抗諾如病毒GII.4型鼠源單克隆抗體的製備和應用的製作方法

2023-05-23 10:05:31 2

本發明屬於生物醫藥領域，具體地說，本發明涉及抗諾如病毒GII.4型鼠源單克隆抗體的製備和應用。
背景技術：
：諾如病毒(NoVs)是導致急性腸胃炎的散發病例和大暴發的主要的病原體之一，而且，諾如病毒可以感染所有年齡段的人。儘管，諾如病毒感染後引起的症狀一般比較溫和，有自限性，病程持續1-3天左右，但是在小孩、老人以及免疫功能不全的人中仍可引起較為嚴重的症狀，甚至引起死亡。根據VP1衣殼蛋白的胺基酸序列，諾如病毒可以分為6個基因組(G1-GVI)，但只有GI，GII和GIV可以感染人類。人諾如病毒的感染主要由諾如病毒GII所引起，而大的暴發流行多由諾如病毒GII.4導致。GII.4病毒株的變異體所導致的諾如病毒的感染在全球的腸胃炎病例中佔了大約55％-85％，而且那些病情比較嚴重需要住院治療甚至導致死亡的病例也大多由諾如病毒GII.4引起。諾如病毒在發達國家和發展中國家均有流行，給各國帶來了嚴重的經濟損失，兒童、老人的健康造成了很大的威脅。到目前為止，沒有上市的預防性疫苗和特效的治療性藥物。諾如病毒缺少細胞培養模型，也沒有小動物模型，這給疫苗和抗病毒藥物的研究帶來了很大的阻礙。因此，本領域技術人員致力於開發具有良好臨床應用前景的抗諾如病毒藥物。技術實現要素：本發明的目的在於提供一種抗諾如病毒GII.4鼠源單克隆抗體的製備和應用。本發明的第一方面，提供了一種抗體的重鏈可變區，所述的重鏈可變區包括以下三個互補決定區CDR：SEQIDNO:8所示的CDR1，SEQIDNO:9所示的CDR2，和SEQIDNO:10所示的CDR3；優選地，所述重鏈可變區具有SEQIDNO:6所示的胺基酸序列。本發明的第二方面，提供了一種抗體的重鏈，所述的重鏈具有如本發明第一方面所述的重鏈可變區和重鏈恆定區。在另一優選例中，所述抗體的重鏈胺基酸序列如SEQIDNO.:3所示。本發明的第三方面，提供了一種抗體的輕鏈可變區，所述輕鏈可變區具有選自下組的互補決定區CDR：SEQIDNO:14所示的CDR1'，SEQIDNO:15所示的CDR2'，和SEQIDNO:16所示的CDR3'；優選地，所述的輕鏈可變區具有SEQIDNO:7所示的胺基酸序列。本發明的第四方面，提供了一種抗體的輕鏈，所述的輕鏈具有如本發明第三方面所述的輕鏈可變區和輕鏈恆定區。在另一優選例中，所述抗體的輕鏈胺基酸序列如SEQIDNO.:5所示。本發明的第五方面，提供了一種抗體，所述抗體具有：(1)如本發明第一方面所述的重鏈可變區；和/或(2)如本發明第三方面所述的輕鏈可變區；或者，所述抗體具有：如本發明第二方面所述的重鏈；和/或如本發明第四方面所述的輕鏈。本發明的第六方面，提供了一種重組蛋白，所述的重組蛋白具有：(i)如本發明第一方面所述的重鏈可變區、如本發明第二方面所述的重鏈、如本發明第三方面所述的輕鏈可變區、如本發明第四方面所述的輕鏈、或如本發明第五方面所述的抗體；以及(ii)任選的協助表達和/或純化的標籤序列。本發明的第七方面，提供了一種多核苷酸，它編碼選自下組的多肽：(1)如本發明第一方面所述的重鏈可變區、如本發明第二方面所述的重鏈、如本發明第三方面所述的輕鏈可變區、如本發明第四方面所述的輕鏈、或如本發明第五方面所述的抗體；或(2)如本發明第六方面所述的重組蛋白。在另一優選例中，所述多核苷酸的序列具有如SEQIDNO.:2和/或SEQIDNO.:4所示的多核苷酸序列。本發明的第八方面，提供了一種載體，它含有本發明本發明第七方面所述的多核苷酸。本發明的第九方面，提供了一種遺傳工程化的宿主細胞，其特徵在於，它含有本發明第八方面所述的載體或基因組中整合有本發明七方面所述的多核苷酸。本發明的第十方面，提供了一種試劑盒，所述試劑盒中包括：本發明第五方面所述的抗體。在另一優選例中，所述試劑盒為酶聯免疫檢測試劑盒。本發明的第十一方面，提供了一種免疫偶聯物，該免疫偶聯物含有：(a)本發明第五方面所述的抗體或本發明第六方面所述的重組蛋白；和(b)選自下組的偶聯部分：可檢測標記物、藥物、毒素、細胞因子、放射 性核素、或酶。本發明的第十二方面，提供了一種藥物組合物，所述組合物包含本發明第五方面所述的抗體、本發明第六方面所述的重組蛋白、或本發明第十一方面所述的免疫偶聯物；以及藥學上可以接受的載體。本發明的第十三方面，提供了一種重組多肽的製備方法，該方法包含：(a)在適合表達的條件下，培養本發明第九方面所述的宿主細胞；(b)從培養物中分離出重組多肽，所述的重組多肽是本發明第五方面所述的抗體或本發明第六方面所述的重組蛋白。應理解，在本發明範圍內中，本發明的上述各技術特徵和在下文(如實施例)中具體描述的各技術特徵之間都可以互相組合，從而構成新的或優選的技術方案。限於篇幅，在此不再一一累述。附圖說明圖1顯示了聚丙烯醯胺凝膠電泳分析純化的抗GII.4單抗。5種純化的抗體分別經含有還原劑的上樣緩衝液處理後上樣到12％的聚丙烯醯胺凝膠中進行電泳，並以考馬斯亮藍染色顯示蛋白條帶。M,蛋白分子量標準；1，D11單抗；2，G9單抗；3，2D8單抗；4，7D8單抗；5，8E1單抗圖2顯示了酶聯免疫吸附實驗(Elisa)鑑定單抗與不同抗原的結合能力。在Elisa板上每孔分別包被100ngGII.4(A)或者GI.1(B)病毒樣顆粒，每孔分別加不同濃度的純化的單抗在37℃孵育2小時，接著用HRP標記的抗鼠二抗進行孵育。抗B肝表面抗原(HBsAg)單抗被用來做無關對照。圖中每個點顯示了三個重複樣品測定的OD450nm平均值和標準差。圖3顯示了Westernblot分析。GII.4病毒樣顆粒經處理後，在12％的聚丙烯醯胺凝膠中進行電泳，接著轉印到PVDF膜上，用純化的單抗進行雜交。M,蛋白分子量標準；1，D11單抗；2，G9單抗；3，2D8單抗；4，7D8單抗；5，8E1單抗；6，鼠抗GII.4病毒樣顆粒克隆抗體。圖4顯示了夾心Elisa檢測GI.1和GII.4病毒樣顆粒。在Elisa板上每孔分別包被50ul1:5000稀釋的兔抗GII.4(A)或者兔抗GI.1(B)，每孔分別加不同濃度的GII.4病毒樣顆粒(A)和GI.1病毒樣顆粒(B)在37℃孵育2小時，接著每孔加入10ng的純化的單抗，最後用HRP標記的抗鼠二抗進行孵育。