一種利用氯化氨溶液從螺旋藻中提取藻藍蛋白的方法與流程
2023-05-23 10:05:01 2
本發明涉及天然產物提取技術領域，尤其涉及一種利用氯化氨溶液從螺旋藻中提取藻藍蛋白的方法。
背景技術：
藻藍蛋白(phycocyanin，PC)是一種存在於藍藻細胞內的光合色素，能高效捕獲光能。因其水溶性、無毒、清亮且著色力強等優點，藻藍蛋白被廣泛用於食品著色劑和化妝品的添加劑。藻藍蛋白帶有螢光，可用作螢光標記物。藻藍蛋白在抗腫瘤和提高機體免疫力方面有明顯療效。
現有涉及藻藍蛋白提取純化方法中，藻藍蛋白分離純化過程主要包括使用低溫(-20℃～-10℃)反覆凍融方法或冰粉(-50℃～-10℃)破除螺旋藻的細胞壁，加入磷酸鹽緩衝液分離提取藻藍蛋白粗提物，使用冷凍高速離心方法進行固液分離，獲得上清液加入硫酸銨溶液鹽析沉澱，脫鹽過大孔樹脂柱或色譜柱進一步純化，洗脫液脫鹽處理後經過凍幹或者噴霧乾燥獲得高純度的藻藍蛋白粉。上述工藝主要的問題在於工藝路線長，大部分過程需要在低溫處理能耗高，提取周期長，造成生產效率太低，成本過高，生產應用價值不高。
技術實現要素：
本發明的目的在於提供一種利用氯化氨溶液從螺旋藻中提取藻藍蛋白的方法。本發明提供的方法無需低溫處理，工藝簡單，通過氯化氨溶液快速分離提取藻藍蛋白工藝，提取收率高，藻藍蛋白純度(A620/A280)可達3.8以上。
本發明提供了一種利用氯化氨溶液從螺旋藻中提取藻藍蛋白的方法，包括以下步驟：
1)將螺旋藻進行酶解破壁，得到破壁螺旋藻；
2)將所述破壁螺旋藻與氯化銨溶液混合，將藻藍蛋白萃取到氯化銨溶液中，超濾得到藻藍蛋白上清液；
3)採用磷酸銨溶液對所述藻藍蛋白上清液進行鹽析，將得到的鹽析產物脫鹽後乾燥，得到藻藍蛋白。
優選的是，所述螺旋藻在光反應器培養得到，所述酶解破壁前將培養得到的螺旋藻進行陶瓷膜過濾；
所述陶瓷膜過濾的溫度為20～30℃，切向流速為3～5m/s，過膜壓力為0.6～0.9bar。
優選的是，所述步驟1)酶解破壁用酶為複合酶，所述複合酶包括纖維素酶、果膠酶和溶菌酶；所述酶解時間為3～5h，所述酶解溫度為30～40℃。
優選的是，所述步驟2)破壁螺旋藻與氯化銨溶液的體積比為1∶(2～3)；所述氯化銨溶液的濃度為0.05～0.1mol/L，pH值為7～8。
優選的是，所述步驟2)萃取包括攪拌過程，所述攪拌的時間為4～6h，轉速為50～80rpm。
優選的是，所述步驟2)的超濾採用直徑為0.4～0.1μm的超濾膜進行。
優選的是，所述步驟3)鹽析過程中藻藍蛋白上清液與磷酸銨溶液的體積比為1∶(2～3)；所述磷酸氨溶液的濃度為0.1～0.5mol/L，pH值為4.0～4.5；所述鹽析的溫度為15～20℃。
優選的是，所述步驟3)的鹽析反應進行攪拌，所述攪拌的反應時間為1～2h，轉速為20～30rpm。
優選的是，所述步驟3)脫鹽方法包括：將鹽析後的藻藍蛋白沉澱加入氯化銨溶液中溶解沉澱，過分子量為1×105～5×105的超濾膜濃縮除去磷酸鹽和銨鹽離子。
優選的是，所述步驟3)中的乾燥為噴霧乾燥。
本發明提供了一種利用氯化氨溶液從螺旋藻中提取藻藍蛋白的方法。複合酶進行酶解破壁處理在不破壞藻藍蛋白穩定性情況下可常溫快速實現螺旋藻的破壁，破壁率可達98％以上；氯化銨溶液經過一步萃取，結合超濾過程即可獲得高純度藻藍蛋白，純度可達2.0以上；採用磷酸銨溶液對所述藻藍蛋白上清液進行鹽析，將得到的鹽析產物脫鹽後乾燥得到的藻藍蛋白純度達3.8以上，回收率可達95％以上。本發明提供的方法無需低溫處理，工藝簡單，通過氯化氨溶液快速分離提取藻藍蛋白工藝，提取收率高。
