用生物轉化生產10-羥基喜樹鹼的方法

2023-05-24 03:35:21

專利名稱:用生物轉化生產10-羥基喜樹鹼的方法
本發明屬於應用微生物方法轉化的技術領域：
。
於1966年開始，Wall等報導從我國引種的喜樹(Camptotheca acuminata Denc)中分離得到抗癌有效成分喜樹鹼Camptothecine(Ⅰ)，10-羥基喜樹鹼10-Hydroxy Camptothecine(Ⅱ)和10-甲氧基喜樹鹼10-Methoxy Camptothecine(Ⅲ)等。1971年Stork和Schultz等完成了喜樹鹼的全合成工作，我國以1969年起，陸續從喜樹中也分離到喜樹鹼和10-羥基喜樹鹼等有關的化合物，1976年又完成了喜樹鹼和10-羥基喜樹鹼的全合成。
(Ⅰ)R＝H (Ⅱ)R＝OH (Ⅲ)R＝OCH310-羥基喜樹鹼的化學結構與喜樹鹼相似，僅在10位上的氫由羥基取代，經動物藥理和臨床試驗證明，在治療腫瘤方面比喜樹鹼有較好治療效果和較低的毒付反應。於1977年10-羥基喜樹鹼作為腫瘤臨床的一隻新藥，在國內通過鑑定，並應用於治療肝癌、胃癌、頭頸部腫瘤和白血病等。
過去10-羥基喜樹鹼從喜樹中提取，得率甚低，約為生藥的十萬分之二，提取過程中需用大量有毒的氯仿和甲醇，以及接觸有毒的喜樹鹼等本身物質，致使10-羥基喜樹鹼的生產發生困難，成本昂貴。製造10-羥基喜樹鹼的全合成雖然獲得成功，由於步驟多;總收率較低，也無生產實際意義。
本發明的目的是為了解決10-羥基喜樹鹼的生產問題。本發明採用生物轉化的方法，將喜樹中含量較高的喜樹鹼(提取得量為萬分之七左右)，轉變為10-羥基喜樹鹼。作者曾於1978年在科學通報上簡單地報導了利用麴黴T-36菌株，可將喜樹鹼轉化為10-羥基喜樹鹼。後又經過菌種的誘變，菌體生長和轉化條件的改進。現採用黃麴黴T-419菌株，使轉化率從20%提高到50%以上。特別又研究成功採用了隋性大孔樹脂分離提取10-羥基喜樹鹼的新工藝，進一步降低了生產成本和解決了勞動保護問題，使10-羥基喜樹鹼具備了實際生產的條件。
利用本發明生產10-羥基喜樹鹼比原來從喜樹中提取10-羥基喜樹鹼的方法有如下優點。
1.擴大了生產10-羥基喜樹鹼的來源，用原來從喜樹中提取的方法，只能得到十萬分之二的10-羥基喜樹鹼，而另一產量較高的喜樹鹼因臨床毒性較大，而成為無用物質。通過本發明可將這部分喜樹鹼轉變為臨床上有較好評價的10-羥基喜樹鹼。
2.革除了大量氯仿和甲醇以及上矽膠柱分離的工藝，使操作人員免去接觸大量有毒氣體和喜樹鹼類本身的粉末。
3.節約了大量溶劑和試劑，再利用了喜樹鹼後致使10-羥基喜樹鹼的生產量可大大增加等，使生產成本要比原方法低得多。
一、生物轉化的菌株鑑定我們共篩選了數百株真菌，其中T-36菌株通過對其轉化產物的理化分析證明，確具有轉化喜樹鹼為10-羥基喜樹鹼的能力，後又將T-36菌株的孢子經過紫外光處理10分鐘後，所分離得到的變株T-419其形態和培養的基本特徵與T-36菌株一致，僅在10-羥基喜樹鹼的轉化率上比T-36菌株高6-10%，故以後的工藝試驗皆用黃麴黴菌株T-419，T-419菌株的形態和培養特徵T-419菌株在Czapek′s固體培養基上菌落近園形，很快向四周蔓延，菌落表面帶黃綠色的分生孢子。菌絲無色，無可溶性色素分泌。菌絲有橫膈，為多細胞的菌絲體。分生孢子梗的頂端膨大成半球形的頂囊，在頂囊表面以輻射方式長出一層或雙層小梗，在小梗頂端形成一串分生孢子。這些都是典型的麴黴屬Aspergillus的形態特徵，在電子顯微鏡下觀察其孢子表面光滑近球形。由於孢子呈黃綠色，故其種應命名為黃麴黴菌株T-419。