抗B肝表面抗原(HBsAg)單抗被用來做無關對照。圖5顯示了替代中和試驗檢測純化後單抗抑制GII.4病毒樣顆粒與PGMIII作用的活性。在Elisa板上每孔包被50ul10ug/mlPGMII，將不同濃度的單抗與0.5ug/mlGII.4病毒樣顆粒在室溫孵育1小時後加入Elisa板中，接著加入兔抗GII.4，最後用HRP標記的抗兔二抗進行孵育。抗B肝表面抗原(HBsAg)單抗被用來做無關對照。圖6顯示了基因重組表達的單克隆抗體的鑑定。在Elisa板上每孔分別包被100ngGII.4病毒樣顆粒，每孔分別加不同濃度的純化的單抗在37℃孵育2 小時，接著用HRP標記的抗鼠二抗進行孵育。未轉染質粒的細胞的培養上清作為空白對照。圖中柱狀圖顯示了三個重複樣品測定的OD450nm平均值和標準差。具體實施方式本發明人通過廣泛而深入的研究，獲得一種抗諾如病毒GII.4鼠源單克隆抗體，實驗結果表明，所述單克隆抗體具有極高的對諾如病毒GII.4的中和活性，而且該抗體不存在與GI.1病毒樣顆粒的交叉反應，能夠特異性識別GII.4病毒。本發明還提供了上述單克隆抗體的用途。具體地，本研究以GII.4病毒樣顆粒作為免疫原製備了能特異性識別GII.4的單克隆抗體8E1。Elisa和替代中和實驗等方法說明該抗體可以用來靈敏檢測和分析GII.4，更重要的是其還具有強大的中和活性。在描述本發明之前，應當理解本發明不限於所述的具體方法和實驗條件，因為這類方法和條件可以變動。還應當理解本文所用的術語其目的僅在於描述具體實施方案，並且不意圖是限制性的，本發明的範圍將僅由所附的權利要求書限制。除非另外定義，否則本文中所用的全部技術與科學術語均具有如本發明所屬領域的普通技術人員通常理解的相同含義。如本文所用，在提到具體列舉的數值中使用時，術語「約」意指該值可以從列舉的值變動不多於1％。例如，如本文所用，表述「約100」包括99和101和之間的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。雖然在本發明的實施或測試中可以使用與本發明中所述相似或等價的任何方法和材料，本文在此處例舉優選的方法和材料。諾如病毒GII.4諾如病毒GII.4屬於諾如病毒屬GII型，是引起諾如病毒暴發流行的主要病原體。諾如病毒在發達國家和發展中國家均有流行，給各國帶來了嚴重的經濟損失，兒童、老人的健康造成了很大的威脅。到目前為止，沒有上市的預防性疫苗和特效的治療性藥物。本發明利用重組GII.4病毒樣顆粒作為免疫原製備了GII.4單克隆抗體。本發明製備的抗體不僅可以用作實驗室檢測用工具，而且是製備治療性人源化單抗的可靠候選者和開發診斷方法的有用試劑。本發明中使用諾如病毒GII.4VP1製備了病毒樣顆粒，其胺基酸序列為：MASSDANPSDGSAANLVPEVNNEVMALEPVVGAAIAAPVAGQQNVIDPWIRNNFVQAPGGEFTVSPRNAPGEILWSAPLGPDLNPYLSHLARMYNGYAGGFEVQVILAGNAFTAGKVIFAAVPPNFPTEGLSPSQVTMFPHIVVDVRQLEPVLIPLPDVRNNFYHYNQSNDPTIKLIAMLYTPLRANNAGDDVFTVSCRVLTRPSPDFDFIFLVPPTVESRTKPFSVPVLTVEEMTNSRFPIPLEKLFTGPSSAFVVQPQNGRCTTDGVLLGTTQLSPVNICTFRGDVTHITGSRNYTMNLASQNWNNYDPTEEIPAPLGTPDFVGKIQGVLTQTTRTDGSTRGHKATVYTGSADFAPKLGRVQFETDTDHDFEANQNTKFTPVGVIQDGSTTHRNEPQQWVLPSYSGRNTPNVHLAPAVAPTFPGEQLLFFRSTMPGCSGYPNMDLDCLLPQEWVQYFYQEAAPAQSDVALLRFVNPDTGRVLFECKLHKSGYVTVAHTGQHDLVIPPNGYFRFDSWVNQFYTLAPMGNGTGRRRAL(SEQIDNO.:1，GenBankID:KC631827.1)，309位絲氨酸(Ser)突變為天 冬醯胺(Asn)。本發明中使用諾如病毒GI.1VP1製備了病毒樣顆粒，其胺基酸序列為：MASKDATSSVDGASGAGQLVPEVNASDPLAMDPVAGSSTAVATAGQVNPIDPWIINNFVQAPQGEFTISPNNTPGDVLFDLSLGPHLNPFLLHLSQMYNGWVGNMRVRIMLAGNAFTAGKIIVSCIPPGFGSHNLTIAQATLFPHVIADVRTLDPIEVPLEDVRNVLFHNNDRNQQTMRLVCMLYTPLRTGGGTGDSFVVAGRVMTCPSPDFNFLFLVPPTVEQKTRPFTLPNLPLSSLSNSRAPLPISSMGISPDNVQSVQFQNGRCTLDGRLVGTTPVSLSHVAKIRGTSNGTVINLTELDGTPFHPFEGPAPIGFPDLGGCDWHINMTQFGHSSQTQYDVDTTPDTFVPHLGSIQANGIGSGNYVGVLSWISPPSHPSGSQVDLWKIPNYGSSITEATHLAPSVYPPGFGEVLVFFMSKMPGPGAYNLPCLLPQEYISHLASEQAPTVGEAALLHYVDPDTGRNLGEFKAYPDGFLTCVPNGASSGPQQLPINGVFVFVSWVSRFYQLKPVGTASSARGRLGLRR(SEQIDNO.:20，NP_056821.2)抗體如本文所用，術語「抗體」或「免疫球蛋白」是有相同結構特徵的約150000道爾頓的異四聚糖蛋白，其由兩個相同的輕鏈(L)和兩個相同的重鏈(H)組成。每條輕鏈通過一個共價二硫鍵與重鏈相連，而不同免疫球蛋白同種型的重鏈間的二硫鍵數目不同。每條重鏈和輕鏈也有規則間隔的鏈內二硫鍵。每條重鏈的一端有可變區(VH)，其後是多個恆定區。每條輕鏈的一端有可變區(VL)，另一端有恆定區；輕鏈的恆定區與重鏈的第一個恆定區相對，輕鏈的可變區與重鏈的可變區相對。特殊的胺基酸殘基在輕鏈和重鏈的可變區之間形成界面。如本文所用，術語「可變」表示抗體中可變區的某些部分在序列上有所不同，它形成了各種特定抗體對其特定抗原的結合和特異性。