具體實施方式
本發明提供了一種利用氯化氨溶液從螺旋藻中提取藻藍蛋白的方法，包括以下步驟：
1)將螺旋藻進行酶解破壁，得到破壁螺旋藻；
2)將所述破壁螺旋藻與氯化銨溶液混合，將藻藍蛋白萃取到氯化銨溶液中，超濾得到藻藍蛋白上清液；
3)採用磷酸銨溶液對所述藻藍蛋白上清液進行鹽析，將得到的鹽析產物脫鹽後乾燥，得到藻藍蛋白。
本發明將螺旋藻進行酶解破壁，得到破壁螺旋藻。在本發明中，所述螺旋藻優選為鈍頂螺旋藻(Spirulina platensis)。在本發明中，所述螺旋藻由螺旋藻藻種在光反應器培養得到，所述酶解前將培養得到的螺旋藻進行陶瓷膜過濾；本發明對所述螺旋藻藻種的來源沒有特殊的限定，採用本領域技術人員熟知的螺旋藻藻種市售產品即可。本發明對所述螺旋藻培養的方法沒有特殊的限定，採用本領域技術人員熟知的由螺旋藻藻種培養得到螺旋藻的常規方法即可。在本發明中，所述陶瓷膜過濾的溫度為25～35℃，所述溫度包括過濾過程中液體和膜的溫度，所述過濾的切向流速為3～5m/s，過膜壓力為0.6～0.9bar。在本發明中，所述陶瓷膜過濾的條件更優選溫度為28℃，切向流速為4m/s，過膜壓力為0.8bar。本發明所述濃縮優選將螺旋藻濃縮至質量濃度為50～60％，更優選為55％。在本發明中，所述陶瓷膜的孔徑優選為0.1～2μm，更優選為1μm。
本發明酶解的目的為破除螺旋藻的細胞壁，在本發明中，酶解破壁用酶為複合酶，所述複合酶包括纖維素酶、果膠酶和溶菌酶。在本發明中，所述纖維素酶酶活優選為1200～1800U/g，更優選為1500U/g；果膠酶酶活優選為800～1200U/g，更優選為1000U/g；溶菌酶酶活優選為1200～1800U/g，更優選為1500U/g；在本發明中，所述纖維素酶、果膠酶和溶菌酶的質量比優選為1∶2∶1，所述複合酶總添加量優選為0.01～0.05％，更優選為0.03％；所述酶解時間為3～5h，更優選為4h，所述破壁溫度30～40℃，更優選為35℃；所述酶解過程進行攪拌，所述攪拌的轉速為50～80rpm，更優選為60～70rpm。在本發明中，所述酶解過程優選反應至螺旋藻破壁率達到95％以上，更優選為98％以上。
得到破壁螺旋藻後，本發明將所述破壁螺旋藻與氯化銨溶液混合，將藻藍蛋白萃取到氯化銨溶液中，超濾得到藻藍蛋白上清液。在本發明中，所述破壁螺旋藻與氯化銨溶液的體積比為1∶(2～3)，更優選為1∶2.5；所述氯化銨溶液的濃度為0.05～0.1mol/L，優選為0.08mol/L，pH值為7～8，優選為7.5。
在本發明中，所述萃取包括攪拌過程，所述攪拌的時間為4～6h，優選為5h，轉速為50～80rpm，優選為60～70rpm。
在本發明中，所述步驟2)的超濾採用直徑為0.4～0.1μm，更優選為0.6μm的超濾膜進行。
得到藻藍蛋白上清液後，本發明採用磷酸銨溶液對所述藻藍蛋白上清液鹽析，將得到的鹽析產物脫鹽後乾燥，得到藻藍蛋白。
在本發明中，所述鹽析過程中藻藍蛋白上清液與磷酸銨溶液的體積比為1∶(2～3)，更優選為1∶2.2；所述磷酸氨溶液的濃度為0.1～0.5mol/L，更優選為0.2mol/L，pH值為4.0～4.5，更優選為4.2；所述鹽析的溫度為15～20℃，更優選為18℃。
在本發明中，所述步驟3)的鹽析反應進行攪拌，所述攪拌的反應時間為1～2h，轉速為20～30rpm，更優選為1.5h，轉速25rpm。
