一種非對稱的1，2，4，5‑四嗪分子的應用的製作方法
2023-05-23 10:00:21 1
本發明涉及一種激活劑的應用，具體涉及一種非對稱的1，2，4，5-四嗪分子的應用。
背景技術：
很多前體藥物或者蛋白質的關鍵基團是羥基或者氨基等這類活性基團，因此，這些分子的活性可通過保護和脫保護它們的關鍵活性基團來調控。但很多情況下，這些分子的激活需要在生命體系中進行，這就要求脫保護反應必須是生物正交，同時具有很高的反應效率。生物正交反應(bioorthogonalreaction)是指在活體細胞或組織中,能夠在不幹擾生物自身生化反應條件下可以進行的化學反應,對生命科學的基礎研究和臨床應用都具有重要意義。同時，狄爾斯一阿爾德反應(diels-alderreaction)是經典的雙烯加成反應,「逆電子需求的狄爾斯-阿爾德反應」同樣也有著重要的理論和應用價值,近年來被應用於抗體修飾、材料合成和活體標記等多個領域。
早期的生物正交反應主要是連接反應，用於將螢光染料等功能小分子以共價鍵的形式高效特異地連接到活體內的生物大分子上。近年來，研究工作者逐漸開始關注和發展生物正交「剪切反應」，利用胺基酸側鏈上化學鍵的選擇性斷裂，實現活體內蛋白質的特異激活。到目前為止，前體藥物或蛋白質已有的激活方法存在激活速率慢，效率低的問題。因此，無法用於生命體系內功能分子的高效激活，極大限制了這些方法在實際疾病精準治療等方面的應用前景。
技術實現要素：
本發明的目的是通過以下技術方案實現的，一種非對稱的1，2，4，5-四嗪分子在基於逆電子狄爾斯-阿爾德反應的生物正交領域進行前體藥物快速激活的應用，所述前體藥物的結構通式為：
其中，x＝nh或o。
進一步，所述藥物為阿黴素。
進一步，所述非對稱的1，2，4，5-四嗪分子為3-(4-氟)苯基-6-(2-羥基)乙基-1,2,4,5-四嗪分子，3-(2-吡啶)-6-(2-羥基)乙基-1,2,4,5-四嗪分子，3-(2-嘧啶)-6-(2-羥基)乙基-1,2,4,5-四嗪分子，
或3-(2-嘧啶)-6-甲基-1,2,4,5-四嗪分子。
進一步，所述非對稱的1，2，4，5-四嗪分子的製備方法，首先將氰基底物1,氰基底物2,水合肼,三氟甲磺酸鋅混合於圓底燒瓶中，並用磁力攪拌器攪拌，反應條件為真空氮氣保護，反應在55～65℃進行20～24小時；隨後冷卻至室溫，在冰水浴條件下緩慢滴加亞硝酸鈉溶液至反應體系中，用鹽酸水溶液調節ph為2.8～3.2，然後用二氯甲烷萃取2～3次，合併有機相，再用無水硫酸鈉乾燥後以旋轉蒸發儀除去有機溶劑，最後以柱層析分離方法進行分離純化得到非對稱的1，2，4，5-四嗪分子。
進一步，所述氰基底物1為4-氟基苯甲腈、2-氰基吡啶或2-氰基嘧啶；所述氰基底物2為3-羥基丙腈或乙腈。
本發明進一步的目的是通過以下技術方案實現的，一種非對稱的1，2，4，5-四嗪分子在基於逆電子狄爾斯-阿爾德反應的生物正交領域進行蛋白質快速激活的應用，所述蛋白質的結構通式為：
其中，x＝nh或o。
進一步，所述蛋白質為以賴氨酸、酪氨酸、絲氨酸或蘇氨酸為活性殘基的蛋白質。
進一步，所述非對稱的1，2，4，5-四嗪分子為3-(4-氟)苯基-6-(2-羥基)乙基-1,2,4,5-四嗪分子，3-(2-吡啶)-6-(2-羥基)乙基-1,2,4,5-四嗪分子，3-(2-嘧啶)-6-(2-羥基)乙基-1,2,4,5-四嗪分子，或3-(2-嘧啶)-6-甲基-1,2,4,5-四嗪分子。