然而，可變性並不均勻地分布在整個抗體可變區中。它集中於輕鏈和重鏈可變區中稱為互補決定區(CDR)或超變區中的三個片段中。可變區中較保守的部分稱為構架區(FR)。天然重鏈和輕鏈的可變區中各自包含四個FR區，它們大致上呈β-摺疊構型，由形成連接環的三個CDR相連，在某些情況下可形成部分β摺疊結構。每條鏈中的CDR通過FR區緊密地靠在一起並與另一鏈的CDR一起形成了抗體的抗原結合部位(參見Kabat等,NIHPubl.No.91-3242,卷I，647-669頁(1991))。恆定區不直接參與抗體與抗原的結合，但是它們表現出不同的效應功能，例如參與抗體的依賴於抗體的細胞毒性。脊椎動物抗體(免疫球蛋白)的「輕鏈」可根據其恆定區的胺基酸序列歸為明顯不同的兩類(稱為κ和λ)中的一類。根據其重鏈恆定區的胺基酸序列，免疫球蛋白可以分為不同的種類。主要有5類免疫球蛋白：IgA,IgD,IgE,IgG和IgM，其中一些還可進一步分成亞類(同種型)，如IgG1,IgG2,IgG3,IgG4,IgA和IgA2。對應於不同類免疫球蛋白的重鏈恆定區分別稱為α、δ、ε、γ、和μ。不同類免疫球蛋白的亞單位結構和三維構型是本領域人員所熟知的。如本文所用，術語「單克隆抗體(單抗)」指從一類基本均一的群體獲得的抗體，即該群體中包含的單個抗體是相同的，除少數可能存在的天然發生的突變外。單克隆抗體高特異性地針對單個抗原位點。而且，與常規多克隆抗體製劑(通常是具有針對不同決定簇的不同抗體)不同，各單克隆抗體是針對抗原上的單個決定簇。除了它們的特異性外，單克隆抗體的好處還在於它們是通過雜 交瘤培養來合成的，不會被其它免疫球蛋白汙染。修飾語「單克隆」表示了抗體的特性，是從基本均一的抗體群中獲得的，這不應被解釋成需要用任何特殊方法來生產抗體。本發明還包括具有所述的抗GII.4病毒單克隆抗體的相應胺基酸序列的單克隆抗體、具有所述的抗GII.4病毒單克隆抗體可變區鏈的單克隆抗體，以及具有這些鏈的其他蛋白質或蛋白質偶聯物及融合表達產物。具體地，本發明包括具有含超變區(互補決定區，CDR)的輕鏈和重鏈的任何蛋白質或蛋白質偶聯物及融合表達產物(即免疫偶聯物及融合表達產物)，只要該超變區與本發明的輕鏈和重鏈的超變區相同或至少90％同源性，較佳地至少95％同源性。如本領域技術人員所知，免疫偶聯物及融合表達產物包括：藥物、毒素、細胞因子(cytokine)、放射性核素、酶和其他診斷或治療分子與所述的抗GII.4病毒單克隆抗體或其片段結合的而形成的偶聯物。本發明還包括與所述的抗GII.4病毒單克隆抗體或其片段結合的細胞表面標記物或抗原。本發明不僅包括完整的單克隆抗體，還包括具有免疫活性的抗體片段，如Fab或(Fab')2片段；抗體重鏈；抗體輕鏈。如本文所用，術語「重鏈可變區」與「VH」可互換使用。如本文所用，術語「可變區」與「互補決定區(complementaritydeterminingregion,CDR)」可互換使用。在本發明的一個優選的實施方式中，所述抗體的重鏈可變區包括以下三個互補決定區CDR：CDR1，其胺基酸序列為GYSFTDYYMH(SEQIDNO:8)，其編碼核苷酸序列為，GGTTACTCATTCACTGACTACTACATGCAC(SEQIDNO.:11)；CDR2，其胺基酸序列為YIDPFNGDTGYNQKFKV(SEQIDNO.:9)，其編碼核苷酸序列為，TATATTGATCCTTTCAATGGTGATACTGGCTACAACCAGAAATTCAAGGTC(SEQIDNO.:12)；CDR3，其胺基酸序列為DDWGSPFSY(SEQIDNO.:10)，其編碼核苷酸序列為，GATGACTGGGGATCCCCGTTTTCTTAC(SEQIDNO.:13)。在另一優選例中，所述重鏈可變區的胺基酸序列為：EIQLQQSGPELMKPGASVKISCKASGYSFTDYYMHWVKQSHGKSLEWIGYIDPFNGDTGYNQKFKVRATLTVDESSTTAYMHLSSLTSDDSAVYYCARDDWGSPFSYWGQGTLVTVSA(SEQIDNO.:6)。在本發明的一個優選的實施方式中，所述抗體的重鏈包括上述重鏈可變區和重鏈恆定區，所述重鏈恆定區可以為鼠源或人源。在另一優選例中，所述抗體的重鏈胺基酸序列為：MGWSWIFLFLLSGTAGVHSEIQLQQSGPELMKPGASVKISCKASGYSFTDYYMHWVKQSHGKSLEWIGYIDPFNGDTGYNQKFKVRATLTVDESSTTAYMHLSSLTSDDSAVYYCARDDWGSPFSYWGQGTLVTVSAAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENCKNTQPIMDTDGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK(SEQIDNO.:3)如本文所用，術語「輕鏈可變區」與「VL」可互換使用。在本發明的一個優選的實施方式中，根據本發明的抗體的輕鏈可變區，具有選自下組的互補決定區CDR：CDR1'，其胺基酸序列為RASHDIGSNLD(SEQIDNO:14)，其編碼核苷酸序列為，CGGGCAAGTCATGACATTGGTAGTAACTTAGAC(SEQIDNO.:17)；CDR2'，其胺基酸序列為ATSTLDS(SEQIDNO:15)，其編碼核苷酸序列為，GCCACATCCACTTTAGATTCT(SEQIDNO.:18)CDR3'，其胺基酸序列為LQYASSPRT(SEQIDNO:16)，其編碼核苷酸序列為，CTACAATATGCTAGTTCTCCTCGGACG(SEQIDNO.:19)在另一優選例中，所述的輕鏈可變區的胺基酸序列為：DIQMTQSPSSLSASLGESVSLTCRASHDIGSNLDWLQQEPDGTIKRLIYATSTLDSGVPKRFSGSRSGSDYSLTISSLESEDFVEYYCLQYASSPRTFGGGTKLEIK(SEQIDNO.:7)。在本發明的一個優選的實施方式中，所述抗體的輕鏈包括上述輕鏈可變區和輕鏈恆定區，所述輕鏈恆定區可以為鼠源或人源。