高生產能力的α－澱粉酶的製作方法

2023-05-23 11:12:36

專利名稱：高生產能力的α－澱粉酶的製作方法
技術領域：
本發明涉及生產能力提高了的突變α-澱粉酶。
本發明人近來發現了來自芽孢桿菌屬嗜鹼性菌株KSM-K38(FERMBP-6946)的具有螯合劑和氧化作用抗性的液化鹼性α-澱粉酶(日本專利申請平10-362487，日本專利申請平10-362488)；和耐熱性提高了的改良酶(日本專利申請平11-163569)。
除這些特性外，考慮到這些酶的工業生產，用於洗滌劑的酶還要具有高生產能力。儘管應用蛋白質工程技術做了各種試驗以提高用於洗滌劑的α-澱粉酶的耐熱性和氧化劑抗性，但對生產能力的改進還沒有被認為是足夠的，也沒有試圖通過突變結構基因增加產量的報導。
本發明的目的是提供具有優秀生產能力的突變α-澱粉酶。
因此，本發明一方面提供了一種突變的α-澱粉酶，該酶從具有SEQ ID No.1所代表的胺基酸序列或顯示與該序列有至少60％同源性的α-澱粉酶衍生而來，衍生方式是替代或缺失相應於該胺基酸序列的Pro18、Gln86、Glu130、Asn154、Arg171、Ala186、Glu212、Val222、Tyr243、Pro260、Lys269、Glu276、Asn277、Arg310、Glu360、Gln391、Trp439、Lys444、Asn471和Gly476中任何一個的至少一個胺基酸殘基。
本發明另一方面提供了一種突變α-澱粉酶，該酶從具有SEQ IDNo.2所代表的胺基酸序列或顯示與該序列有至少60％同源性的α-澱粉酶衍生而來，衍生方式是替代或缺失相應於該胺基酸序列的Asp128、Gly140、Ser144、Arg168、Asn181、Glu207、Phe272、Ser375、Trp434和Glu466中任何一個的至少一個胺基酸殘基。
本發明再一方面，還提供了編碼這種突變α-澱粉酶的基因、包含該基因的載體、用該載體轉化的細胞和突變α-澱粉酶的生產方法，該方法包括培養該轉化細胞。
本發明再一方面還提供了包含該突變α-澱粉酶的洗滌劑組合物。
圖2是圖解說明向來自菌株KSM-1378或KSM-K38的α-澱粉酶基因導入突變的方法。
本發明構建了突變α-澱粉酶，使得在構成α-澱粉酶的胺基酸中，參與生產能力的胺基酸殘基被另外的胺基酸殘基替代或被缺失。這裡可用的α-澱粉酶的實例包括來自解澱粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)或地衣芽孢桿菌的液化α-澱粉酶，以及來自芽孢桿菌屬嗜鹼性微生物的液化鹼性α-澱粉酶，其中優選具有SEQ IDNo.1或SEQ ID No.2所代表的胺基酸序列的α-澱粉酶和與上述胺基酸序列有至少60％同源性的α-澱粉酶。
具有SEQ ID No.1所代表的胺基酸序列的α-澱粉酶或與其有至少60％同源性的α-澱粉酶的實例，包括來自芽孢桿菌屬菌株KSM-AP1378(FERM BP-3048)的液化鹼性α-澱粉酶(日本專利申請公開文本平8-336392)和通過蛋白質工程技術構建的上述酶在耐熱性和氧化劑抗性上的改良酶(WO98/44126)。
具有SEQ ID No.2所代表的胺基酸序列的α-澱粉酶或與其有至少60％同源性的α-澱粉酶的實例，包括來自芽孢桿菌屬菌株KSM-K38(FERM BP-6946)的液化鹼性α-澱粉酶和通過蛋白質工程技術構建的上述酶在耐熱性上的改良酶(日本專利申請平11-163569)。
胺基酸序列的同源性用Lipman-Pearson方法計算(科學(Science)227，1435(1985))。
本發明的突變α-澱粉酶可通過首先從產生α-澱粉酶的微生物中克隆編碼α-澱粉酶的基因獲得。為此目的，通常利用基因重組技術，例如可使用日本專利申請公開文本平8-336392中描述的方法。這裡可使用的基因實例包括編碼SEQ ID No.1或SEQ ID No.2所代表胺基酸序列的SEQ ID No.3或SEQ ID No.4所代表的基因。也可使用來自上述基因而且耐熱性和氧化劑抗性提高了的突變基因。
為了對這樣通過克隆獲得的基因進行突變，可採用通常使用的任何定點誘變方法。例如，可使用「定點誘變系統Mutan-SuperExpress Km」試劑盒(Takara Shuzo有限公司產品)進行突變。
用於獲得本發明的高生產能力α-澱粉酶的突變可通過例如以下方式實現在具有SEQ ID No.1所代表的胺基酸序列或與該序列有至少60％同源性的α-澱粉酶中替代或缺失相應於該胺基酸序列中Pro18、Gln86、Glu130、Asn154、Arg171、Ala186、Glu212、Val222、Tyr243、Pro260、Lys269、Glu276、Asn277、Arg310、Glu360、Gln391、Trp439、Lys444、Asn471和Gly476之任一個的至少一個胺基酸殘基；或在具有SEQ ID No.2所代表的胺基酸序列或與該序列有至少60％同源性的另一種α-澱粉酶中替代或缺失相應於該胺基酸序列中Asp128、Gly140、Ser144、Arg168、Asn181、Glu207、Phe272、Ser375、Trp434和Glu466之任一個的至少一個胺基酸殘基。優選的突變包括，在SEQ ID No.1的胺基酸序列中用Ser或Thr替代相應於Pro18的胺基酸殘基，用Glu替代相應於Gln86的胺基酸殘基，用Val或Gln替代相應於Glu130的胺基酸殘基，用Asp替代相應於Asn154的胺基酸殘基，用Cys或Gln替代相應於Arg171的胺基酸殘基，用Val或Asn替代相應於Ala186的胺基酸殘基，用Asp替代相應於Glu212的胺基酸殘基，用Glu替代相應於Val222的胺基酸殘基，用Cys或Ser替代相應於Tyr243的胺基酸殘基，用Glu替代相應於Pro260的胺基酸殘基，用Gln替代相應於Lys269的胺基酸殘基，用His替代相應於Glu276的胺基酸殘基，用Ser或Phe替代相應於Asn277的胺基酸殘基，用Ala替代相應於Arg310的胺基酸殘基，用Gln替代相應於Glu360的胺基酸殘基，用Glu替代相應於Gln391的胺基酸殘基，用Arg替代相應於Trp439的胺基酸殘基，用Arg替代相應於Lys444的胺基酸殘基，用Asp或Glu替代相應於Asn471的胺基酸殘基，或用Asp替代相應於Gly476的胺基酸殘基；或在SEQ ID No.2的胺基酸序列中，用Val或Gln替代相應於Asp128的胺基酸殘基，用Ser替代相應於Gly140的胺基酸殘基，用Pro替代相應於Ser144的胺基酸殘基，用Gln替代相應於Arg168的胺基酸殘基，用Val替代相應於Gln181的胺基酸殘基，用Asp替代相應於Glu270的胺基酸殘基，用Ser替代相應於Phe272的胺基酸殘基，用Pro替代相應於Ser375的胺基酸殘基，用Arg替代相應於Trp434的胺基酸殘基，或用Asp替代相應於Glu466的胺基酸殘基。