二、轉化產品的鑑別喜樹鹼通過黃麴黴菌株T-419轉化後的培養液，菌絲用乙脂提取，濾液用乙酸乙脂提取，分別濃縮後合併，再甲醇迥流，上矽膠柱層析，用氯仿衝洗，除去喜樹鹼成分，然後收集2-4%甲醇的氯仿的衝洗液，濃縮後得到固體粉末，再在氯仿∶甲醇(1∶1)混合溶劑中結晶數次，即能得到純的黃色柱狀結晶的轉化產物。其熔點旋光、質譜、紫外光譜、紅外光譜、核磁共振譜等的理化性質數據都與天然分離得到的10-羥基喜樹鹼完全一致(表1)。採用隋性大孔樹脂分離獲得10-羥基喜樹鹼經質譜、紅外、紫外、核磁光譜分析也與天然的10-羥基喜樹鹼完全一致。
三、200公升罐內的生物轉化工藝實例
1.生物轉化的工藝流程孢子→30公升罐內種子菌絲培養→200公升罐內轉化菌絲培養 (過濾)/ (洗滌)/ (菌絲懸浮於磷酸緩衝液中)/ 菌絲懸浮液 (加入喜樹鹼轉化)/ 含10-羥基喜樹鹼的轉化液。
2.孢子培養黃麴黴菌株T-419在Czapek′s斜面培養基上，於27℃生長7天，待表面長出一層黃綠色孢子後，貯於冰箱內備用。Czapek′s斜面培養基成分葡萄糖5%;氯化銨0.1%;硫酸鎂0.05%;磷酸二氫鉀0.1%;瓊脂2%，消毒前PH調至6.0-6.5。
3.種子菌絲培養在30公升罐內裝有15公升種子菌絲培養基，消毒冷卻後，以一個孢瓶的孢子接種於罐內，在溫度27±1℃，通氣量1∶1V/Vm攪拌深層培養48小時。種子菌絲培養基成分為葡萄糖2.5%;黃豆並粉2.5%;澱粉1%;氯化鈉0.1%;硫酸鎂0.05%;磷酸氫二鉀0.38%;磷酸二氫鉀0.04%，消毒前自然PH。
4.轉化菌絲培養於200公升罐內裝有120公升培養基，消毒冷卻後，以10%左右接種量的種子種入罐內，在溫度27±1℃，通氣量在培養周期24小時前1∶0.3-0.5V/Vm。24小時後，1∶1V/Vm，攪拌深層培養44小時，轉化菌絲培養的培養基與種子菌絲培養的培養基相同。
5.生物轉化在200公升罐內培養好的菌絲，經過濾，水衝洗和空氣吹乾後，取出稱量，再懸浮於包含磷酸氫二鉀0.36%，磷酸二氫鉀0.04%，PH7.2磷酸鹽緩衝液中，同時加入預先溶解的喜樹鹼使濃度為50-150微克/毫升(PH9-10)，在27±1℃通氣量1∶1V/Vm和攪拌條件下轉化40小時左右。
6.菌絲培養和轉化過程中各參數的變化在菌絲培養的開始階段，T-419菌株的菌絲生長很快，伴隨著培養基內的糖和氮源消耗加快。待24小時後，菌體生長漸趨遲緩和停頓，此時糖和氮源的利用幾乎很低。在整個菌絲生長階段，PH一直很平穩地維持在5.5左右。在轉化階段，開始的24小時內，喜樹鹼和10-羥基喜樹鹼的消長很快，伴隨著PH有一定上升，由PH7.0上升到PH7.8，待轉化24小時以後，喜樹鹼和10-羥基喜樹鹼的消長趨緩慢，此時的PH變化也不大。
用紫外雙波長薄層掃描方法，測定三批在200公升罐內10-羥基喜樹鹼的轉化率為63，68和74%。
四、200公升規模用隋性大孔樹脂提取分離10-羥基喜樹鹼的工藝實例。
由於喜樹鹼等是一類較毒的物質，老的提取和純化方法不僅要用大量有毒的氯仿和甲醇，而且上矽膠柱層析時，有大量有毒喜樹鹼類粉子飛揚，這對操作人員的健康有嚴重危害。我們採用隋性大孔樹脂分離提純10-羥基喜樹鹼，這不僅能解決勞動保護的問題，還能簡化操作步驟，節省大量溶劑。