在另一優選例中，所述抗體的輕鏈胺基酸序列為：MRAAAQIFGFLLLLFPGTRCDIQMTQSPSSLSASLGESVSLTCRASHDIGSNLDWLQQEPDGTIKRLIYATSTLDSGVPKRFSGSRSGSDYSLTISSLESEDFVEYYCLQYASSPRTFGGGTKLEIKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC(SEQIDNO.:5)在本發明中，術語「本發明抗體」、「本發明蛋白」、或「本發明多肽」可互換使用，都指特異性結合抗GII.4病毒的抗體，例如具有重鏈(如SEQIDNO.:3的胺基酸序列)和/或輕鏈(如SEQIDNO.:5的胺基酸序列)的蛋白或多肽。它們可含有或不含起始甲硫氨酸。在另一優選例中，所述的抗體為抗抗GII.4病毒的鼠或人鼠嵌合單克隆抗體，它的重鏈恆定區和/或輕鏈恆定區可以是人源化的重鏈恆定區或輕鏈恆定區。更優選地，所述的人源化的重鏈恆定區或輕鏈恆定區為人IgG1、IgG2等的重鏈恆定區或輕鏈恆定區。本發明還提供了具有本發明抗體的其他蛋白質或融合表達產物。具體地，本發明包括具有含可變區的重鏈和輕鏈的任何蛋白質或蛋白質偶聯物及融合表達產物(即免疫偶聯物及融合表達產物)，只要該可變區與本發明抗體的重鏈和輕鏈的可變區相同或至少90％同源性，較佳地至少95％同源性。一般，抗體的抗原結合特性可由位於重鏈和輕鏈可變區的3個特定的區域來描述，稱為可變區域(CDR)，將該段間隔成4個框架區域(FR)，4個FR的胺基酸序列相對比較保守，不直接參與結合反應。這些CDR形成環狀結構，通過其間的FR形成的β摺疊在空間結構上相互靠近，重鏈上的CDR和相應輕鏈上的CDR構成了抗體的抗原結合位點。可以通過比較同類型的抗體的胺基酸序列來確定是哪些胺基酸構成了FR或CDR區域。本發明抗體的重鏈和/或輕鏈的可變區特別令人感興趣，因為它們中至少部分涉及結合抗原。因此，本發明包括那些具有帶CDR的單克隆抗體輕鏈和重鏈可變區的分子，只要其CDR與此處鑑定的CDR具有90％以上(較佳地95％以上， 最佳地98％以上)的同源性。本發明不僅包括完整的單克隆抗體，還包括具有免疫活性的抗體的片段或抗體與其他序列形成的融合蛋白。因此，本發明還包括所述抗體的片段、衍生物和類似物。如本文所用，術語「片段」、「衍生物」和「類似物」是指基本上保持本發明抗體相同的生物學功能或活性的多肽。本發明的多肽片段、衍生物或類似物可以是(i)有一個或多個保守或非保守性胺基酸殘基(優選保守性胺基酸殘基)被取代的多肽，而這樣的取代的胺基酸殘基可以是也可以不是由遺傳密碼編碼的，或(ii)在一個或多個胺基酸殘基中具有取代基團的多肽，或(iii)成熟多肽與另一個化合物(比如延長多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的胺基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前導序列或分泌序列或用來純化此多肽的序列或蛋白原序列，或與6His標籤形成的融合蛋白)。根據本文的教導，這些片段、衍生物和類似物屬於本領域熟練技術人員公知的範圍。本發明抗體指具有抗GII.4病毒結合活性的、包括上述CDR區的多肽。該術語還包括具有與本發明抗體相同功能的、包含上述CDR區的多肽的變異形式。這些變異形式包括(但並不限於)：一個或多個(通常為1-50個，較佳地1-30個，更佳地1-20個，最佳地1-10個)胺基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個或數個(通常為20個以內，較佳地為10個以內，更佳地為5個以內)胺基酸。例如，在本領域中，用性能相近或相似的胺基酸進行取代時，通常不會改變蛋白質的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個或數個胺基酸通常也不會改變蛋白質的功能。該術語還包括本發明抗體的活性片段和活性衍生物。該多肽的變異形式包括：同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導突變體、在高或低的嚴緊度條件下能與本發明抗體的編碼DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用抗本發明抗體的抗血清獲得的多肽或蛋白。本發明還提供了其他多肽，如包含人抗體或其片段的融合蛋白。除了幾乎全長的多肽外，本發明還包括了本發明抗體的片段。通常，該片段具有本發明抗體的至少約50個連續胺基酸，較佳地至少約50個連續胺基酸，更佳地至少約80個連續胺基酸，最佳地至少約100個連續胺基酸。在本發明中，「本發明抗體的保守性變異體」指與本發明抗體的胺基酸序列相比，有至多10個，較佳地至多8個，更佳地至多5個，最佳地至多3個胺基酸被性質相似或相近的胺基酸所替換而形成多肽。這些保守性變異多肽最好根據表A進行胺基酸替換而產生。表A本發明還提供了編碼上述抗體或其片段或其融合蛋白的多核苷酸分子。本發明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因組DNA或人工合成的DNA。DNA可以是單鏈的或是雙鏈的。DNA可以是編碼鏈或非編碼鏈。編碼成熟多肽的編碼區序列可以與SEQIDNO.:2、或4所示的編碼區序列相同或者是簡併的變異體。如本文所用，「簡併的變異體」在本發明中是指編碼具有與本發明的多肽相同的胺基酸序列，但與SEQIDNO.:3、5、6、7、8、9、10、14、15、16所示的編碼區序列有差別的核酸序列。編碼本發明的成熟多肽的多核苷酸包括：只編碼成熟多肽的編碼序列；成熟多肽的編碼序列和各種附加編碼序列；成熟多肽的編碼序列(和任選的附加編碼序列)以及非編碼序列。術語「編碼多肽的多核苷酸」可以是包括編碼此多肽的多核苷酸，也可以是還包括附加編碼和/或非編碼序列的多核苷酸。本發明還涉及與上述的序列雜交且兩個序列之間具有至少50％，較佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本發明特別涉及在嚴格條件下與本發明所述多核苷酸可雜交的多核苷酸。