在本發明中，所述步驟3)脫鹽方法包括：將鹽析後的藻藍蛋白沉澱加入氯化銨溶液中溶解沉澱，過分子量為1×105～5×105，更優選為3×105的超濾膜濃縮除去磷酸鹽和銨鹽離子。在本發明中，所述氯化銨溶液的濃度為0.05～0.1mol/L，優選為0.08mol/L，pH值為7～8，優選為7.5。
在本發明中，所述步驟3)中的乾燥為噴霧乾燥。本發明在進行噴霧乾燥過程時，優選加入保護劑，所述保護劑的加入能夠提高藻藍蛋白的回收率和噴霧乾燥的效率，所述保護劑優選為海藻糖、β-環糊精和多孔澱粉中的一種或多種，所述保護劑的添加質量百分比優選為0.1～1％，更優選為0.3～0.8％。在本發明中，所述噴霧乾燥的條件具體優選為入塔風溫為80～120℃，更優選為100℃，通氣量為：800～1200L/h，更優選為1100L/h。
下面結合實施例，對本發明提供的一種利用氯化氨溶液從螺旋藻中提取藻藍蛋白的方法進行詳細的描述，但是不能將它們理解為對本申請保護範圍的限定。
實施例1
螺旋藻的培養和收集：
1)製備用於螺旋藻培養的人工海水培養基，培養基的組成：12.0g/L NaHCO3，4.03g/L Na2CO3，0.4g/L K2HPO4，2.5g/L NaNO3，1.25g/L K2SO4，1.25g/L NaCl，0.25g/L MgSO4·2H2O，0.05g/L CaCl2·2H2O，0.01g/L FeSO4·7H2O，0.08g/L EDTA。將螺旋藻接種培養在100L鼓泡管式光照反應器中，培養基pH值維持在9.0，培養溫度控制在30℃，持續通入濃度2.0％CO2，採用LED光源光照強度控制在100lux，光照和暗培養時間分別為12小時交替培養8天，螺旋藻密度可達20g/L。收穫菌體。
2)高密度培養的螺旋藻培養液通過連續分離的管式陶瓷膜(膜孔徑為0.1μm)將菌體和培養液分離，除去菌體的培養液繼續回流到光照反應器中，添加1/4新鮮培養基同時接種螺旋藻藻種，按照步驟1)的培養條件進行重複培養。收集濃縮含螺旋藻的菌液待進行破壁處理。
螺旋藻的酶解破壁：
1)向收集合55％的螺旋藻的菌液中加入0.03％的1500U/g纖維素酶，1000U/g果膠酶和1500U/g溶菌酶的混合物(質量比為1∶2∶1)。在35℃溫度下攪拌處理4hr，轉速控制在65rpm，待螺旋藻破壁率達到98％以上，得到破壁螺旋藻，備用。
氯化銨溶液萃取藻藍蛋白：
在破壁的螺旋藻中加入2倍體積0.08M氯化氨溶液(pH7.2)，在提取罐中常溫下攪拌處理5hr，轉速控制在55rpm，藻藍蛋白萃取到含有氯化氨溶液的上清液中，然後通過0.1um超濾膜分離，得到藻藍蛋白上清液，提取收率可達98％以上，藻藍蛋白的純度可達(A620/A280)可達2.0以上；
藻藍蛋白鹽析沉澱純化：
提取液加入2倍體積的0.2M的磷酸銨(pH＝4)溶液緩慢攪拌處理1.5h，轉速控制在20-30rpm之間，溫度控制在25℃，獲得藻藍蛋白的鹽析沉澱，4500rpm離心收集藻藍蛋白的沉澱，使用0.1M氯化銨溶液(pH＝7)重新溶解沉澱，再經過100,000-300,000分子量的超濾膜除去磷酸鹽和銨鹽離子。
藻藍蛋白的濃縮和乾燥
將所得脫鹽溶液進一步經過300,000分子量的超濾膜濃縮後，得到高濃度的藻藍蛋白液態產品，藻藍蛋白純度可達3.8以上。為了得到固態粉末藻藍蛋白，在液態藻藍蛋白中加入0.3％的β-環糊精和多孔澱粉(質量比為1.5∶1)作為保護劑經過噴霧乾燥處理獲得藻藍蛋白的粉劑產品。獲得高純度的藥用級藻藍蛋白。
以上所述僅是本發明的優選實施方式，應當指出，對於本技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發明的保護範圍。