在SEQ ID No.1的胺基酸序列的突變中，那些通過用Glu替代相應於Gln86的胺基酸殘基，用Val或Gln替代相應於Glu130的胺基酸殘基，用Asn替代相應於Ala186的胺基酸殘基，用Ser替代相應於Tyr243的胺基酸殘基，用Glu替代相應於Pro260的胺基酸殘基，用Gln替代相應於Lys269的胺基酸殘基，用Phe替代相應於Asn277的胺基酸殘基，以及用Asp或Glu替代相應於Asn471的胺基酸殘基產生的突變，能夠使α-澱粉酶在培養基或其脫鹽並濃縮的溶液中的溶解性提高。更具體地說，上述突變可以將在脫鹽並濃縮的溶液中4℃貯存一周後α-澱粉酶的殘餘活性與突變前的活性相比提高至少5％，特別地提高10％。因此，對於通過這種胺基酸突變獲得的本發明突變α-澱粉酶，可以以高產率得到高濃度的發酵濃縮液，並且在發酵生產之後可有效地進行酶的配製處理如超濾。
兩個或多個各種胺基酸殘基的替代或缺失的組合對這種胺基酸突變也是有效的。也可將上面舉例說明的突變與改善酶特性的突變結合起來，例如，在具有SEQ ID No.1所代表的胺基酸序列或與該序列有至少60％同源性的α-澱粉酶中，通過缺失相應於Arg181或Gly182的胺基酸殘基以提高耐熱性的突變，通過用Thr替代相應於Met222的胺基酸殘基以提高氧化劑抗性的突變，或通過用Gln替代的相應於Lys484的胺基酸殘基以提高溶解性的突變；或在具有SEQ ID No.2所代表的胺基酸序列或與該序列有至少60％同源性的α-澱粉酶中，通過用Leu替代相應於Met107的胺基酸殘基以進一步加強氧化劑抗性的突變，或通過用Ile替代相應於Glu188的胺基酸殘基以提高洗衣用洗滌劑的去汙力的突變。
通過以下方式可得到高產率的突變α-澱粉酶將突變α-澱粉酶結構基因與控制基因和合適的載體適當地結合在一起，由此構建用於生產α-澱粉酶的質粒，將產生的質粒導入微生物如枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)或大腸桿菌(Escherichia coli)，優選枯草芽孢桿菌，並培養產生的重組微生物。
如後面實施例所示，這樣獲得的突變α-澱粉酶的生產能力提高大約10-500％，同時保持了作為酶的生化特性，因此具有優秀的特性。通過對具有耐熱性、螯合劑抗性、氧化劑抗性和高溶解性的液化鹼性α-澱粉酶的胺基酸殘基進行上述突變，可產生在重組微生物中生產能力大大提高但並不喪失上述原有特性的有用的酶。
除了本發明的α-澱粉酶外，本發明的洗滌劑組合物還可以包含選自如下酶的一種或一種以上酶脫支酶(例如支鏈澱粉酶、異澱粉酶、新支鏈澱粉酶(neopullulanase))、α-葡糖苷酶、葡糖澱粉酶、蛋白酶、纖維素酶、脂肪酶、果膠酶、原果膠酶、果膠酸裂合酶、過氧化物酶、漆酶和過氧化氫酶。
另外，洗滌劑組合物還可包含常規加至洗滌劑中的成分，例如，表面活性劑(如陰離子表面活性劑、兩性表面活性劑、非離子表面活性劑和陽離子表面活性劑)、螯合劑、鹼性劑(alkali agents)、無機鹽、抗再沉積劑、氯清除劑、還原劑、漂白劑、螢光染料促溶劑、香料、防結塊劑、酶活化劑、抗氧化劑、殺菌劑、上藍劑(blueing agents)、漂白活化劑、酶穩定劑和調節劑。
本發明的洗滌劑組合物可以用本領域已知的方式從可通過上述方法獲得的高生產能力的α-澱粉酶和上述已知的洗滌劑成分相結合生產。可根據使用目的選擇洗滌劑的形式，實例包括液態、粉末或顆粒。本發明的洗滌劑組合物適合用作洗衣洗滌劑、漂白洗滌劑、自動洗碟機使用的洗滌劑、管道清潔劑和假牙清潔劑，其中尤其適合用作洗衣洗滌劑、漂白洗滌劑和自動洗碟機使用的洗滌劑。
本發明高生產能力的α-澱粉酶也可用作澱粉液化糖化組合物。而且，這些突變α-澱粉酶在加入選自葡糖澱粉酶、麥芽糖酶、支鏈澱粉酶、異澱粉酶和新支鏈澱粉酶的一種或一種以上酶之後，可被允許作用於澱粉。
並且，本發明的突變α-澱粉酶可用作纖維的退漿組合物，而且象支鏈澱粉酶、異澱粉酶或新支鏈澱粉酶之類的酶也可加到該組合物中。實施例澱粉酶活性和蛋白含量的測定根據下述方法檢測從重組枯草芽孢桿菌產生的每一種酶的澱粉酶活性和蛋白含量。
澱粉酶活性用3，5-二硝基水楊酸法(DNS法)測定。在含有可溶性澱粉的40mM甘氨酸-NaOH緩衝液(pH10)的反應混合物中50℃反應15分鐘後，用DNS法定量分析形成的還原糖。作為酶的滴度，在一分鐘內形成相當於1μmol葡萄糖的還原糖的酶量定義為一個單位。
蛋白含量用「蛋白檢測試劑盒」(Protein Assay Kit)(Bio-RadLaboratories產品)測定，以牛血清蛋白為標準品。參考實施例1液化鹼性澱粉酶的篩選將大約0.5克泥土懸浮於滅菌水中，產生的懸浮液在80℃加熱處理15分鐘。熱處理混合物的上清用足量的滅菌水稀釋，然後塗在一種分離用的瓊脂培養基(培養基A)上。然後該培養基在30℃培養2天以生長菌落。選擇並分離由於澱粉分解而在其周圍形成透明區的菌落作為產澱粉酶菌株。產生的分離菌株接種於培養基B，然後在30℃通氣振蕩培養2天。培養後測定離心獲得的上清的螯合劑(EDTA)抗性，另外，測定最適工作pH。由此獲得了菌株芽孢桿菌屬KSM-K38(FERM BP-6946)。
培養基A胰蛋白腖 1.5％豆腖 0.5％氯化鈉0.5％有色澱粉(colored starch) 0.5％瓊脂 1.5％碳酸鈉0.5％(pH10)培養基B胰蛋白腖1.5％豆腖0.5％氯化鈉 0.5％可溶性澱粉 1.0％碳酸鈉 0.5％(pH10)菌株KSM-K38的真菌學特性見表1。
表1

參考實施例2菌株KSM-K38的培養在參考實施例1的液體培養基B中接種菌株KSM-K38，然後在30℃通氣振蕩培養2天。檢測離心分離的每一份上清中的澱粉酶活性。結果1L培養基中的活性為1179U。參考實施例3液化鹼性澱粉酶的純化向參考實施例2中獲得的菌株KSM-K38的培養基上清中加入硫酸胺到80％的飽和度，然後攪拌。收集由此生成的沉澱並溶於含有2mMCaCl2的10mM Tris-HCl緩衝液中(pH7.5)，產生的溶液對該緩衝液透析過夜。透析物上樣到用相同緩衝液平衡的DEAE-Toyopearl650M柱上，用在相同緩衝液中的0-1M NaCl線性梯度洗脫蛋白。對相同緩衝液透析後經凝膠過濾柱層析獲得的活性組分對該緩衝液透析，由此獲得了在聚丙烯醯胺凝膠電泳(凝膠濃度10％)和十二烷基磺酸鈉(SDS)電泳中顯示一條帶的純化酶。參考實施例4酶學特性純化酶的特性如下(1)作用對象它作用於澱粉、直鏈澱粉、支鏈澱粉和其部分降解產物α-1，4-葡糖苷鍵，降解它們並從直鏈澱粉生產葡萄糖(G1)、麥芽糖(G2)、麥芽三糖(G3)、麥芽四糖(G4)、麥芽五糖(G5)、麥芽六糖(G6)和麥芽七糖(G7)。但它不作用於普魯蘭(pullulan)。