在本發明中，「嚴格條件」是指：(1)在較低離子強度和較高溫度下的雜交和洗脫，如0.2×SSC,0.1％SDS,60℃；或(2)雜交時加有變性劑,如50％(v/v)甲醯胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)僅在兩條序列之間的相同性至少在90％以上,更好是95％以上時才發生雜交。並且,可雜交的多核苷酸編碼的多肽與SEQIDNO.:12和/或SEQIDNO.:22所示的成熟多肽有相同的生物學功能和活性。本發明的抗體的核苷酸全長序列或其片段通常可以用PCR擴增法、重組法或人工合成的方法獲得。一種可行的方法是用人工合成的方法來合成有關序列，尤其是片段長度較短時。通常，通過先合成多個小片段，然後再進行連接可獲得序列很長的片段。此外，還可將重鏈的編碼序列和表達標籤(如6His)融合在一起，形成融合蛋白。一旦獲得了有關的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關序列。這通 常是將其克隆入載體，再轉入細胞，然後通過常規方法從增殖後的宿主細胞中分離得到有關序列。本發明所涉及的生物分子(核酸、蛋白等)包括以分離的形式存在的生物分子。目前，已經可以完全通過化學合成來得到編碼本發明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然後可將該DNA序列引入本領域中已知的各種現有的DNA分子(或如載體)和細胞中。此外，還可通過化學合成將突變引入本發明蛋白序列中。本發明還涉及包含上述的適當DNA序列以及適當啟動子或者控制序列的載體。這些載體可以用於轉化適當的宿主細胞，以使其能夠表達蛋白質。宿主細胞可以是原核細胞，如細菌細胞；或是低等真核細胞，如酵母細胞；或是高等真核細胞，如哺乳動物細胞。代表性例子有：大腸桿菌，鏈黴菌屬；鼠傷寒沙門氏菌的細菌細胞；真菌細胞如酵母；果蠅S2或Sf9的昆蟲細胞；CHO、COS7、293細胞的動物細胞等。用重組DNA轉化宿主細胞可用本領域技術人員熟知的常規技術進行。當宿主為原核生物如大腸桿菌時，能吸收DNA的感受態細胞可在指數生長期後收穫，用CaCl2法處理，所用的步驟在本領域眾所周知。另一種方法是使用MgCl2。如果需要，轉化也可用電穿孔的方法進行。當宿主是真核生物，可選用如下的DNA轉染方法：磷酸鈣共沉澱法，常規機械方法如顯微注射、電穿孔,脂質體包裝等。獲得的轉化子可以用常規方法培養，表達本發明的基因所編碼的多肽。根據所用的宿主細胞，培養中所用的培養基可選自各種常規培養基。在適於宿主細胞生長的條件下進行培養。當宿主細胞生長到適當的細胞密度後，用合適的方法(如溫度轉換或化學誘導)誘導選擇的啟動子，將細胞再培養一段時間。在上面的方法中的重組多肽可在細胞內、或在細胞膜上表達、或分泌到細胞外。如果需要，可利用其物理的、化學的和其它特性通過各種分離方法分離和純化重組的蛋白。這些方法是本領域技術人員所熟知的。這些方法的例子包括但並不限於：常規的復性處理、用蛋白沉澱劑處理(鹽析方法)、離心、滲透破菌、超處理、超離心、分子篩層析(凝膠過濾)、吸附層析、離子交換層析、高效液相層析(HPLC)和其它各種液相層析技術及這些方法的結合。本發明的抗體可以單獨使用，也可與可檢測標記物(為診斷目的)、治療劑、PK(蛋白激酶)修飾部分或任何以上這些物質的組合結合或偶聯。用於診斷目的的可檢測標記物包括但不限於：螢光或發光標記物、放射性標記物、MRI(磁共振成像)或CT(電子計算機X射線斷層掃描技術)造影劑、或能夠產生可檢測產物的酶。本發明還提供了一種組合物。在優選例中，所述的組合物是藥物組合物，它含有上述的抗體或其活性片段或其融合蛋白，以及藥學上可接受的載體。通常，可將這些物質配製於無毒的、惰性的和藥學上可接受的水性載體介質中，其中pH通常約為5-8，較佳地pH約為6-8，儘管pH值可隨被配製物質的性質以及待治療的病症而有所變化。配製好的藥物組合物可以通過常規途徑進行給藥，其中包括(但並不限於)：瘤內、腹膜內、靜脈內、或局部給藥。本發明的藥物組合物可直接用於結合GII.4病毒樣顆粒，因而可用於預防和治療諾如病毒(NoVs)是導致急性腸胃炎。此外，還可同時使用其他治療劑。本發明的藥物組合物含有安全有效量(如0.001-99wt％,較佳地0.01-90wt％，更佳地0.1-80wt％)的本發明上述的單克隆抗體(或其偶聯物)以及藥學上可接受的載體或賦形劑。這類載體包括(但並不限於)：鹽水、緩衝液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其組合。藥物製劑應與給藥方式相匹配。本發明的藥物組合物可以被製成針劑形式，例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過常規方法進行製備。藥物組合物如針劑、溶液宜在無菌條件下製造。活性成分的給藥量是治療有效量，例如每天約1微克/千克體重-約5毫克/千克體重。此外，本發明的多肽還可與其他治療劑一起使用。使用藥物組合物時，是將安全有效量的免疫偶聯物施用於哺乳動物，其中該安全有效量通常至少約10微克/千克體重，而且在大多數情況下不超過約8毫克/千克體重，較佳地該劑量是約10微克/千克體重-約1毫克/千克體重。當然，具體劑量還應考慮給藥途徑、病人健康狀況等因素，這些都是熟練醫師技能範圍之內的。雜交瘤細胞株本發明還提供了可生產本發明針對抗GII.4病毒單克隆抗體的雜交瘤細胞株；優選的，本發明提供了高效價的針對抗GII.4病毒單克隆抗體的雜交瘤細胞株。在獲得生產本發明的抗GII.4病毒單克隆抗體的雜交瘤之後，本領域技術人員可以方便地利用該雜交瘤細胞株製備抗體。此外，本領域技術人員還可很方便地獲知本發明的抗體的結構(比如抗體的重鏈可變區和輕鏈可變區)，然後可通過重組方法來製備本發明的單克隆抗體。單克隆抗體的製備本發明的抗體可以通過本領域內技術人員已知的各種技術進行製備。例如，本發明抗原，可被施用於動物以誘導單克隆抗體的產生。對於單克隆抗體，可利用雜交瘤技術來製備(見Kohler等人,Nature256；495,1975；Kohler等人,Eur.J.Immunol.6:511,1976；Kohler等人,Eur.J.Immunol.6:292,1976；Hammerling等人,InMonoclonalAntibodiesandTCellHybridomas,Elsevier,N.Y.,1981)或可用重組DNA法(美國專利號4,816,567)製備。