進一步，所述非對稱的1，2，4，5-四嗪分子的製備方法，首先將氰基底物1,氰基底物2,水合肼,三氟甲磺酸鋅混合於圓底燒瓶中，並用磁力攪拌器攪拌，反應條件為真空氮氣保護，反應在55～65℃進行20～24小時；隨後冷卻至室溫，在冰水浴條件下緩慢滴加亞硝酸鈉溶液至反應體系中，用鹽酸水溶液調節ph為2.8～3.2，然後用二氯甲烷萃取2～3次，合併有機相，再用無水硫酸鈉乾燥後以旋轉蒸發儀除去有機溶劑，最後以柱層析分離方法進行分離純化得到非對稱的1，2，4，5-四嗪分子。
進一步，所述氰基底物1為4-氟基苯甲腈、2-氰基吡啶或2-氰基嘧啶；所述氰基底物2為3-羥基丙腈或乙腈進一步，所述蛋白質為以賴氨酸、酪氨酸、絲氨酸或蘇氨酸為活性殘基的蛋白質。
進一步，所述非對稱四嗪激活劑為3-(4-氟)苯基-6-(2-羥基)乙基-1,2,4,5-四嗪分子，3-(2-吡啶)-6-(2-羥基)乙基-1,2,4,5-四嗪分子，3-(2-嘧啶)-6-(2-羥基)乙基-1,2,4,5-四嗪分子，或3-(2-嘧啶)-6-甲基-1,2,4,5-四嗪分子。
進一步，所述非對稱的1，2，4，5-四嗪分子的製備方法，首先將氰基底物1,氰基底物2,水合肼,三氟甲磺酸鋅混合於圓底燒瓶中，並用磁力攪拌器攪拌，反應條件為真空氮氣保護，反應在55～65℃進行20～24小時；隨後冷卻至室溫，在冰水浴條件下緩慢滴加亞硝酸鈉溶液至反應體系中，用鹽酸水溶液調節ph為2.8～3.2，然後用二氯甲烷萃取2～3次，合併有機相，再用無水硫酸鈉乾燥後以旋轉蒸發儀除去有機溶劑，最後以柱層析分離方法進行分離純化得到非對稱的1，2，4，5-四嗪分子。
進一步，所述氰基底物1為4-氟基苯甲腈、2-氰基吡啶或2-氰基嘧啶；所述氰基底物2為3-羥基丙腈或乙腈。
本發明利用在逆電子需求的diels-alder剪切反應中活性最高的一類非對稱1，2，4，5-四嗪分子，結構式如下：通過3位吸電子基團(ewg)促進第一步ida加成反應生成加成中間體，同時6位相對電中性的烷基或烷氧基基團促進第二步的脫除，從而3位和6位的取代基協同作用，顯著提高了非對稱1，2，4，5-四嗪分子整體在活體內的剪切反應速率。
本發明的優點在於：相對於對稱的四嗪分子，非對稱的1，2，4，5-四嗪激活劑具有極高的激活效率，而且本身和生物正交反應過程均不會對細胞產生毒性，尤其是快速激活體外或體內以氨基或羥基為活性位點的前藥藥物分子以及以賴氨酸、酪氨酸、絲氨酸或蘇氨酸為活性殘基的蛋白質，從而可用於生命過程研究、疾病精準治療等方面，具有極為廣闊的應用前景。
附圖說明
通過閱讀下文優選實施方式的詳細描述，各種其他的優點和益處對於本領域普通技術人員將變得清楚明了。附圖僅用於示出優選實施方式的目的，而並不認為是對本發明的限制。而且在整個附圖中，用相同的參考符號表示相同的部件。在附圖中：
圖1為液相色譜-質譜聯用測試反式環辛烯保護的阿黴素前藥分子激活的試驗結果。
具體實施方式
下面將參照附圖更詳細地描述本公開的示例性實施方式。雖然附圖中顯示了本公開的示例性實施方式，然而應當理解，可以以各種形式實現本公開而不應被這裡闡述的實施方式所限制。相反，提供這些實施方式是為了能夠更透徹地理解本公開，並且能夠將本公開的範圍完整的傳達給本領域的技術人員。
一、前體藥物的激活
以阿黴素為例的前藥的激活，反應式如下：
實施例1
1、3-(2-嘧啶)-6-甲基-1,2,4,5-四嗪分子的製備