隋性大孔樹脂分離提純10-羥基喜樹鹼的工藝流程如下轉化濾液 (加NaCl至0.2%濃度)/(調PH至6.8-7.0) 隋性大孔樹脂吸附 (用0.5%NaCl蒸餾水溶液衝洗)/ (用PH9.5-10蒸餾水洗脫)/ 10-羥基喜樹鹼洗脫液 (加NaCl至0.2%濃度)/(調PH至6.8-7.0) 第二次隋性大孔樹脂吸附 (用0.5%NaCl蒸餾水溶液衝洗)/ (用蒸餾水稍洗工業乙醇洗脫)/ 乙醇洗脫液 (濃縮至幹)/ (乙酸乙酯∶甲醇(1∶0.2-1))/(迥流) (濃縮至小體積)/ (過濾)/ (少量甲醇洗)/ (石油醚)/ (乾燥)/ 10-羥基喜樹鹼粗品 (氯仿∶甲醇(1∶1))/(重結晶) 10-羥基喜樹鹼精製品。
200公升罐內所得到的三批轉化產品，進行了水份，喜樹鹼和10-羥基喜樹鹼的含量測定，得到結果與1977年鑑定會上所規定的天然10-羥基喜樹鹼的質量標準進行比較。
從表3中看出，通過隋性大孔樹脂分離純化工藝所得到的轉化的10-羥基喜樹鹼產品質量能達到規定的標準。
實施例黃麴黴菌株T-419在Czapek′s斜面培養基上，於27℃培養7天後，以一個孢瓶的孢子接種到滅過菌的15公升種子菌絲培養基內，在溫度27±1℃通氣量1∶1V/Vm攪拌深層培養48小時。種子菌絲培養基成份葡萄糖2.5%;黃豆並粉2.5%;澱粉1%;氯化鈉0.1%;硫酸鎂0.05%;磷酸氫二鉀0.38%;磷酸二氫鉀0.04%，消前自然PH。
培養好的種子菌絲再接種到滅過菌的含有與種子菌絲培養基同樣成分的120公升培養基內，在溫度27±1℃通氣量在培養周期24小時前1∶0.3-0.5V/Vm，24小時後1∶1V/Vm，攪拌深層培養44小時。然後培養液經過濾，菌絲用水衝洗，空氣吹乾取出菌絲17公斤，再懸浮於100公升磷酸鹽緩衝液中(磷酸氫二鉀0.36%;磷酸二氫鉀0.04%，PH7.2)，同時加入預先溶解的喜樹鹼濃溶液10克/100公升(PH9.5)，在27±1℃，通氣量1∶1V/Vm，和攪拌條件下轉化40小時。用雙波長紫外薄層掃描法測得轉化液中每毫升含65微克的10-羥基喜樹鹼。
轉化液再經過濾，菌絲用少量PH9.5的蒸餾水淋洗，合併後共得濾液130公升，內含10-羥基喜樹鹼總量5.2克，濾液內加入氯化鈉260克，用6NHCl調PH至6.8-7.0，通過內含5公斤的隋性大孔樹脂吸附柱吸附後，用15公升0.5%氯化鈉溶液淋洗，然後用PH9.5蒸餾水洗脫，得洗脫液30公升，內含10-羥基喜樹鹼4.9克。洗脫液中加入氯化鈉60克，並用6NHCl調PH至6.8-7.0，再通過內含2.5公升的隋性大孔樹脂吸附柱吸附，用10公升0.5%氯化鈉溶液淋洗，再用少量蒸餾水淋洗後，然後用工業乙醇洗脫，得乙醇洗脫液15公升，內含10-羥基喜樹鹼4.6克。乙醇洗脫液經減壓濃縮至幹後，加乙酸乙脂∶甲醇＝1∶1混合溶劑2公升迥流，迥流液濃縮至小體積，過濾，固體用少量甲醇和石油醚洗過後乾燥，得粗品4克。粗品用1.5公升氯仿∶甲醇＝1∶1混合溶劑溶解後過濾，濾液經減壓濃縮至有少量結晶析出，放入冰箱，隔天取出過濾，用少量氯仿∶甲醇＝1∶1混合溶劑淋洗晶體，真空乾燥，得純結晶2.5克，含10-羥基喜樹鹼99.53%，質量符合藥檢規格。