代表性的骨髓瘤細胞是有效融合、通過選擇的抗體產生細胞支持抗體的穩定高水平產生、且對培養基(HAT培養基基質)敏感的那些骨髓瘤細胞，包括骨髓瘤細胞株，例如鼠類的骨髓瘤細胞株，包括衍生自MOPC-21和MPC-11小鼠腫瘤的骨髓瘤細胞株(可購自SalkInstituteCellDistributionCenter，聖地牙哥，加利福尼亞，美國)以及SP-2、NZ0或X63-Ag8-653細胞(可購自AmericanTypeCultureCollection，洛克維爾，馬裡蘭，美國)。人骨髓瘤和小鼠-人雜合骨髓瘤細胞株也已被描述用於產生人單克隆抗體[Kozbor，J.Immunol.，133：3001(1984)；Brodeur等，單克隆抗體的生產技術和應用(MonoclonalAntibodiesProductionTechniquesandApplications)，51-63頁(MarcelDekker，Inc.，紐約，1987)]。對雜交瘤細胞生長於其中的培養基進行分析以檢測具有所需特異性的單 克隆抗體的產生，如，通過體外結合分析例如，酶聯免疫吸附分析(ELISA)或放射免疫分析(RIA)。表達抗體的細胞的位置可用FACS進行檢測。然後，可將雜交瘤克隆通過有限稀釋步驟形成亞克隆(subcloned)，並通過標準方法生長(Goding，單克隆抗體(MonoclonalAntibodies)：原則和實踐(PrinciplesandPractice)，AcademicPress(1986)59-103頁)。為了達到這一目的而使用的適合的培養基包括，例如，DMEM或RPMI-1640培養基。此外，雜交瘤細胞可在動物體內作為腹水瘤生長。由亞克隆分泌的單克隆抗體從培養基、腹水或血清中通過常規的免疫球蛋白純化工藝適當地得到分離，這些純化工藝為例如，蛋白A-瓊脂糖法(proteinA-Sepharose)、羥基磷灰石層析、凝膠電泳、透析或親和層析。本發明提供了一種針對GII.4病毒的單克隆抗體。在本發明的一個優選的方案中，單克隆抗體採用培養雜交瘤細胞方法製備。取雜交瘤細胞培養的上清液，經飽和硫酸銨沉澱法粗提出IgG,再將粗提的抗體經親和層析柱(ProteinG-Sephrose)純化。本發明的一個優選的方案中，單克隆抗體採用Balb/C小鼠腹水生產單克隆抗體的方法製備。將約雜交瘤細胞接種到致敏的小鼠腹腔內，10天左右可見腹部明顯脹大。抽取腹水，經飽和硫酸銨沉澱法粗提後,再將粗提的抗體經親和層析柱(ProteinG-Sephrose)純化。標記的免疫球蛋白(抗體)在本發明的一個優選例中，所述免疫球蛋白帶有可檢測標記物。更佳地，所述的標記物選自下組：膠體金標記物、辣根過氧化物酶標記、有色標記物或螢光標記物。膠體金標記可採用本領域技術人員已知的方法進行。在本發明的一個優選的方案中，抗GII.4病毒的單克隆抗體用膠體金標記，得到膠體金標記的單克隆抗體。本發明的抗GII.4病毒單克隆抗體具有很好的特異性，很高的效價。檢測板及其材料本發明的檢測板可採用本領域常用的檢測板材料，採用常規的檢測板製備方法製成。本發明檢測GII.4病毒的免疫檢測板，包括測試條和支撐測試條的支撐板，如可採用PVC聚脂膠板等；所述的測試條由濾樣紙、層析材料、硝酸纖維素膜和吸水紙依次搭接組成，搭接部位可以採用常規的方法，如膠帶等固定連接；其中：層析材料預包被膠體金標記或有色標記的抗GII.4病毒單克隆抗體或多克隆抗體，優選被膠體金標記的抗GII.4病毒單克隆抗體，硝酸纖維素膜上吸附檢測線和質控線；在一個優選的方案中：層析材料上預包被膠體金標記的抗GII.4病毒單克隆抗體是採用濃度為0.5-1.5mg/ml膠體金標記的抗GII.4病毒單克隆抗體溶液進行預包被的，包被量為50μl/cm2；優選的濃度為0.5或1.5mg/ml，50μl/cm2；檢測方法與結果判定平放檢測板，將試樣滴在濾樣紙上，試樣約120μl，3～5min內觀察層析結果。根據出現的條紋位置來判斷結果。陰性：質控區、檢測區均出現明顯的色帶，示為陰性；陽性：只在質控區出現明顯色帶，而在檢測區無色帶，示為陽性；無效：質控區、檢測區無任何色帶或在質控區未出現色帶而在檢測區出現色帶，表明檢測方法錯誤或檢測板變質或失效，應重新換取檢測板檢測。方法和樣本本發明涉及用於在以細胞和/或組織溶解的樣本檢測諾如病毒的方法。該方法步驟大致如下：獲得細胞和/或組織樣本；將樣本溶解在介質中；檢測在所述溶解的樣本中GII.4病毒的水平。本發明方法所使用的樣本可以是存在於細胞保存液中的包括細胞的任何樣本，正如在液基細胞檢測法中所使用的。試劑盒本發明還提供了一種指含有本發明的抗體(或其片段)或本發明的檢測板的試劑盒，在本發明的一個優選例中，所述的試劑盒還包括容器、使用說明書、緩衝劑等。本發明進一步設計用於檢測GII.4病毒水平的檢測試劑盒，該試劑盒包括識別抗GII.4病毒的抗體，用於溶解樣本的裂解介質，檢測所需的通用試劑和緩衝液，如各種緩衝液、檢測標記、檢測底物等。該檢測試劑盒可以是體外診斷裝置。本發明進一步設計開發用於對來自溶液樣本的GII.4病毒感染相關情況診斷評估的試劑盒，該試劑盒可以檢測存在於樣本溶液中的GII.4病毒，其中保存樣本的細胞保存液可以是諸如液基細胞檢測法中的細胞保存液。本發明的抗GII.4病毒單克隆抗體具有高親和力、高特異性等優點，可廣泛應用在製備GII.4病毒的檢測領域，如檢測試劑或檢測設備的製備領域等，在特異性、靈敏度和檢測率等方面較之傳統的檢測方法或檢測試劑具有顯著的優勢。本發明的主要優點在於：(1)本發明的單克隆抗體8E1能夠特異性的識別諾如病毒樣顆粒；(2)本發明的單克隆抗體8E1能夠特異性的結合諾如病毒GII.4，與諾如病毒GI.1無交叉反應，從而實現對諾如病毒GI.1和諾如病毒GII.4的鑑定。(3)本發明的單克隆抗體8E1對諾如病毒具有強大的中和活性。下面結合具體實施例，進一步詳陳本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。