將1.0mmol氰基底物2-氰基嘧啶,10.0mmol氰基底物乙腈,25mmol水合肼,0.5mmol三氟甲磺酸鋅混合於圓底燒瓶中並用磁力攪拌器攪拌，反應條件為真空氮氣保護，反應在60℃進行24小時，隨後冷卻至室溫，在冰水浴條件下緩慢滴加濃度為1m亞硝酸鈉溶液至反應體系中，用濃度為1m鹽酸水溶液調節ph到3，然後用20ml二氯甲烷萃取三次，合併有機相，用無水硫酸鈉乾燥後以旋轉蒸發儀除去有機溶劑，最後以柱層析分離方法進行分離純化得到紅色固體3-(2-嘧啶)-6-甲基-1,2,4,5-四嗪分子，產率40％。表徵數據：1hnmr(cdcl3,400mhz)δ9.14(d,j＝4.9hz,2h,ar-h),7.61(t,j＝4.9hz,1h,ar-h),3.23(s,3h,cch3)ppm；13c{1h}nmr(cdcl3,100mhz)δ168.80(tz-c),163.33(tz-c),159.60(ar-c),158.51(x2,ar-c),122.65(ar-c),21.60(ch3)ppm；hrms(idaadductwith4-(oh)tco)m/z273.171268[(m+h)+；calcdforc15h21n4o:273.170988]。
2、阿黴素前藥分子的激活
在反應玻璃瓶中加入反式環辛烯保護的阿黴素前藥分子(終濃度：0.2mm)和3-(2-嘧啶)-6-甲基-1,2,4,5-四嗪分子(終濃度：1mm)，總體積保持100微升。在37℃孵育30min後，採用液相色譜-質譜聯用(lc-ms)分別測試同濃度條件下反式環辛烯保護的阿黴素前藥分子以及加入四嗪分子激活後產物在lc-ms上的出峰時間，與標準產物阿黴素進行對比，測試結果如圖1所示。
由圖1可知，反式環辛烯保護的阿黴素前藥能夠在5min內被3-(2-嘧啶)-6-甲基-1,2,4,5-四嗪分子完全激活生成阿黴素。
二、蛋白質的激活
將目標蛋白上關鍵位點用反式環辛烯進行保護後，目標蛋白會失去活性，在實施例中，採用了遺傳密碼子擴展技術來產生失活的蛋白，但引入反式環辛烯的方法包括但不僅限於該技術；然後通過外加四嗪分子對目的蛋白質的激活，(四嗪觸發的蛋白質的激活可在體外或者體內進行)，實現時間和空間上對蛋白質功能的調控，反應式如下：
實施例2：螢光素酶fluc的體外激活
fluc是一種螢火蟲螢光素酶，能將螢光素轉化為氧化螢光素，同時發出螢光。首先在fluc的529位插入反式環辛烯保護的賴氨酸(tcok)得到蛋白fluc-k529tcok使fluc失活，然後在細胞表達fluc-k529tcok蛋白之後，將細胞破碎並純化得到純的fluc-k529tcok蛋白質，接著在該蛋白的溶液中加入50μm的3-(2-嘧啶)-6-甲基-1,2,4,5-四嗪分子(製備方法與實施例1相同)，使fluc-k529tcok脫保護，激活後的fluc催化螢光素轉化為氧化螢光素，同時產生螢光，而且可在4min內將fluc-k529tcok蛋白激活為野生型蛋白fluc，激活效率可達90％以上。
實施例3：螢光素酶fluc的激活
首先在fluc的529位插入反式環辛烯保護的賴氨酸(tcok)得到蛋白fluc-k529tcok能夠使fluc失活，fluc的活性被完全抑制，加入活的hek293t細胞中，然後加入50um的3-(2-嘧啶)-6-甲基-1,2,4,5-四嗪分子(製備方法與實施例1相同)使fluc-k529tcok脫保護，激活後的fluc催化螢光素轉化為氧化螢光素，同時產生螢光，而且可在4min內完全激活fluc-k529tcok，激活效率可達95％以上。
實施例4
1、3-(4-氟)苯基-6-(2-羥基)乙基-1,2,4,5-四嗪分子的製備
