阿奇黴素在抗冠狀病毒感染中的應用的製作方法
2023-05-23 10:05:06
本發明是關於阿奇黴素在製備抗冠狀病毒感染藥物中的應用，屬於醫藥技術領域。本發明包含阿奇黴素在冠狀病毒預防或治療中的單獨或聯合應用。
背景技術：
冠狀病毒(coronavirus，cov)病毒學分類屬於網巢病毒目(nidovirales)冠狀病毒科(coronaviridae)冠狀病毒屬(coronavirinae)。冠狀病毒根據其進化，又可分為α-冠狀病毒、β-冠狀病毒和γ-冠狀病毒[gorbalenyaae,enjuanesl,ziebuhrj,etal.nidovirales:evolvingthelargestrnavirusgenome.virusres.2006,117:17-37.](圖1)。
冠狀病毒是直徑為50-200nm的球狀包膜病毒，其基因組為單鏈正鏈rna，共編碼4種結構蛋白：刺突蛋白(spike,s)、膜蛋白(membrane,m)、包膜蛋白(envelope,e)和核衣殼蛋白(nulcleocapsid,n)。其中s蛋白是唯一負責介導病毒進入宿主細胞的蛋白。s是跨膜蛋白，分子量128-160kda，s蛋白以三聚體形式嵌於病毒外殼。每一個s蛋白又由s1和s2亞基組成，其中s1高度可變，主要功能是與宿主細胞表面受體結合；s2為保守區，負責病毒的融合過程[masters,ps.；perlman,s.coronaviridae.in:knipe,dm.；howley,pm.,editors.fieldsvirology.philadelphia:lippincottwilliams&wilkins.2013,825-858.]。當冠狀病毒以ph依賴方式進入宿主細胞後，遺傳物質釋放至胞漿，由於其基因組5'-甲基化和3'-polya序列的結構特徵，使其rna可結合至核糖體並啟動翻譯過程，合成多聚蛋白[sethnapb,hungsl,brianda.coronavirussubgenomicminus-strandrnasandthepotentialformrnareplicons.procnatlacadsci.1989,86:5626-5630.]。冠狀病毒的基因組還編碼聚合酶，在該聚合酶的催化下，利用宿主元件可以以冠狀病毒基因組rna為模板生成新rna。當多聚蛋白和rna基因組都被合成後，開始子代新病毒包裝，多聚蛋白由冠狀病毒的蛋白酶水解，變為具有功能的結構蛋白，此新生成的冠狀病毒出芽，釋放至細胞外並開始新一輪感染過程[hoguebg,machamerce.coronavirusstructuralproteinsandvirusassembly.in:perlmans,gallaghert,snijderej,eds.nidoviruses.washington,dc:asmpress.2008,179-200.]。
冠狀病毒感染哺乳動物和人的上呼吸道或消化道。現已知可感染人類的冠狀病毒共有六種：人冠狀病毒oc43(humancoronavirusoc43，hcov-oc43)、人冠狀病毒229e(humancoronavirus229e，hcov-229e)、人冠狀病毒nl63(humancoronavirusnl63，hcov-nl63)、人冠狀病毒hku1(humancoronavirushku1，hcov-hku1)、重症急性呼吸症候群冠狀病毒(severeacuterespiratorysyndromecoronavirus，sars-cov)和中東呼吸症候群冠狀病毒(middleeastrespiratorysyndromecoronavirus，mers-cov)。人感染冠狀病毒後一般引起呼吸系統疾病，前四株冠狀病毒通常引起人的普通感冒，而人感染後兩種冠狀病毒的臨床表現則為高致病性的呼吸窘迫症。
在2003年前，人們對人冠狀病毒的通常認知是此類病毒感染會引起患者低致死率的上呼吸道感染。hcov-229e和hcov-oc43即為上世紀六十年代從患者上呼吸道分離獲得的毒株[mcintoshk.coronaviruses:acomparativereview.currtopmicrobiolimmunol.1974,63:85-129.]。據報導，冠狀病毒在全球範圍內流行，10-15％的普通感冒是由冠狀病毒感染引起[vanderhoek,l.humancoronaviruses:whatdotheycause？,antiviraltherapy.2007,12(4ptb):651–658.；jumpupwat,dennis).thecommoncold:areviewoftheliterature.europeanjournalofinternalmedicine.2004,15(2):79–88.]。人感染hcov-oc43、hcov-229e、hcov-nl63或hcov-hku1會引起普通感冒，目前無針對上述四種病毒的疫苗或特效藥物。
2002年11月-2003年7月重症急性呼吸症候群冠狀病毒(sars-cov)在我國的傳播造成較嚴重疫情，共8096人感染，其中774人死亡，死亡率9.6％["epidemicandpandemicalertandresponse(epr)".worldhealthorganization.]。患者感染sars-cov初期症狀為發熱、肌肉酸痛、喉嚨痛。隨著病情發展，呼吸短而氣促，然後為病毒性肺炎症狀或細菌性二次感染致肺炎。患者主要採用幹擾素及對症或支持治療，到目前為止尚無特效藥或疫苗[robertsa,thomaswd,guarnerj,lamirandeew,babcockgj,greenoughtc,vogell,hayesn,sullivanjl,zakis,subbaraok,ambrosinodm."therapywithasevereacuterespiratorysyndrome-associatedcoronavirus-neutralizinghumanmonoclonalantibodyreducesdiseaseseverityandviralburdeningoldensyrianhamsters".jinfectdis.193(5):685–692.]。
中東呼吸症候群冠狀病毒(mers-cov)是另一種高致死率可傳染人的冠狀病毒。mers-cov最早於2012年在沙烏地阿拉伯被分離，起初稱為「新冠狀病毒2012」["ecdcrapidriskassessment-severerespiratorydiseaseassociatedwithanovelcoronavirus".19feb2013.retrieved22apr2014.]。該病毒已在26個國家出現，至2016年3月23日，共有1698人確診感染，其中609人死亡，致死率36％[http://www.who.int/emergencies/mers-cov/en/，who]。流行病研究結果顯示，蝙蝠為該病毒的原始宿主，大約在上世紀九十年代中期，該病毒由蝙蝠傳播到駱駝，然後又由駱駝傳到人。現尚無證據顯示該病毒可在人際間傳播。中東呼吸症候群的臨床表現常見為發熱、發熱伴畏寒寒戰、咳嗽、氣短、肌肉酸痛、腹瀉、噁心嘔吐、腹痛等。目前尚無對mers-cov特效藥。
由於用於治療冠狀病毒感染的臨床用藥缺乏，因此對此類病毒的藥物研發具有重要意義。
阿奇黴素(結構式i)是15元環大環內酯類抗生素，該藥物通過與細菌核糖核蛋白體的50s亞單位結合，妨礙肽鏈的延長，影響細菌蛋白合成而達到抑菌作用，對大多數革蘭氏陽性菌、部分陰性菌及一些非典型致病菌均有效，是大環內酯類抗生素中對淋球菌和腦膜炎球菌等革蘭氏陰性球菌抑菌活性最強的藥物；對革蘭氏陰性桿菌的作用比紅黴素明顯增強。阿奇黴素對流感嗜血桿菌的抑菌作用比紅黴素強4-8倍；對腸桿菌、霍亂弧菌具有良好的抑菌作用。經檢索，未見阿奇黴素抗冠狀病毒活性報導。
本發明是基於應用冠狀病毒感染細胞模型對1600個現有上市藥物普篩，用以發現可以阻斷冠狀病毒感染宿主細胞的藥物。本發明是關於已有藥物新用途的應用專利。
技術實現要素：