《表1》轉化後獲得產物和天然的10-羥基喜樹鹼的理化性質測定數據的比較測定項目 轉化後獲得產物 天然的10-羥基喜樹鹼熔點(分解) 266.5-268℃ 266-267℃旋光〔α〕20D-140°(C.0.4吡啶) -147°(C0.0674吡啶)質譜M/e 364(M+) 364(M+)元素分析 C，62.44 H，4.54 N，7.21 C，62.97 H，4.41 N，7.17紅外光譜釐米-13180，1760，1655，1590 3180，1760，1655，1590紫外光譜 225(4.70)，267(4.45) 225(4.75)，267(4.50)λ甲醇max(logE) 332(4.09)，384(4.47) 332(4.16)，384((4.53)核磁共振譜 0.84(三，3H，J＝7) 0.88(三，3H，J＝7)溶劑DMSO 1.82(四，2H，J＝7) 1.86(四，2H，J＝7)5.14(單，2H) 5.18(單，2H)5.38(單，2H) 5.41(單，2H)6.40(單，1H，重水交換) 6.44(單，1H，重水交換)7.26(單，1H) 7.26(單，1H)7.16-7.48(多，2H) 7.20-7.52(多，2H)7.95(雙，1H，J＝8) 8.04(雙，1H，J＝8)8.30(單，1H) 8.42(單，1H)10.20(寬，1H，重水交換) 10.30(寬，1H，重水交換)
表2三批10-羥基喜樹鹼的提取數據《表3》三批轉化的10-羥基喜樹鹼的質量數據測定項目 Ⅰ Ⅱ Ⅲ 標準含水量 ＜1 ＜1 ＜1 ＜3喜樹鹼含量(%) ＜1 ＜1 ＜1 ＜110-羥基喜樹鹼含量(%) 97.61 99.53 97.11 ＞93螢光雜質斑點 ＜3 ＜3 ＜3 ＜權利要求
1.由生物轉化喜樹鹼生產10-羥基喜樹鹼的方法，以喜樹鹼為原料，通過麴黴菌株T-36的生物轉化和溶媒提取方法製得10-羥基喜樹鹼。本發明特徵在於該方法由A，黃麴黴菌株T-419生物轉化。B.發酵液經填充大孔樹脂提取。C.濃縮物由醋酸乙酯甲醇迥流所組成。
2.根據權利要求
1A所述方法其特徵在於黃麴黴菌株T-419的轉化菌絲培養基為葡萄糖2.5%;黃豆並粉2.5%;澱粉1%;氯化鈉0.1%;硫酸鎂0.05%;磷酸氫二鉀0.38%;磷酸二氫鉀0.04%;消前自然PH。
3.根據權利要求
1A所述的方法其特徵在於喜樹鹼的轉化是在懸浮菌絲的磷酸緩衝液內進行，磷酸緩衝液的組成為磷酸二氫鉀0.04%;磷酸氫二鉀0.36%。
4.根據權利要求
1A所述的方法其特徵在於轉化溫度為26-28℃;通氣量為1∶1V/Vm;轉化的喜樹鹼濃度為50-150微克/毫升;攪拌情況下轉化40小時。
5.根據權利要求
1B所述的方法其特徵在於採用填充的大孔樹脂為隋性大孔樹脂。
6.根據權利要求
1B所述的方法其特徵在於含有10-羥基喜樹鹼的發酵液通過隋性大孔樹脂的吸附是在調節發酵液PH為6.6-7.2和使含有0.2%氯化鈉濃度下進行吸附。
7.根據權利要求
1B所述的方法其特徵在於洗脫液為PH9-10.5的蒸餾水。
8.根據權利要求
1C所述的方法其特徵在於採用醋酸乙酯∶甲醇＝1∶1的混合溶劑迥流。
專利摘要
本發明系用生物轉化的方法，採用無毒黃麴黴菌株T-419，可將在喜樹中含量較高的喜樹鹼轉化為10-羥基喜樹鹼，轉化率達50％以上。本發明並採用惰性大孔樹脂的分離提取新工藝，將轉化後的10-羥基喜樹鹼在大孔樹脂上吸附和分配層析，最後可得到符合藥規的產品，提取收率為50％，採用本發明生產10-羥基喜樹鹼比原方法優點是藥源擴大，原材料節約。
文檔編號C07D498/00GK85100520SQ85100520
公開日1986年8月13日 申請日期1985年4月1日
發明者朱關平 申請人:中國科學院上海藥物研究所導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan