分別由三磷酸甘油醛 脫氫酶啟動子GAP和翻譯延伸因子l-α啟動子TEFl控制表達。
8. -種應用權利要求1-5, 7任一所述重組畢赤酵母發酵產透明質酸的方法，其特徵在 於，是以甘油、甲醇、山梨醇或葡萄糖作為碳源，在20-30°C下，發酵48-96h。
9. 根據權利要求8所述的方法，其特徵在於，碳源採用葡萄糖，20〇rpm、30°C，發酵96h ; 發酵培養基含：酵母提取物 l〇g/L，蛋白腖 20g/L，3g/LK2HP04,11. 8g/LKH2P04,1 X YNB13. 4g/ L，500 X生物素lml/L，甘油lml/L，添加2g/L的MgSO4，葡萄糖濃度為5 %。
10. -種構建權利要求1-5, 7任一所述重組畢赤酵母的方法，其特徵在於，將編碼透明 質酸合酶的基因hasA與啟動子GAP融合，將編碼TOP-葡萄糖脫氫酶的基因tuaD與啟動子 TEFl融合，將兩個融合片段再融合後連接表達載體，轉化畢赤酵母得到。
【文檔編號】C12N15/81GK104212732SQ201410467077
【公開日】2014年12月17日 申請日期:2014年9月12日 優先權日:2014年9月12日
【發明者】陳堅, 堵國成, 康振, 金鵬 申請人:江南大學