本發明解決的技術問題是提供如結構式(i)所示的阿奇黴素在預防或治療冠狀病毒藥物中的應用，以及含有如結構式(i)所示的阿奇黴素的藥物組合物在預防或治療冠狀病毒藥物中的應用，
為解決本發明的技術問題，本發明提供了如下技術方案：
本發明技術方案的第一方面是提供了如結構式(i)所示的阿奇黴素在預防或治療冠狀病毒藥物中的應用，
本發明技術方案的第二方面是提供了含有如結構式(i)所示的阿奇黴素的藥物組合物在預防或治療冠狀病毒藥物中的應用，
上述的應用中，所述的藥物組合物還可以含有其他的抗病毒藥。
本發明第一方面和第二方面所述的冠狀病毒優選感染人類的冠狀病毒；進一步的，所述的冠狀病毒優選重症急性呼吸症候群冠狀病毒sars-cov(severeacuterespiratorysyndromecoronavirus,sars-cov)、中東呼吸症候群冠狀病毒mers-cov(middleeastrespiratorysyndromecoronavirus,mers-cov)或致普通感冒的冠狀病毒；所述的致普通感冒的冠狀病毒優選人冠狀病毒oc43(humancoronavirusoc43)、人冠狀病毒229e(humancoronavirus229e)、人冠狀病毒nl63(humancoronavirusnl63)、人冠狀病毒hku1(humancoronavirushku1)。
本發明第二方面涉及以本發明第一方面所述化合物作為活性成份的藥物組合物。該藥物組合物可根據本領域公知的方法製備。可通過將本發明化合物與一種或多種藥學上可接受的固體或液體賦形劑和/或輔劑結合，製成適於人或動物使用的任何劑型。本發明化合物在其藥物組合物中的含量通常為0.1-95重量％。
本發明化合物或含有它的藥物組合物可以單位劑量形式給藥，給藥途徑可為腸道或非腸道，如口服、靜脈注射、肌肉注射、皮下注射、鼻腔、口腔黏膜、眼、肺和呼吸道、皮膚、陰道、直腸等。
給藥劑型可以是液體劑型、固體劑型或半固體劑型。液體劑型可以是溶液劑(包括真溶液和膠體溶液)、乳劑(包括o/w型、w/o型和復乳)、混懸劑、注射劑(包括水針劑、粉針劑和輸液)、滴眼劑、滴鼻劑、洗劑和搽劑等；固體劑型可以是片劑(包括普通片、腸溶片、含片、分散片、咀嚼片、泡騰片、口腔崩解片)、膠囊劑(包括硬膠囊、軟膠囊、腸溶膠囊)、顆粒劑、散劑、微丸、滴丸、栓劑、膜劑、貼片、氣(粉)霧劑、噴霧劑等；半固體劑型可以是軟膏劑、凝膠劑、糊劑等。
本發明化合物可以製成普通製劑、也可以製成緩釋製劑、控釋製劑、靶向製劑及各種微粒給藥系統。
為了將本發明化合物製成片劑，可以廣泛使用本領域公知的各種賦形劑，包括稀釋劑、黏合劑、潤溼劑、崩解劑、潤滑劑、助流劑。稀釋劑可以是澱粉、糊精、蔗糖、葡萄糖、乳糖、甘露醇、山梨醇、木糖醇、微晶纖維素、硫酸鈣、磷酸氫鈣、碳酸鈣等；潤溼劑可以是水、乙醇、異丙醇等；黏合劑可以是澱粉漿、糊精、糖漿、蜂蜜、葡萄糖溶液、微晶纖維素、阿拉伯膠漿、明膠漿、羧甲基纖維素鈉、甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、乙基纖維素、丙烯酸樹脂、卡波姆、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇等；崩解劑可以是幹澱粉、微晶纖維素、低取代羥丙基纖維素、交聯聚乙烯吡咯烷酮、交聯羧甲基纖維素鈉、羧甲基澱粉鈉、碳酸氫鈉與枸櫞酸、聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯、十二烷基磺酸鈉等；潤滑劑和助流劑可以是滑石粉、二氧化矽、硬脂酸鹽、酒石酸、液體石蠟、聚乙二醇等。
還可以將片劑進一步製成包衣片，例如糖包衣片、薄膜包衣片、腸溶包衣片，或雙層片和多層片。
為了將給藥單元製成膠囊劑，可以將有效成分本發明化合物與稀釋劑、助流劑混合，將混合物直接置於硬膠囊或軟膠囊中。也可將有效成分本發明化合物先與稀釋劑、黏合劑、崩解劑製成顆粒或微丸，再置於硬膠囊或軟膠囊中。用於製備本發明化合物片劑的各稀釋劑、黏合劑、潤溼劑、崩解劑、助流劑品種也可用於製備本發明化合物的膠囊劑。