(2)pH穩定性(Britton-Robinson緩衝液)在pH6.5-11.0範圍內、在處理條件下40℃處理30分鐘，顯示殘餘活性為70％或更高。
(3)工作溫度範圍和最適工作溫度它在20-80℃的很寬溫度範圍內起作用，最適工作溫度為50-60℃。
(4)溫度穩定性通過在50mM甘氨酸-氫氧化鈉緩衝液(pH10)中改變溫度，然後在每一溫度處理30分鐘，來測定酶喪失活性時的溫度。在40℃酶的殘餘活性為80％或更多，甚至在45℃酶的殘餘活性約為60％。
(5)分子量用十二烷基磺酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳測定的分子量為55,000±5,000。
(6)等電點用等電聚焦電泳測定的等電點約為4.2。
(7)表面活性劑的影響在0.1％表面活性劑的溶液中在pH10、30℃處理30分鐘，它的活性幾乎不受抑制(活性殘餘比為90％或更多)，這些表面活性劑例如支鏈烷基苯磺酸鈉、烷基硫酸酯鈉鹽、聚氧乙烯烷基硫酸酯鈉鹽、α-烯烴磺酸鈉、α-磺化脂肪酸酯鈉鹽、烷基磺酸鈉、SDS、肥皂和softanol。
(8)金屬鹽的影響在含有各種不同金屬鹽的每一個反應系統中於pH10、30℃處理30分鐘，研究它們的影響。它的活性被1mM Mn2+抑制(抑制比約75％)，被1mM Sr2+和Cd2+輕度抑制(抑制比為約30％)。實施例1連接有α-澱粉酶基因的各種不同重組質粒的製備根據WO98/44126中敘述的方法，通過缺失來自芽孢桿菌屬菌株KSM-AP1378(FERM BP-3048)並且具有SEQ ID No.1所代表胺基酸序列的α-澱粉酶(「LAMY」)的Arg181和Gly1812；和通過在這種缺失突變之外，再用Thr替代SEQ ID No.1所代表的胺基酸序列的Met202，分別構建編碼耐熱性提高了的突變α-澱粉酶(下文將描述為「ΔRG」)和氧化劑抗性和耐熱性都提高了的突變α-澱粉酶(「ΔRG-M202T」)的基因。以這些基因為模板，用引物LAUS(SEQ IDNo.5)和LADH(SEQ ID No.6)通過PCR反應擴增編碼這些突變α-澱粉酶的基因片段(約1.5kb)。用限制性酶SalI酶切後，將每一片段插入表達載體pHSP64(日本專利申請公開文本平6-217781)的SalI-SmaI位點，由此構建連接有各個突變α-澱粉酶結構基因的質粒，其中結構基因位於來自芽孢桿菌屬菌株KSM-64(FERM P-10482)的鹼性纖維素酶基因的強啟動子下遊。
同時，用Saito和Miura的方法(生物化學生物物理學報(Biochim.Biophys.Acta)，72，619(1961))，從芽孢桿菌屬菌株KSM-K38(FERM BP-6946)的細胞抽提染色體DNA作為模板，用表2所示的引物K38US(SEQ ID No.7)和K38DH(SEQ ID No.8)進行PCR反應，由此擴增編碼具有SEQ ID No.2所代表胺基酸序列的α-澱粉酶(下文將描述為「K38AMY」)的結構基因片段(約1.5kb)。經限制性酶SalI酶切後，將產生的片段插入到表達載體pHSP64的SalI-SmaI位點，以構建一個連接有K38AMY結構基因的重組質粒(

圖1)，其中結構基因位於pHSP64含有的來自芽孢桿菌屬菌株KSM-64(FERM P-10482)鹼性纖維素酶基因的強啟動子下遊。以該重組質粒為模板，用引物CLUBG(SEQ ID No.9)和K38DH(SEQ ID No.8)進行PCR反應，擴增含有該強啟動子和連接在其上的K38AMY的基因片段。
用下述的重組PCR方法構建了一個編碼K38AMY和LAMY之間的嵌合α-澱粉酶的基因。具體地說，以菌株KSM-K38(FERM BP6946)的染色體DNA為模板，用表2所示的引物K38DH(SEQ ID No.8)和LA-K38(SEQ ID No.10)進行PCR反應，以擴增編碼SEQ ID No.2所代表的K38AMY胺基酸序列中從Gln20向下遊到C-末端的序列的片段。用上述含有LAMY基因和強啟動子的重組質粒為模板，用表2所示的引物CLUBG(SEQ ID No.9)和LA-K38R(SEQ ID No.11)進行PCR反應，以擴增編碼SEQ ID No.1的LAMY胺基酸序列中從上遊強啟動子到Gly21的基因片段。通過用產生的兩個DNA片段和表2所示的引物CLUBG(SEQ ID No.9)和K38DH(SEQ ID No.8)進行第二次PCR反應，將產生的其末端有分別來自引物LA-K38(SEQ IDNo.10)和LA-K38R(SEQ ID No.11)的互補序列的兩個片段組合在一起，由此擴增了嵌合α-澱粉酶(下文將描述為「LA-K38AMY」)的基因片段(約2.1kb)，該嵌合α-澱粉酶連續地連接有編碼強啟動子下遊從LAMY的His1到Gly21的區段和編碼從K38AMY的Gln20到C-末端的區段。
用「定點誘變系統Mutan-Super Express Km」試劑盒(TakaraShuzo有限公司產品)，將下述突變導入K38AMY和LA-K38AMY。首先，將K38AMY和LA-K38AMY的基因片段插入該試劑盒附帶的質粒載體pKF19k的SmaI位點，以構建誘變重組質粒(圖2)。用T4 DNA激酶將表2中的定點誘變寡核苷酸引物N190F(SEQ ID No.50)5』-磷酸化。用該引物和上述誘變重組質粒，按照試劑盒的方法進行誘變。並且用反應的產物轉化大腸桿菌MV1184(「感受態細胞MV1184」，Takara Shuzo有限公司產品)。從這樣獲得的轉化體抽提重組質粒，然後分析鹼基序列，藉以證實用Phe替代Asn190的突變。通過相繼利用引物A209V(SEQ ID No.51)和QEYK(SEQ IDNo.49)以上面的類似方式將誘變反應重複引入該突變基因，由此分別用Phe和Val替代SEQ ID No.2所代表的K38AMY胺基酸序列的Asn190和Gln209，並用SEQ ID No.1所代表的LAMY胺基酸序列的His1-Gly21序列替代SEQ ID No.2所代表的K38AMY胺基酸序列的Asp1-Gly19序列；分別用Glu、Lys、Phe和Val替代K38AMY胺基酸序列的Gln167、Tyr169、Asn190和Gln209，並用LAMY胺基酸序列的His1-Gly21序列替代K38AMY胺基酸序列的Asp1-Gly19序列；以及分別用 Glu、Lys、Phe和Val替代K38AMY的胺基酸序列Gln167、Tyr169、Asn190和Gln209，分別構建了編碼一種耐熱性提高了的突變α-澱粉酶(此後將描述為「LA-K38AMY/NFQV」)、一種大大提高了耐熱性的突變α-澱粉酶(「LA-K38AMY/QEYK/NFQV」)和一種提高了耐熱性的突變α-澱粉酶(「QEYK/NFQV」)的基因。