將1.0mmol氰基底物4-氟基苯甲腈,10.0mmol氰基底物3-羥基丙腈,25mmol水合肼,0.5mmol三氟甲磺酸鋅混合於圓底燒瓶中並用磁力攪拌器攪拌，反應條件為真空氮氣保護，反應在60℃進行24小時，隨後冷卻至室溫，在冰水浴條件下緩慢滴加濃度為1m亞硝酸鈉溶液至反應體系中，用濃度為1m鹽酸水溶液調節ph到3，然後用20ml二氯甲烷萃取三次，合併有機相，用無水硫酸鈉乾燥後以旋轉蒸發儀除去有機溶劑，最後以柱層析分離方法進行分離純化得到紅色固體3-(4-氟)苯基-6-(2-羥基)乙基-1,2,4,5-四嗪分子，產率31％。表徵數據：1hnmr(cdcl3,400mhz)δ8.79-8.41(m,2h,ar-h),7.30(d,j＝8.5hz,2h,ar-h),4.31(t,j＝5.6hz,2h,ch2ch2oh),3.63(t,j＝5.6hz,2h,ch2ch2oh),2.39(s,1h,ch2ch2oh)ppm；13c{1h}nmr(cdcl3,100mhz)δ168.39(tz-c),167.27(tz-c),164.33(d,j＝82.3hz,ar-cf),130.49(d,j＝9.1hz,2c,ar-c),127.95(d,j＝3.1hz,ar-c),116.74(d,j＝22.1hz,2c,ar-c),60.20(ch2ch2oh),37.62(ch2ch2oh)ppm；19f{1h}nmr(cdcl3,376mhz)δ-106.06(s)ppm；hrms(idaadductwith4-(oh)tco)m/z319.181866[(m+h)+；calcdforc18h24fn2o2:319.181633]。
2、蘇氨酸裂解酶ospf的激活
ospf是一種病原菌分泌的蘇氨酸裂解酶，能通過β消除反應使胞外信號調節激酶(mapk)去磷酸化。首先在ospf的134位插入反式環辛烯保護的賴氨酸(tcok)得到蛋白ospf-k134tcok能夠使ospf失活，加入活的hek293t細胞中，然後加入50um的3-(2-嘧啶)-6-甲基-1,2,4,5-四嗪分子使ospf-k134tcok脫保護，激活後的ospf催化185位磷酸化的erk蛋白去磷酸化，而且可在4min內完全激活ospf-k134tcok，激活效率可達85％以上。
實施例5
1、3-(2-吡啶)-6-(2-羥基)乙基-1,2,4,5-四嗪分子的製備
將1.0mmol氰基底物2-氰基吡啶,10.0mmol氰基底物3-羥基丙腈,25mmol水合肼,0.5mmol三氟甲磺酸鋅混合於圓底燒瓶中並用磁力攪拌器攪拌，反應條件為真空氮氣保護，反應在60℃進行24小時，隨後冷卻至室溫，在冰水浴條件下緩慢滴加濃度為1m亞硝酸鈉溶液至反應體系中，用濃度為1m鹽酸水溶液調節ph到3，然後用20ml二氯甲烷萃取三次，合併有機相，用無水硫酸鈉乾燥後以旋轉蒸發儀除去有機溶劑，最後以柱層析分離方法進行分離純化得到紅色固體3-(2-吡啶)-6-(2-羥基)乙基-1,2,4,5-四嗪分子的製備，產率48％。表徵數據：1hnmr(cdcl3,400mhz)δ8.93(d,j＝4.6hz,1h,ar-h),8.60(t,j＝18.1hz,1h,ar-h),7.98(td,j＝7.8,1.2hz,1h,ar-h),7.56(dd,j＝7.5,4.8hz,1h,ar-h),4.32(t,j＝5.8hz,2h,ch2ch2oh),3.68(t,j＝5.8hz,2h,ch2ch2oh),2.55(s,1h,ch2ch2oh)ppm；13c{1h}nmr(cdcl3,100mhz)δ169.31(tz-c),164.04(tz-c),151.03(ar-c),150.19(ar-c),137.67(ar-c),126.63(ar-c),124.12(ar-c),60.17(ch2ch2oh),37.83(ch2ch2oh)ppm；hrms(idaadductwith4-(oh)tco)m/z302.187617[(m+h)+；calcdforc17h24n3o2:302.186303]。