下列實施例中未註明詳細條件的實驗方法，通常按照常規條件如Sambrook等人，分子克隆：實驗室手冊(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的條件，或按照製造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數按重量計算。以下實施例中所用 的實驗材料和試劑如無特別說明均可從市售渠道獲得。材料和方法1抗原製備及小鼠免疫利用杆狀病毒-昆蟲表達系統，通過表達諾如病毒GII.4VP1製備了病毒樣顆粒[1]。將10ug的病毒樣顆粒(50ul體積)與等體積的鋁佐劑(500ug)混合後腹腔免疫6周雌性Balb/c小鼠，在0周、2周、4周各免疫一次。在第6周時，採取小鼠血清檢測中和滴度。第7周時，中和滴度最高的一隻小鼠通過尾靜脈加強免疫15ugGII.4病毒樣顆粒。3天後，取小鼠脾臟用於製備雜交瘤細胞。2雜交瘤細胞株的製備和篩選小鼠尾靜脈加強免疫3天後，取小鼠脾臟細胞與骨髓瘤細胞SP2/0通過PEG1500融合，製備雜交瘤細胞。9天之後，通過酶聯免疫吸附試驗篩選特異性分泌針對GII.4病毒樣顆粒的抗體。簡言之，GII.4病毒樣顆粒包被96孔板，每孔100ng，4℃包被過夜，用含有5％脫脂牛奶的PBST封閉，每孔加50ul雜交瘤培養液在37℃孵育2小時，接著用HRP標記的二抗(sigma)孵育1小時，最後進行顯色反應，讀取OD450的吸光值。3腹水製備和抗體純化雌性Balb/c小鼠腹腔注射500ul液體石蠟油，兩周後，每隻小鼠腹腔注射30萬個雜交瘤細胞。7天後，12號針頭收集腹水，10,000rpm離心10min，去除上層油脂和下層沉澱，取澄清的腹水進行抗體純化。根據說明書，利用HiTrapHiTrapTMProteinG親和柱(GEhealthcare)純化腹水獲得抗體。4酶聯免疫吸附實驗鑑定單克隆抗體用每孔100ngGI.1或GII.4病毒樣顆粒4℃過夜包被96孔Elisa板，鑑定單抗的結合能力。Elisa板經含5％脫脂牛奶的PBST在37℃封閉1個小時後，按每孔50ul將不同濃度(5ug/ml、2.5ug/ml、1.25ug/ml和0.625ug/ml)加入單抗37℃孵育2小時，接著用HRP標記的抗鼠二抗進行孵育，最後讀取吸光值OD450。5聚丙烯醯胺凝膠電泳和westernblot分析蛋白樣品與SDS-PAG上樣緩衝液混合後，煮沸處理10min，經12％聚丙烯醯胺凝膠分離蛋白樣品。通過考馬斯亮藍染色顯示蛋白條帶或者將蛋白轉移到PVDF膜上進行westernblot分析。單克隆抗體按最終濃度1ug/ml稀釋到含1％脫脂牛奶的PBST中。鼠抗GII.4多克隆抗體1:1000稀釋使用，接著用HPR標記的鼠二抗(sigma)進行孵育，最後用LAS-400發光圖像分析儀進行記錄。6兔抗GI.1病毒樣顆粒或GII.4病毒樣顆粒多克隆抗體的製備GI.1病毒樣顆粒或GII.4病毒樣顆粒與弗氏完全佐劑等體積混合充分乳化，皮下注射健康兔子150ug/只。3周和6周後將150ug的GI.1病毒樣顆粒 或GII.4病毒樣顆粒與等量弗氏不完全佐劑佐劑混合，充分乳化後進行加強免疫。最後一次免疫後2周收集血清，分裝後-80℃保存備用。7夾心Elisa檢測GI.1和GII.4病毒樣顆粒分別用兔抗GI.1病毒樣顆粒的多抗血清(製備方法同上)和兔抗GII.4病毒樣顆粒的多抗血清(製備方法同上)1:5000稀釋度(50ul/孔)4℃過夜包被96孔Elisa板，Elisa板經含5％脫脂牛奶的PBST在37℃封閉2個小時後，將病毒樣顆粒加入Elisa板中，40ng/50ul/孔始起，2倍比稀釋12個濃度，37℃孵育2個小時，然後將病毒樣顆粒特異的單抗10ng/50ul/孔37℃孵育1小時，接著用HPR標記的鼠二抗進行孵育，最後讀取吸光值OD450。8體外替代中和實驗用10ug/ml的豬胃粘液素Ⅲ(PGM)(上海遠慕生物科技有限公司)(50ul/孔)室溫包被96孔Elisa板，Elisa板經含5％脫脂牛奶的PBST在4℃封閉過夜後備用。將GII.4病毒樣顆粒特異性單抗8ug/ml始起，2倍比稀釋，與等體積0.5ug/ml的GII.4病毒樣顆粒室溫孵育1個小時後加到包被有PGM的96孔Elisa板上，室溫孵育1個小時，然後加入兔抗GII.4病毒樣顆粒多克隆抗體(製備方法同上)1:1000稀釋液37℃孵育1小時，接著用HPR標記的兔二抗(sigma)進行孵育，最後讀取吸光值OD450。9單克隆抗體的基因序列擴增及表達載體的構建先將雜交瘤細胞株的細胞用Trizol試劑提取總RNA，然後按照5』RACE試劑盒說明書擴增出重鏈和輕鏈全長基因。利用PCR擴增的方法在重鏈和輕鏈的5』端和3』端分別引入HindIII和EcoRI酶切位點，並將擴增出來的重鏈和輕鏈全的基因分別克隆到pGEM-T(Promage)中，篩選出陽性克隆測序，然後將序列正確的克隆用HindIII和EcoRI雙酶切，經瓊脂糖凝膠電泳純化出目的片段後，與同酶切的質粒pcDNA3.1(Promage)用T4DNA連接酶連接，構建成真核表達載體pcDNA3.1-(m8E1H)和pcDNA3.1-(m8E1L)。10單克隆抗體基因的重組表達鑑定利用脂質體的方法共轉染pcDNA3.1-(m8E1H)和pcDNA3.1-(m8E1L)到CHO細胞，72小時後收取培養上清進行分析，採用ELISA確定培養上清中的抗體的表達：用GI.1病毒樣顆粒包板，用含5％牛奶的PBST於37℃封閉1小時，加入不同稀釋度的待測培養上清37℃孵育2小時，接著用HRP標記的抗鼠IgG二抗進行孵育，最後讀取吸光值OD450。實施例1分泌GII.4特異抗體的雜交瘤細胞的篩選免疫了GII.4病毒樣顆粒小鼠的脾臟細胞用來製備雜交瘤細胞。通過Elisa實驗篩選雜交瘤細胞上清，從而獲得能夠分泌具有結合病毒能力的雜交瘤細胞株。最終，五株具有優異結合能力的單抗被篩選出來，他們都能夠結合GII.4病 毒樣顆粒。亞型鑑定顯示，G9、D11、7D8和8E1屬IgG1，2D8屬IgG3。表1.分泌單抗的雜交瘤細胞株鑑定雜交瘤細胞株重鏈輕鏈與GII.4VLP結合能力*G9IgG1kappa+++D11IgG1kappa+++2D8IgG3kappa+++7D8IgG1kappa+++8E1IgG1kappa+++用於分析的樣品均為50ul雜交瘤培養細胞。