以這些基因為模板，用引物K38US(SEQ ID No.7)和K38DH(SEQ ID No.8)進行PCR反應以擴增編碼突變α-澱粉酶的結構基因片段(約1.5kb)。然後以上述類似方法將其插入表達載體pHSP64的SalI-SmaI位點，由此構建連接了這些突變α-澱粉酶的結構基因的重組質粒(圖1)。實施例2引入突變以提高α-澱粉酶的生產能力用「定點誘變系統Mutan-Super Express Km」試劑盒(Takara Shuzo有限公司產品)進行定點誘變以提高重組枯草芽孢桿菌的澱粉酶生產能力。以實施例1中獲得的各種重組質粒為模板，對ARG和ARG/M202T用引物CLUBG(SEQ ID No.9)和LADH(SEQ IDNo.6)進行PCR反應，而對K38AMY、LA-K38AMY/NFQV、LA-K38AMY/QEYK/NFQV和QEYK/NFQV用引物CLUBG(SEQ ID No.9)和K38DH(SEQ ID No.8)進行PCR反應，由此擴增從來自菌株KSM-64的上遊強啟動子到下遊α-澱粉酶基因的約2.1kb的片段。將這些擴增片段插入上述試劑盒附帶的質粒載體pKF19k的SmaI位點，由此構建各種誘變重組質粒(圖2)。
用T4 DNA激酶將表2中列出的用於定點誘變的各種寡核苷酸引物(SEQ ID Nos.12-51)5』-磷酸化，並利用產生的產物和上面的誘變重組質粒按照試劑盒描述的方法進行誘變。用反應產物轉化菌株大腸桿菌MV1184(「感受態細胞MV1184」，Takara Shuzo有限公司產品)。從產生的轉化體中抽提重組質粒，然後分析鹼基序列以證實突變。
表2

在鹼基序列中「N」是指A、T、G和C的混合鹼基，而「Y」是指T和C的混合鹼基。
通過再次以上述類似的方式將一個表達啟動子區和突變α-澱粉酶基因部分插入pKF19k的SmaI位點，當引入另一突變位點時，該引入突變的基因成為模板質粒。這樣以上述方法的類似方式引入另一個突變。
用這些如此獲得的突變重組質粒作為模板，用引物CLUBG(SEQID No.9)和LADH(SEQ ID No.6)或引物CLUBS(SEQ ID No.9)和K38DH(SEQ ID No.8)進行PCR，擴增突變基因片段。用SalI將它們切割後，插入表達載體pHSP64的SalI-SmaI位點，以構建產生突變α-澱粉酶的各種質粒(圖1)。實施例3突變α-澱粉酶的生產根據原生質體方法將實施例2中獲得的產生突變α-澱粉酶的各種質粒均導入枯草芽孢桿菌ISW1214(LeuA metBS5 hsdM1)中。如此獲得的重組枯草芽孢桿菌在液體培養基中(4％玉米浸液、1％胰蛋白腖、1％肉膏、0.1％磷酸二氫鉀(monopotassium phosphate)、0.01％硫酸鎂、2％麥芽糖、0.1％氯化鈣、15μg/ml四環素)於30℃培養4天。用培養基上清測量每一個突變α-澱粉酶的活性。實施例4澱粉酶生產能力的評價-1分析下列每一種酶的澱粉酶生產能力；用Ser替代了ΔRG的Pro18的酶(以下將簡寫為「P18S/ΔRG」)、用Glu替代了Gln86的酶(「Q86E/ΔRG」)、用Val替代了Glu130的酶(「E130V/ΔRG」)、用Asp替代了A8n154的酶(「N154D/ΔRG」)、用Cys替代了Arg171的酶(「R171C/ΔRG」)、用Val替代了Ala186的酶(「A186V/ΔRG」)、用Asp替代了Glu212的酶(「E212D/ΔRG」)、用Glu替代了Val222的酶(「V222E/ΔRG」)、用Cys替代了Tyr243的酶(「Y243C/ΔRG」)、用Glu替代了Pro260的酶(「P260E/ΔRG」)、用Gln替代了Lys269的酶(「K269E/ΔRG」)、用His替代了Glu276的酶(「E276H/ΔRG」)、用Ser替代了Asn277的酶(「N277S/ΔRG」)、用Ala替代了Arg310的酶(「R310A/ΔRG」)、用Gln替代了Glu360的酶(「E360Q/ΔRG」)、用Glu替代了Gln391的酶(「Q391E/ΔRG」)、用Arg替代了Trp439的酶(「W439R/ΔRG」)、用Arg替代了Lys444的酶(「K444R/ΔRG」)、用Asp替代了Asn471的酶(「N471D/ΔRG」)和用Asp替代了Gly476的酶(「G476D/ΔRG」)。用ΔRG作對照。將ΔRG的澱粉酶生產能力定為100％，測定澱粉酶生產能力的相對值(％)。結果見表3。
表3酶 相對澱粉酶生產能力(％)ΔRG 100P18S/ΔRG277Q86E/ΔRG119E130V/ΔRG 362N154D/ΔRG 146R171C/ΔRG 235A186V/ΔRG 485E212D/ΔRG 327V222E/ΔRG 135Y243C/ΔRG 350P260E/ΔRG 142K269Q/ΔRG 142E276H/ΔRG 231N277S/ΔRG 312R310A/ΔRG 208E360Q/ΔRG 162Q391E/ΔRG 127W439R/ΔRG 312K444R/ΔRG 112N471D/ΔRG 292G476D/ΔRG 296任何一個突變酶都顯示了比ΔRG高的澱粉酶生產能力，表明在重組枯草芽孢桿菌中，突變提高了澱粉酶的生產能力。特別地，E130V/ΔRG、A186V/ΔRG、E212D/ΔRG、Y243C/ΔRG、N277S/ΔRG和W439R/ΔRG中每一種酶的澱粉酶生產能力都比ΔRG高至少3倍，並且最突出的是，A186V/ΔRG顯示了顯著高的生產能力，比ΔRG幾乎高5倍。實施例5澱粉酶生產能力的評價-2以與實施例1、2和3描述的方法類似的方式，分析下列每一種酶的澱粉酶生產能力用Thr替代了ΔRG/MT的Pro18的酶(以下將簡寫為「P18T/ΔRG/MT」)、用Glu替代了Gln86的酶(「Q86E/ΔRG/MT」)、用Val替代了Glu130的酶(「E130V/ΔRG/MT」)、用Asn替代了Ala186的酶(「A186N/ΔRG/MT」)、用Ser替代了Tyr243的酶(「Y243S/ΔRG/MT」)、用Phe替代了Asn277的酶(「N277F/ΔRG/MT」)和用Glu替代了Asn471的酶(「N471E/ΔRG/MT」)。用ΔRG/MT作對照。結果見表4。