為將本發明化合物製成注射劑，可以用水、乙醇、異丙醇、丙二醇或它們的混合物作溶劑並加入適量本領域常用的增溶劑、助溶劑、ph調劑劑、滲透壓調節劑。增溶劑或助溶劑可以是泊洛沙姆、卵磷脂、羥丙基-β-環糊精等；ph調劑劑可以是磷酸鹽、醋酸鹽、鹽酸、氫氧化鈉等；滲透壓調節劑可以是氯化鈉、甘露醇、葡萄糖、磷酸鹽、醋酸鹽等。如製備凍乾粉針劑，還可加入甘露醇、葡萄糖等作為支撐劑。
此外，如需要，也可以向藥物製劑中添加著色劑、防腐劑、香料、矯味劑或其他添加劑。
本發明的發明人發現阿奇黴素可特異性地阻斷冠狀病毒感染宿主細胞。
還可以和其他的抗病毒藥物進行聯合用藥。
為達到用藥目的，增強治療效果，本發明的藥物或藥物組合物可用任何公知的給藥方法給藥。
本發明化合物藥物組合物的給藥劑量依照所要預防或治療疾病的性質和嚴重程度，患者或動物的個體情況，給藥途徑和劑型等可以有大範圍的變化。一般來講，本發明化合物的每天的合適劑量範圍為0.001-150mg/kg體重，優選為0.1-100mg/kg體重，更優選為1-60mg/kg體重，最優選為2-30mg/kg體重。上述劑量可以一個劑量單位或分成幾個劑量單位給藥，這取決於醫生的臨床經驗以及包括運用其他治療手段的給藥方案。
本發明的化合物或組合物可單獨服用，或與其他治療藥物或對症藥物合併使用。當本發明的化合物與其他治療藥物存在協同作用時，應根據實際情況調整它的劑量。
有益技術效果
阿奇黴素作為抗菌藥已在臨床長期應用，其安全性、藥物代謝特性、毒副作用已經明確。而此次發現該藥物抗冠狀病毒的新用途將可快速使其應用於人冠狀病毒致普通感冒和人冠狀病毒致高危症狀感染，緩解重大疫情。
附圖說明
圖1.冠狀病毒分類
圖2.阿奇黴素阻斷sars-cov感染活性
圖3.阿奇黴素阻斷mers-cov感染活性
具體實施方式
實施例1.篩選模型的原理
冠狀病毒進入宿主細胞是病毒感染的第一步，抑制病毒的進入就可有效阻斷病毒感染。冠狀病毒包膜表面刺突蛋白(spike，s)是冠狀病毒進入過程的關鍵蛋白。
我們分別應用sars-cov包膜s基因(sars-covs，genebank:ay278741.1)和mers-cov包膜s基因(mers-covs,genebank:jx869059.2)。通過共轉染表達s蛋白的質粒和hiv核心質粒(pnl4-3-luc-r-e-)，可獲得s蛋白為外殼包裹hiv核心的sars-cov重組病毒sars-s/hiv[yingguo,jennifertisoncik,susannamcreynolds,michaelfarzan,bellurs.prabhabar,thomasgallagher,lijunrongandmichaelcaffrey.identificationofanewregionofsars-covsproteincriticalforviralentry.journalofmolecularbiology.2009,394:600-605.]和mers-cov重組病毒mers-s/hiv[grehank,ferraraf,tempertonn.anoptimisedmethodfortheproductionofmers-covspikeexpressingviralpseudotypes.methodsx.2015,2:379-384.]。該病毒顆粒具有以下特點：1)病毒對宿主細胞的選擇性取決於刺突蛋白s的特性；2)由於hiv載體上env、nef和vpr基因缺失，因此該病毒只能一次性進入宿主細胞並且不能複製，所以該病毒是安全的；3)該hiv載體上帶有一個螢光素酶報告基因，因此被感染的細胞會表達螢光素酶，通過檢測螢光素酶活性就可標示細胞被病毒感染的程度。同時，我們還製備了以水皰性口膜炎病毒vsv的糖蛋白(vsv-g)為外膜蛋白的vsv-g/hiv重組病毒作為模型對照組。當化合物可抑制hcov-s/hiv病毒的進入，而對vsv-g/hiv病毒的進入無顯著抑制時，視為特異性冠狀病毒進入抑制劑。
實施例2.抗sars-cov感染藥效學實驗方法