2、炭疽致死因子lf的激活
lf(lethalfactor)是一種細菌毒素，能夠發揮蛋白酶活性對體內胞外信號調節激酶meks進行切割。首先將lf蛋白673位的賴氨酸替換為反式環辛烯保護的賴氨酸(tcok)從而產生lf-k673tcok蛋白，該蛋白失去活性不能對meks進行正常切割，加入活的hek293t細胞中，然後加入50um的3-(2-嘧啶)-6-甲基-1,2,4,5-四嗪分子使lf-k673tcok脫保護，激活後的lf能夠對meks進行正常切割，而且可在4min內激活lf-k673tcok，產生野生型lf，從而恢復對meks的切割活性，激活效率可達85％以上。
實施例6
1、3-(2-嘧啶)-6-(2-羥基)乙基-1,2,4,5-四嗪分子的製備
將1.0mmol氰基底物2-氰基嘧啶,10.0mmol氰基底物3-羥基丙腈,25mmol水合肼,0.5mmol三氟甲磺酸鋅混合於圓底燒瓶中並用磁力攪拌器攪拌，反應條件為真空氮氣保護，反應在60℃進行24小時，隨後冷卻至室溫，在冰水浴條件下緩慢滴加濃度為1m亞硝酸鈉溶液至反應體系中，用濃度為1m鹽酸水溶液調節ph到3，然後用20ml二氯甲烷萃取三次，合併有機相，用無水硫酸鈉乾燥後以旋轉蒸發儀除去有機溶劑，最後以柱層析分離方法進行分離純化得到紅色固體3-(2-嘧啶)-6-(2-羥基)乙基-1,2,4,5-四嗪分子，產率48％。表徵數據：1hnmr(cdcl3,400mhz)δ9.14(d,j＝4.9hz,2h,ar-h),7.61(t,j＝4.9hz,1h,ar-h),4.36(t,j＝5.8hz,2h,ch2ch2oh),3.76(t,j＝5.7hz,2h,ch2ch2oh)ppm；13c{1h}nmr(cdcl3,100mhz)δ169.89(tz-c),163.68(tz-c),159.50(ar-c),158.61(x2,ar-c),122.82(ar-c),60.11(ch2ch2oh),37.93(ch2ch2oh)ppm；hrms(idaadductwith4-(oh)tco)m/z303.181557[(m+h)+；calcdforc16h23n4o2:303.181552]。
2、激酶mek的激活
mek1激酶是mek的一種，屬於胞外信號調節激酶(mapk)通路中的關鍵激酶，能夠使下遊的erk激酶磷酸化。首先在mek1的97位插入反式環辛烯保護的賴氨酸(tcok)產生mek1-k97tcok，該蛋白失去活性不能對erk進行磷酸化，加入活的hek293t細胞中，然後加入50um的3-(2-嘧啶)-6-甲基-1,2,4,5-四嗪分子(製備方法與實施例1相同)可在4min內使mek1-k97tcok脫保護生成野生型mek1，激活後的mek1能夠恢復活性使erk激酶磷酸化，恢復對erk的切割活性，激活效率可達85％以上。
實施例7：激酶fak的激活