表4酶相對澱粉酶生產能力(％)ΔRG/MT 100P18T/ΔRG/MT 200Q86E/ΔRG/MT 144E130V/ΔRG/MT 344A186N/ΔRG/MT 344Y243S/ΔRG/MT 189N277F/ΔRG/MT 256N471E/ΔRG/MT 211可以看出，與ΔRG/MT相比，上述任何一種突變酶都顯示了高的澱粉酶生產能力。特別地，E130V/ΔRG/MT和A186N/ΔRG/MT中每一種酶的生產能力都比ΔRG/MT高至少3倍。實施例6澱粉酶生產能力的評價-3
根據實施例1、2、3中所用的方法，分析下列每一種酶的澱粉酶生產能力用Val替代了K38AMY的Asp128的酶(以下將簡寫為「D128V」)、用Ser替代了Gly140的酶(「G140S」)、用Pro替代了Ser144的酶(「S144P」)、用Gln替代了Arg168的酶(「R168Q」)、用Val替代了Asn181的酶(「N181V」)、用Asp替代了Glu207的酶(「E207D」)、用Ser替代了Phe272的酶(「F272S」)、用Pro替代了Ser375的酶(「S375P」)、用Arg替代了Trp434的酶(「W434R」)和用Asp替代了Glu466的酶(「E466D」)。用K38AMY作對照。結果見表5。
表5酶 相對澱粉酶生產能力(％)K38AMY 100D128V325G140S209S144P197R168Q264N181V207E207D109F272S175S375P115W434R124E466D212可以看出，與野生型K38AMY相比，任何一種突變酶都顯示了高的澱粉酶生產能力。特別地，D128V顯示了比K38AMY高至少3倍的高生產能力。實施例7澱粉酶生產能力的評價-4
根據實施例3描述的方法分析實施例6顯示的突變體中具有S144P和N181V雙突變的突變酶S144P/N181V(以下將簡寫為「SPNV」)的澱粉酶生產能力。用K38AMY、S144P和N181V作對照。結果見表6。
表6酶 相對澱粉酶生產能力(％)K38AMY 100S144P 197N181V 207SPNV257結果如表6所示，雙突變帶來澱粉酶生產能力的進一步提高。實施例8澱粉酶生產能力的評價-5根據實施例1、2、3中描述的方法，分析下列每種酶的澱粉酶生產能力用Gln替代耐熱性提高了的LA-K38AMY/NFQV基因中的Arg168獲得的酶(以下將簡寫為「R168Q/LA-K38AMY/NFQV」)，用Asp替代上述基因的Glu466獲得的酶(「E466D/LA-K38AMY/NFQV」)和將實施例6的雙突變引入該基因的酶(「SPNV/LA-K38AMY/NFQV」)。用LA-K38AMY/NFQV作對照。結果見表7。
表7酶相對澱粉酶生產能力(％)LA-K38AMY/NFQV100R168Q/LA-K38AMY/NFQV 304E466D/LA-K38AMY/NFQV 264SPNV/LA-K38AMY/NFQV 154
結果發現，該實施例中獲得的每一種酶都顯示了比LA-K38AMY/NFQV高至少約1.5倍的澱粉酶生產能力。特別地，R168Q/LA-K38AMY/NFQV顯示了高約3倍的澱粉酶生產能力。實施例9澱粉酶生產能力的評價-6根據實施例1、2和3描述的方法，分析下列每一種酶的澱粉酶生產能力用Val替代耐熱性提高了的酶LA-K38AMY/QEYK/NFQV基因中的Asp128獲得的酶(以下將簡寫為「D128V/LA-K38AMY/QEYK/NFQV」)，和將實施例6的雙突變引入了該基因的酶(「SPNV/LA-K38AMY/QEYK/NFQV」)。用LA-K38AMY/QEYK/NFQV作對照。結果見表8。
表8酶相對澱粉酶生產能力(％)LA-K38AMY/QEYK/NFQV 100D128V/LA-K38AMY/QEYK/NFQV 602SPNV/LA-K38AMY/QEYK/NFQV427結果發現，該實施例獲得的任何一種突變酶都顯示了比LA-K38AMY/QEYK/NFQV顯著高的澱粉酶生產能力。特別地，D128V/LA-K38AMY/QEYK/NFQV顯示了生產能力的急劇增加(約6倍)。實施例10澱粉酶生產能力的評價-7根據實施例1和2描述的方法，向實施例9所示突變酶裡生產能力急劇增加的D128V/LA-K38AMY/QEYK/NFQV中引入用Leu替代Met107以提高氧化劑抗性的突變(以下該突變將簡寫為「M107L」)(「ML/DV/LA-K38AMY/QEYK/NFQV」)。
然後，根據實施例4的方法，分析突變酶MM/DV/LA-K38AMY/QEYK/NFQV基因的澱粉酶生產能力。用D128V/LA-K38AMY/QEYK/NFQV作對照。結果見表9。
表9酶 相對澱粉酶生產能力(％)D128V/LA-K38AMY/QEYK/NFQV 100M107L/D128V/LA-K38AMY/QEYK/NFQV115突變酶ML/DV/LA-K38AMY/QEYK/NFQV的相對澱粉酶生產能力為115％，表明引入用以增強氧化劑抗性的M107L突變沒有對重組枯草芽孢桿菌的高澱粉酶生產能力產生不利影響。實施例11澱粉酶生產能力的評價8根據實施例1、2和3描述的方法，分析用Gln替代耐熱性提高了的酶QEYK/NFQV基因的Asp128獲得的酶(產生的酶以下將簡寫為「D128Q/QEYK/NFQV」)的澱粉酶生產能力。用QEYK/NFQV作對照。結果見表10。
表10酶 相對澱粉酶生產能力(％)QEYK/NFQV 100D128Q/QEYK/NFQV247可見突變酶顯示的生產能力比QEYK/NFQV高至少2倍。
表11

結果發現，當通過缺失Arg181和Gly182使耐熱性提高了的改良α-澱粉酶(ΔRG)在4℃貯存一周時，出現了該酶的沉澱，並且上清中剩餘的活性只有約一半。另一方面，通過在ΔRG-LAMY上進一步引入突變獲得的突變酶在上清中顯示了高的活性殘餘比，表明突變提高了溶解性。特別地，用Glu替代了Gln86的酶顯示了最高的酶溶解性，並且在該實施例條件下上清中剩餘80％的酶。實施例13用於自動洗碟機的洗滌劑組合物製備含有如表12所示成分的用於自動洗碟機的洗滌劑組合物，然後加入在增加生產能力的方法中獲得的各種突變酶。結果當和對照酶活性相等時，與對照酶相比，高產突變酶顯示了相似或更強的去汙力。