在本發明中應用了sarscoronavirusurbani(genebank:ay278741.1)毒株。重組病毒製備[yingguo,jennifertisoncik,susannamcreynolds,michaelfarzan,bellurs.prabhabar,thomasgallagher,lijunrongandmichaelcaffrey.identificationofanewregionofsars-covsproteincriticalforviralentry.journalofmolecularbiology.2009,394:600-605.]：共轉染pcdna3.1/sars-s質粒和pnl4-3-luc-r-e-質粒至293t細胞，轉染後48h收集上清，上清液經0.45μm濾膜過濾，該上清中含有sars-s/hiv病毒顆粒，該重組病毒可用於感染。按照同樣方法製備vsv-g/hiv重組病毒。
感染[yingguo,jennifertisoncik,susannamcreynolds,michaelfarzan,bellurs.prabhabar,thomasgallagher,lijunrongandmichaelcaffrey.identificationofanewregionofsars-covsproteincriticalforviralentry.journalofmolecularbiology.2009,394:600-605.]：應用改良磷酸鈣方法將表達人血管緊張素轉移酶ii(homosapiensace2，genebank:ab046569.1)的質粒轉至293t細胞。感染前一天，按每孔6×104個細胞的密度將293t-aceii細胞接種到24孔板上。用dmso溶解陽性對照化合物或待篩選化合物，感染前15分鐘加入細胞培養液中，以dmso溶劑作空白對照。加入適宜稀釋度的病毒液感染細胞。感染48小時後，棄去上清，然後向每孔被感染的細胞加入50μl細胞裂解液(promega)裂解細胞，將30μl螢光素酶底物(promega)與20μl細胞裂解液混合後用fb15螢光檢測器(sirius)儀器測定細胞螢光素酶的相對活性，其活性的強弱反映了病毒的感染水平。結果顯示，阿奇黴素可有效抑制sars-cov病毒對宿主細胞的感染，其半數抑制濃度為0.11μm(圖2,表1)。在終濃度10μm時，阿奇黴素對vsvg/hiv感染無抑制作用。
表1
實施例3.抗mers-cov感染藥效學實驗方法
在本發明中應用了humanbetacoronavirus2cemc/2012(genebank:jx869059.2)毒株。重組病毒製備[grehank,ferraraf,tempertonn.anoptimisedmethodfortheproductionofmers-covspikeexpressingviralpseudotypes.methodsx.2015,2:379-384.]：共轉染pcmv3/mers-s質粒和pnl4-3-luc-r-e-質粒至293t細胞，轉染後48h收集上清，上清液經0.45μm濾膜過濾，該上清中含有mers-s/hiv病毒顆粒，該重組病毒可用於感染。
感染：應用改良磷酸鈣方法將表達人cd26(genebank:nm_001935.3)的質粒轉至293t細胞。感染前一天，按每孔6×104個細胞的密度將293t-cd26細胞接種到24孔板上。用dmso溶解陽性對照化合物或待篩選化合物，感染前15分鐘加入細胞培養液中，以dmso溶劑作空白對照。加入適宜稀釋度的病毒液感染細胞。感染48小時後，棄去上清，然後向被感染的細胞每孔加入50μl細胞裂解液(promega)裂解細胞，將30μl螢光素酶底物(promega)與20μl細胞裂解液混合後用fb15螢光檢測器(sirius)儀器測定細胞螢光素酶的相對活性，其活性的強弱反映了病毒的感染的水平。結果顯示，阿奇黴素可有效抑制mers-cov病毒對宿主細胞的感染，其半數抑制濃度為0.10μm(圖3,表2)。
表2
實施例4.細胞毒性試驗
應用mts法測定了阿奇黴素對293t細胞的細胞毒性，結果顯示阿奇黴素在10μm的終濃度下無細胞毒性。