fak是一種與細胞黏附伸展相關的黏著斑激酶，屬於非受體蛋白酪氨酸激酶，發揮激酶活性時能夠促進自磷酸化和src激酶磷酸化。首先在fak的454位插入反式環辛烯保護的賴氨酸(tcok)產生fak-k454tcok，fak-k454tcok沒有活性而不能對src進行激活，加入活的hek293t細胞中，然後加入50um的3-(2-嘧啶)-6-甲基-1,2,4,5-四嗪分子(製備方法與實施例1相同)可在4min內使fak-k454tcok激活產生野生型fak，從而恢復對src的磷酸化活性，激活效率可達85％以上。
實施例8：激酶src的激活
src屬於非受體蛋白酪氨酸激酶，發揮激酶活性時能夠實現自磷酸化和下遊底物磷酸化。首先在src的295位插入反式環辛烯保護的賴氨酸(tcok)產生失去活性的src-k295tcok蛋白，加入活的hek293t細胞中，然後加入50um的3-(2-嘧啶)-6-甲基-1,2,4,5-四嗪分子(製備方法與實施例1相同)可以在4min內使src脫保護，激活src-k295tcok，產生野生型src，恢復對src自身以及下遊底物的的磷酸化活性，激活效率可達85％以上。
實施例9：基因編輯蛋白cas9的激活
cas9是crispr/cas9基因編輯系統中的蛋白，在發揮基因編輯功能時，cas9結合grna，通過grna上的靶點序列在目標基因組上找到靶點序列，並解開雙螺旋，cas9將剪切dna雙鏈，造成dna雙鏈斷裂。首先在cas9的866位插入反式環辛烯保護的賴氨酸(tcok)產生沒有活性的cas9-k866tcok，加入活的hek293t細胞中，然後加入50um的3-(2-嘧啶)-6-甲基-1,2,4,5-四嗪分子(製備方法與實施例1相同)可在4min內激活cas9-k866tcok，使cas9脫保護，產生野生型cas9，激活後的cas9能夠恢復活性對目的基因進行編輯，激活效率可達80％以上。
對比例1
1、3-(2-吡啶)-6-甲基-1,2,4,5-四嗪分子的製備
與實施例1製備方法中區別僅在於氰基底物1為2-氰基吡啶，氰基底物2為乙腈，按照實施例1製備步驟得到紅色固體3-(2-吡啶)-6-甲基-1,2,4,5-四嗪分子，產率40％。表徵數據：1hnmr(cdcl3,400mhz)δ8.96(d,j＝4.5hz,1h,ar-h),8.65(d,j＝7.9hz,1h,ar-h),7.99(td,j＝7.8,1.3hz,1h,ar-h),7.57(dd,j＝7.4,4.9hz,1h,ar-h),3.17(s,3h,cch3)ppm；13c{1h}nmr(cdcl3,100mhz)δ168.24(tz-c),163.69(tz-c),150.96(ar-c),150.36(ar-c),137.57(ar-c),126.45(ar-c),123.98(ar-c),21.46(ch3)ppm；hrms(idaadductwith4-(oh)tco)m/z272.175796[(m+h)+；calcdforc16h22n3o:272.175739]。
2、基因編輯蛋白cas9的激活
首先在cas9的866位插入反式環辛烯保護的賴氨酸(tcok)產生沒有活性的cas9-k866tcok，加入活的hek293t細胞中，然後加入50um的3-(2-吡啶)-6-甲基-1,2,4,5-四嗪分子，在15min內激活cas9-k866tcok，使cas9脫保護，產生野生型cas9，激活後的cas9能夠恢復活性對目的基因進行編輯，激活效率僅為33％。
以上所述，僅為本發明較佳的具體實施方式，但本發明的保護範圍並不局限於此，任何熟悉本技術領域的技術人員在本發明揭露的技術範圍內，可輕易想到的變化或替換，都應涵蓋在本發明的保護範圍之內。因此，本發明的保護範圍應以所述權利要求的保護範圍為準。