表12

工業應用能力根據使用本發明的突變α-澱粉酶，可以從重組微生物得到高產α-澱粉酶，使得它們的工業生產成本能夠大大降低。本發明中用於增加生產能力的突變對酶的生化特性沒有不利影響，因此能夠產生具有耐熱性、螯合劑抗性和氧化劑抗性並可作為洗滌劑用酶使用的高生產能力的液化鹼性α-澱粉酶。
序列表110KAO CORPORATION120高生產能力的α-澱粉酶130P0483121016051170PatentIn Ver.2.12101211485212PRT213芽孢桿菌屬KSM-AP13784001His His Asn Gly Thr Asn Gly Thr Met Met Gln Tyr Phe Glu Trp His5 10 15Leu Pro Asn Asp Gly Asn His Trp Asn Arg Leu Arg Asp Asp Ala Ala20 25 30Asn Leu Lys Ser Lys Gly Ile Thr Ala Val Trp Ile Pro Pro Ala Trp35 40 45Lys Gly Thr Ser Gln Asn Asp Val Gly Tyr Gly Ala Tyr Asp Leu Tyr50 55 60Asp Leu Gly Glu Phe Asn Gln Lys Gly Thr Val Arg Thr Lys Tyr Gly65 70 75 80Thr Arg Ser Gln Leu Gln Gly Ala Val Thr Ser Leu Lys Asn Asn Gly85 90 95Ile Gln Val Tyr Gly Asp Val Val Met Asn His Lys Gly Gly Ala Asp100 105 110Gly Thr Glu Met Val Asn Ala Val Glu Val Asn Arg Ser Asn Arg Asn115 120 125Gln Glu Ile Ser Gly Glu Tyr Thr Ile Glu Ala Trp Thr Lys Phe Asp130 135 140Phe Pro Gly Arg Gly Asn Thr His Ser Asn Phe Lys Trp Arg Trp Tyr145 150 155 160His Phe Asp Gly Thr Asp Trp Asp Gln Ser Arg Gln Leu Gln Asn Lys165 170 175Ile Tyr Lys Phe Arg Gly Thr Gly Lys Ala Trp Asp Trp Glu Val Asp180 185 190Ile Glu Asn Gly Asn Tyr Asp Tyr Leu Met Tyr Ala Asp Ile Asp Met195 200 205Asp His Pro Glu Val Ile Asn Glu Leu Arg Asn Trp Gly Val Trp Tyr210 215 220Thr Asn Thr Leu Asn Leu Asp Gly Phe Arg Ile Asp Ala Val Lys His225 230 235 240Ile Lys Tyr Ser Tyr Thr Arg Asp Trp Leu Thr His Val Arg Asn Thr245 250 255Thr Gly Lys Pro Met Phe Ala Val Ala Glu Phe Trp Lys Asn Asp Leu260 265 270Ala Ala Ile Glu Asn Tyr Leu Asn Lys Thr Ser Trp Asn His Ser Val275 280 285Phe Asp Val Pro Leu His Tyr Asn Leu Tyr Asn Ala Ser Asn Ser Gly290 295 300Gly Tyr Phe Asp Met Arg Asn Ile Leu Asn Gly Ser Val Val Gln Lys305 310 315 320His Pro Ile His Ala Val Thr Phe Val Asp Asn His Asp Ser Gln Pro325 330 335Gly Glu Ala Leu Glu Ser Phe Val Gln Ser Trp Phe Lys Pro Leu Ala340 345 350Tyr Ala Leu Ile Leu Thr Arg Glu Gln Gly Tyr Pro Ser Val Phe Tyr355 360 365Gly Asp Tyr Tyr Gly Ile Pro Thr His Gly Val Pro Ser Met Lys Ser370 375 380Lys Ile Asp Pro Leu Leu Gln Ala Arg Gln Thr Tyr Ala Tyr Gly Thr385 390 395 400Gln His Asp Tyr Phe Asp His His Asp Ile Ile Gly Trp Thr Arg Glu405 410 415Gly Asp Ser Ser His Pro Asn Ser Gly Leu Ala Thr Ile Met Ser Asp420 425 430Gly Pro Gly Gly Asn Lys Trp Met Tyr Val Gly Lys His Lys Ala Gly435 440 445Gln Val Trp Arg Asp Ile Thr Gly Asn Arg Ser Gly Thr Val Thr Ile450 455 460Asn Ala Asp Gly Trp Gly Asn Phe Thr Val Asn Gly Gly Ala Val Ser465 470 475 480Val Trp Val Lys Gln4852102211480212PRT213芽孢桿菌屬KSM-K384002Asp Gly Leu Asn Gly Thr Met Met Gln Tyr Tyr Glu Trp His Leu Glu
5 10 15Asn Asp Gly Gln His Trp Asn Arg Leu His Asp Asp Ala Ala Ala Leu20 25 30Ser Asp Ala Gly Ile Thr Ala Ile Trp Ile Pro Pro Ala Tyr Lys Gly35 40 45Asn Ser Gln Ala Asp Val Gly Tyr Gly Ala Tyr Asp Leu Tyr Asp Leu50 55 60Gly Glu Phe Asn Gln Lys Gly Thr Val Arg Thr Lys Tyr Gly Thr Lys65 70 75 80Ala Gln Leu Glu Arg Ala Ile Gly Ser Leu Lys Ser Asn Asp Ile Asn85 90 95Val Tyr Gly Asp Val Val Met Asn His Lys Met Gly Ala Asp Phe Thr100 105 110Glu Ala Val Gln Ala Val Gln Val Asn Pro Thr Asn Arg Trp Gln Asp115 120 125Ile Ser Gly Ala Tyr Thr Ile Asp Ala Trp Thr Gly Phe Asp Phe Ser130 135 140Gly Arg Asn Asn Ala Tyr Ser Asp Phe Lys Trp Arg Trp Phe His Phe145 150 155 160Asn Gly Val Asp Trp Asp Gln Arg Tyr Gln Glu Asn His Ile Phe Arg165 170 175Phe Ala Asn Thr Asn Trp Asn Trp Arg Val Asp Glu Glu Asn Gly Asn180 185 190Tyr Asp Tyr Leu Leu Gly Ser Asn Ile Asp Phe Ser His Pro Glu Val195 200 205Gln Asp Glu Leu Lys Asp Trp Gly Ser Trp Phe Thr Asp Glu Leu Asp
210 215 220Leu Asp Gly Tyr Arg Leu Asp Ala Ile Lys His Ile Pro Phe Trp Tyr225 230 235 240Thr Ser Asp Trp Val Arg His Gln Arg Asn Glu Ala Asp Gln Asp Leu245 250 255Phe Val Val Gly Glu Tyr Trp Lys Asp Asp Val Gly Ala Leu Glu Phe260 265 270Tyr Leu Asp Glu Met Asn Trp Glu Met Ser Leu Phe Asp Val Pro Leu275 280 285Asn Tyr Asn Phe Tyr Arg Ala Ser Gln Gln Gly Gly Ser Tyr Asp Met290 295 300Arg Asn Ile Leu Arg Gly Ser Leu Val Glu Ala His Pro Met His Ala305 310 315 320Val Thr Phe Val Asp Asn His Asp Thr Gln Pro Gly Glu Ser Leu Glu325 330 335Ser Trp Val Ala Asp Trp Phe Lys Pro Leu Ala Tyr Ala Thr Ile Leu340 345 350Thr Arg Glu Gly Gly Tyr Pro Asn Val Phe Tyr Gly Asp Tyr Tyr Gly355 360 365Ile Pro Asn Asp Asn Ile Ser Ala Lys Lys Asp Met Ile Asp Glu Leu370 375 380Leu Asp Ala Arg Gln Asn Tyr Ala Tyr Gly Thr Gln His Asp Tyr Phe385 390 395 400Asp His Trp Asp Val Val Gly Trp Thr Arg Glu Gly Ser Ser Ser Arg405 410 415Pro Asn Ser Gly Leu Ala Thr Ile Met Ser Asn Gly Pro Gly Gly Ser
420 425 430Lys Trp Met Tyr Val Gly Arg Gln Asn Ala Gly Gln Thr Trp Thr Asp435 440 445Leu Thr Gly Asn Asn Gly Ala Ser Val Thr Ile Asn Gly Asp Gly Trp450 455 460Gly Glu Phe Phe Thr Asn Gly Gly Ser Val Ser Val Tyr Val Asn Gln465 470 475 48021032111786212DNA213芽孢桿菌屬KSM-AP1378220221信號肽222(155)..(247)220221成熟肽222(248)..(1702)220221CDS222(155)..(1702)4003cagcgtgata atataaattt gaaatgaaca cctatgaaaa tatggtagcg attgcgcgac 60gagaaaaaac ttgggagtta ggaagtgata ttaaaggatt ttttttgact tgttgtgaaa 120acgcttgcat aaattgaagg agagggtgct tttt atg aaa ctt cat aac cgt ata 175att agc gta cta tta aca cta ttg tta gct gta gct gtt ttg ttt cca 223tat atg acg gaa cca gca caa gcc cat cat aat ggg acg aat ggg acc 271His His Asn Gly Thr Asn Gly Thr1 5atg atg cag tat ttt gaa tgg cat ttg cca aat gac ggg aac cac tgg 319Met Met Gln Tyr Phe Glu Trp His Leu Pro Asn Asp Gly Asn His Trp10 15 20aac agg tta cga gat gac gca gct aac tta aag agt aaa ggg att acc 367Asn Arg Leu Arg Asp