*,+：OD450nm＞0.15；++：OD450nm＞0.3；+++：OD450nm＞0.5。實施例2抗GII.4單抗的特異性分析首先通過SDS-PAGE鑑定從腹水中純化的GII.4單抗的純度和完整性。圖1顯示了五種單抗的重鏈和輕鏈分別為50KD和25KD左右。接著，通過Elisa方法檢測了單抗與不同抗原的反應活性，包括GI.1病毒樣顆粒和GII.4病毒樣顆粒。圖2顯示G9、D11、2D8和8E1可以特異性識別GII.4病毒樣顆粒，不存在與GI.1病毒樣顆粒的交叉反應，而有些單抗(如，7D8)，同時與GI.1病毒樣顆粒和GII.4病毒樣顆粒結合，無法特異性識別GII.4病毒。最後，通過Westernblot分析單抗與GII.4的結合情況，圖3顯示，五種抗體中：D11、G9和8E1能夠識別天然結構的GII.4病毒樣顆粒，不能夠識別變性後的GII.4病毒樣顆粒，提示D11、G9和8E1識別的表位可能是構象表位。實施例3基於單抗的夾心Elisa可以特異靈敏地檢測到GI.1和GII.4病毒樣顆粒通過夾心Elisa測定單抗對病毒樣顆粒的最低檢出限度(當OD450nm＞0.15時，判為陽性)。圖4顯示了G9、D11、7D8和8E1單抗均可特異靈敏地檢測到GII.4病毒樣顆粒，最低檢出限度分別為：0.3125ng、0.3125ng、0.3125ng、0.625ng。實施例4單克隆抗體的潛在中和活性組織血型抗原(HBGA)是存在於黏膜組織和紅細胞上的糖類，是諾如病毒感染所需的受體。HBGA的結合抑制試驗被廣泛用作為抗體介導的諾如病毒的替代中和試驗。豬胃粘液素Ⅲ(PGM)中含有HBGA，已經被驗證可以用於替代中和試驗[2]。通過替代中和試驗分別對G9、D11、2D8、7D8和8E1五種單抗的潛在中和活性進行檢測。圖5顯示，D11、G9和8E1對GII.4顯示了良好的中和活性，它們阻止病毒樣顆粒與PGM結合的EC50分別是：0.0979ug/ml、0.6948ug/ml和0.04357ug/ml。上述結果表明，8E1對GII.4中和活性要遠優於其它的抗體株，8E1單抗對GII.4的中和活性是D11抗體株的兩倍多，是G9抗體株的16倍左右。實施例5單克隆抗體的基因序列分析克隆出來的8E1的單抗的重鏈和輕鏈序列如下(其中，單下劃線部分為信號肽序列，斜體部分為可變區序列，為恆定區序列)：8E1單抗重鏈核苷酸序列：ATGGGATGGAGCTGGATCTTTCTCTTCCTTCTGTCAGGAACTGCAGGTGTCCACTCT(SEQIDNO.:2)8E1單抗重鏈胺基酸序列：MGWSWIFLFLLSGTAGVHS(SEQIDNO.:3)8E1單抗輕鏈核苷酸序列：ATGAGGGCTGCTGCACAGATTTTTGGCTTCTTGTTGCTCTTGTTTCCAGGTACCAGATGT(SEQIDNO.:4)8E1單抗輕鏈胺基酸序列：MRAAAQIFGFLLLLFPGTRC(SEQIDNO.:5)進一步分析8E1單抗重鏈可變區和輕鏈可變區序列，8E1單抗重鏈可變區胺基酸如下(下劃線標註的為重鏈CDR區)：EIQLQQSGPELMKPGASVKISCKASGYSFTDYYMHWVKQSHGKSLEWIGYIDPFNGDTGYNQKFKVRATLTVDESSTTAYMHLSSLTSDDSAVYYCARDDWGSPFSYWGQGTLVTVSA(SEQIDNO.:6)上述重鏈可變區屬於IGHV1亞群。8E1單抗輕鏈可變區胺基酸如下(下劃線標註的為重鏈CDR區)：DIQMTQSPSSLSASLGESVSLTCRASHDIGSNLDWLQQEPDGTIKRLIYATSTLDSGVPKRFSGSRSGSDYSLTISSLESEDFVEYYCLQYASSPRTFGGGTKLEIK(SEQIDNO.:7)上述輕鏈可變區屬於IGKV9亞群。各CDR區胺基酸序列和核苷酸序列總結於表2。表2實施例6單克隆抗體基因的重組表達及鑑定為了驗證所克隆出的8E1單抗的基因是否正確，將重鏈和輕鏈的編碼序列分別插入到pcDNA3.1中，構建表達載體pcDNA3.1-(m8E1H)和pcDNA3.1-(m8E1L)，然後共轉染CHO細胞，並通過ELISA檢測細胞上清中是否有特異性結合GII.4病毒樣顆粒 的抗體存在。圖6顯示，表達8E1單抗序列的細胞上清有很高的結合信號，而且與上清的稀釋倍數相關；而沒有轉染相關質粒的對照細胞的上清不管是否稀釋都沒有結合信號。該結果說明了本發明的8E1單抗能夠成功地在宿主細胞中表達。討論本發明獲得了能特異結合GII.4病毒顆粒的單克隆抗體8E1，其具有強大的潛在中和活性，可以經過人源化後用作治療性單克隆抗體藥物或用作檢測試劑。通過夾心ELISA檢測，單克隆抗體8E1對GII.4病毒樣顆粒的最低檢出限度為0.625ng，這為將這些單克隆抗體開發成諾如病毒檢測試劑盒提供了有利的理論依據。而本發明所得到的針對GII.4的單克隆抗體8E1對GII.4和PGM的相互作用的EC50為：0.04357ug/ml，遠優於其它的單克隆抗體。而且，Western顯示8E1單抗識別的表位為構象表位，這使得8E1隻能識別空間構象正確的病毒顆粒，而不能識別解聚的和變性的病毒顆粒，能夠用於可靠地病毒顆粒定量。在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之後，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落於本申請所附權利要求書所限定的範圍。參考文獻1.Huhti,L.,etal.,AcomparisonofmethodsforpurificationandconcentrationofnorovirusGII-4capsidvirus-likeparticles.ArchVirol,2010.155(11):p.1855-82.Lindesmith,L.C.,etal.,ImmunogeneticmechanismsdrivingnorovirusGII.4antigenicvariation.PLoSPathog,2012.8(5):p.e1002705.當前第1頁1&nbsp2&nbsp3&nbsp