Asp Ala Ala Asn Leu Lys Ser Lys Gly Ile Thr25 30 35 40gct gtt tgg att cct cct gca tgg aag ggg act tcg caa aat gat gtt 415Ala Val Trp Ile Pro Pro Ala Trp Lys Gly Thr Ser Gln Asn Asp Val45 50 55ggg tat ggt gcc tat gat ttg tac gat ctt ggt gag ttt aac caa aag 463Gly Tyr Gly Ala Tyr Asp Leu Tyr Asp Leu Gly Glu Phe Asn Gln Lys60 65 70gga acc gtc cgt aca aaa tat ggc aca agg agt cag ttg caa ggt gcc 511Gly Thr Val Arg Thr Lys Tyr Gly Thr Arg Ser Gln Leu Gln Gly Ala75 80 85gtg aca tct ttg aaa aat aac ggg att caa gtt tat ggg gat gtc gtg 559Val Thr Ser Leu Lys Asn Asn Gly Ile Gln Val Tyr Gly Asp Val Val90 95 100atg aat cat aaa ggt gga gca gac ggg aca gag atg gta aat gcg gtg 607Met Asn His Lys Gly Gly Ala Asp Gly Thr Glu Met Val Asn Ala Val105 110 115 120gaa gtg aac cga agc aac cga aac caa gaa ata tca ggt gaa tac acc 655Glu Val Asn Arg Ser Asn Arg Asn Gln Glu Ile Ser Gly Glu Tyr Thr125 130 135att gaa gca tgg acg aaa ttt gat ttc cct gga aga gga aat acc cat 703Ile Glu Ala Trp Thr Lys Phe Asp Phe Pro Gly Arg Gly Asn Thr His140 145 150tcc aac ttt aaa 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1.突變的α-澱粉酶，其從具有SEQ ID No.1所代表的胺基酸序列或顯示與該序列有至少60％同源性的α-澱粉酶衍生而來，衍生方式是替代或缺失相應於該胺基酸序列的Pro18、Gln86、Glu130、Asn154、Arg171、Ala186、Glu212、Val222、Tyr243、Pro260、Lys269、Glu276、Asn277、Arg310、Glu360、Gln391、Trp439、Lys444、Asn471和Gly476中任何一個的至少一個胺基酸殘基。
2.突變的α-澱粉酶，其從具有SEQ ID No.2所代表的胺基酸序列或顯示與該序列有至少60％同源性的α-澱粉酶衍生而來，衍生方式是替代或缺失相應於該胺基酸序列的Asp128、Gly140、Ser144、Arg168、Asn181、Glu207、Phe272、Ser375、Trp434和Glu466中任何一個的至少一個胺基酸殘基。
3.根據權利要求1的突變α-澱粉酶，其中替代或缺失至少一個胺基酸殘基是用Ser或Thr替代相應於Pro18的胺基酸殘基，用Glu替代相應於Gln86的胺基酸殘基，用Val或Gln替代相應於Glu130的胺基酸殘基，用Asp替代相應於Asn154的胺基酸殘基，用Cys或Gln替代相應於Arg171的胺基酸殘基，用Val或Asn替代相應於Ala186的胺基酸殘基，用Asp替代相應於Glu212的胺基酸殘基，用Glu替代相應於Val222的胺基酸殘基，用Cys或Ser替代相應於Tyr243的胺基酸殘基，用Glu替代相應於Pro260的胺基酸殘基，用Gln替代相應於Lys269的胺基酸殘基，用His替代相應於Glu276的胺基酸殘基，用Ser或Phe替代相應於Asn277的胺基酸殘基，用Ala替代相應於Arg310的胺基酸殘基，用Gln替代相應於Glu360的胺基酸殘基，用Glu替代相應於Gln391的胺基酸殘基，用Arg替代相應於Trp439的胺基酸殘基，用Arg替代相應於Lys444的胺基酸殘基，用Asp或Glu替代相應於Asn471的胺基酸殘基，或用Asp替代相應於Gly476的胺基酸殘基。
4.根據權利要求2的突變α-澱粉酶，其中替代或缺失至少一個胺基酸殘基是用Val或Gln替代相應於Asp128的胺基酸殘基，用Ser替代相應於Gly140的胺基酸殘基，用Pro替代相應於Ser144的胺基酸殘基，用Gln替代相應於Arg168的胺基酸殘基，用Val替代相應於Gln181的胺基酸殘基，用Asp替代相應於Glu270的胺基酸殘基，用Ser替代相應於Phe272的胺基酸殘基，用Pro替代相應於Ser375的胺基酸殘基，用Arg替代相應於Trp434的胺基酸殘基，或用Asp替代相應於Glu466的胺基酸殘基。
5.編碼權利要求1-4之任意一項的突變α-澱粉酶的基因，或含有所述基因的載體。
6.用根據權利要求5的載體轉化的細胞。
7.用於生產突變α-澱粉酶的方法，包括培養權利要求6的轉化細胞。
8.洗滌劑組合物，其含有權利要求1-4之任意一項的突變α-澱粉酶。
全文摘要
本發明提供高生產能力的突變α－澱粉酶,其來自具有SEQ ID No.1或2代表的胺基酸序列或顯示與該序列有60%同源性的α－澱粉酶,並被構建成用另外的胺基酸殘基替代或缺失了參與生產能力的特定胺基酸殘基。本發明還提供編碼此突變α－澱粉酶的基因、載體、轉化細胞和生產突變α－澱粉酶的方法,該方法包括培養該轉化細胞。本發明還提供含有突變α－澱粉酶的洗滌劑組合物。根據本發明,能夠從重組微生物中生產高產量的α－澱粉酶,使得它們的工業生產成本能夠大大降低。這導致了具有耐熱性、螯合劑抗性和氧化劑抗性並可作為洗滌劑用酶使用的液化鹼性α－澱粉酶的產量增加。
文檔編號C12N9/28GK1348000SQ0114125
公開日2002年5月8日 申請日期2001年10月11日 優先權日2000年10月11日
發明者荒木裕行, 遠藤圭二, 萩原浩, 五十嵐一曉, 林康弘, 尾崎克也 申請人:花王株式會社