水稻miR390在增加植物鎘脅迫敏感性中的應用的製作方法

2023-05-23 21:03:06 2

專利名稱：水稻miR390在增加植物鎘脅迫敏感性中的應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及功能基因組學領域，尤其涉及一種水稻miR390在增加植物鎘脅迫敏感性中的應用。
背景技術：
近年來，隨著我國工業化和城市化進程的不斷發展，重金屬汙染事件亦呈現出愈演愈烈的趨勢。因重金屬造成的水源和土壤汙染已對中國的生態環境、食品安全、百姓身體健康和農業可持續發展構成嚴重威脅。據估算，目前全國耕種土地面積的10%以上已受重金屬汙染，全國每年因重金屬汙染的糧食高達1200萬噸，造成的直接經濟損失超過200億元。由於重金屬在土壤中的存留時間短則數十年(如鎘)，長則數萬年(如鉛)，要徹底解決現有問題並非易事。水稻是世界上最重要的農作物，全球一半以上的人口以稻米為主食， 我國是世界上第一種稻大國，目前我國稻米中重金屬超標，如各地出現的鎘米、汞米等事件已引起了國家各部委的高度重視。因此，如何在輕度重金屬汙染的土壤中進行農作物的安全生產，如何利用植物進行大規模汙染土壤的修復，這對保障農產品安全、生態安全和人們的健康，促進農業生產的可持續發展意義重大。植物在長期的進化過程中產生了對重金屬的多種抗性以及對重金屬的超積累。近年來科學家對重金屬脅迫的抗性機理從生理生化與分子水平上開展了大量的研究工作，一些與植物重金屬耐性相關的基因也得到了鑑定與功能的描述，如植物螯合肽和金屬硫蛋白在植物對重金屬的解毒作用中發揮了重要功能。近年來發現植物參與環境脅迫響應還有另一類重要的功能基因即調節基因，它們通過調控其下遊許多逆境誘導基因的表達而間接影響代謝與生理過程，但有關這一類與重金屬耐性相關的調節基因研究報導甚少。對此問題的探索將有利於加深人們對基因調控和重金屬脅迫耐受性以及重金屬超積累的理解與生理分子機理的闡明。隨著生長和環境條件的變化，正確調節基因表達是植物正常生長和適應各種脅迫的基礎，過去基因表達的研究主要集中在轉錄水平，隨著眾多內源小RNA不斷發現及其功能研究，人們開始認識到基因轉錄後水平的調節在植物逆境反應中也起著非常重要的作用，尤其是內源小RNA對基因轉錄後水平的調節。MicroRNA(miRNA)就是一種新型調控基因表達的小分子RNA。miRNA自從發現以來就成為生命科學領域的研究熱點。目前已知的植物 miRNA的功能主要表現在調控植物發育的各個方面，其中靶基因多數是植物發育模式的細胞分化中相關轉錄因子。而這些靶基因調控的植物生長發育過程主要包括激素信號傳導、 細胞代謝、器官分化、育性轉換、花器官的形成與生殖。這顯示出在生物體內miRNA組成了一個巨大的分子調控網絡，它處於基因表達調控的中心位置，是基因進行精細調控必不可少的重要手段，在不同層次上(轉錄、轉錄後、翻譯等)對靶基因進行調控，並與蛋白-蛋白相互作用網絡相對應，調節細胞的生命活動。研究發現miRNA在乾旱、冷害、重金屬等環境脅迫的響應過程中發揮重要作用。並且，隨著內源小RNA的發現及其功能研究，利用小RNA 技術改良植物對生物與非生物脅迫的耐性成為了一個重要的技術手段。miRNA對重金屬脅迫應答調控機制的研究，可從基因表達調控網絡方面進一步探明植物重金屬脅迫應答的分子機制；同時也可通過轉基因技術改良作物，增強作物對重金屬的耐性與環境適應，培育可食部分重金屬低積累的品種，及優良重金屬超積累型植物，為土壤重金屬汙染的植物修復技術提供材料。近年來的研究表明，miRNA在植物重金屬脅迫響應過程中扮演著重要角色。楊志敏等發現在甘藍型油菜和蒺藜苜蓿中，部分miRNA的表達可受重金屬鎘的誘導與調節(Xie， F. L. , Huang, S. Q. , Guo, K. , Xiang, A. L. , Zhu, Y. Y. , Nie, L. , Yang, Ζ. Μ. Computational identification of novel microRNAs and targets in Brassica napus. FEBS Lett,2007, 581 :1464-1474.)。他們還構建鎘脅迫下水稻幼苗的small RNA文庫，克隆了 19個新的 miRNA,並發現其中多數miRNA在鎘脅迫下表達發生變化，如miR604在鎘處理下表達下調， 其靶基因脂轉移蛋白表達上升。而且脂轉移蛋白參與植物多種抗逆性反應並介導植物激素信號轉導等過禾呈(Huang, S. Q. , Peng, J. , Qiu, C. Χ. , Yang, Ζ. Μ. Heavy metal-regulated new microRNAs from rice. J. Inorg. Biochem，2009，103 :282e287.)。朱健康等在 2006 年研究發現miR398在擬南芥抵抗強光、重金屬Ciui^e等氧化脅迫中發揮作用在氧化脅迫條件下，miR398的表達量被誘導降低，miR398調控的Cu/Si超氧化物歧化酶(CSDs)mRNA的表達量升高，Cu/Zn超氧化物歧化酶可快速地將超氧化物轉變成過氧化物和分子氧，組成了抵抗高毒性超氧化物的第一道防線，導致擬南芥對重金屬脅迫的耐受性也大大增加(Simkar， R. , Kapoor, A. , Zhu, J. K. Posttranscriptional induction of two Cu/Zn superoxide dismutase genes in Arabidopsis is mediated by downregulation of miR398 and important for oxidative stress tolerance. Plant Cell, 2006,18 :2051-2065)。miR390在擬南芥、玉米、水稻等植物中保守。擬南芥中miR390的靶基因為TAS3， TAS3可在miR390的介導下產生系列ta_siRNA，其作用於生長素響應因子(ARF3和ARF4) 的mRNA。即miR390通過介導miR390-TAS3_ARF2/ARF3/ARF4途徑，從而參與生長素信號轉導。水稻中miR390的靶基因為富含亮氨酸的類受體蛋白激酶(rec印tor-like protein kinase, RLK)。由於miRNA及其靶基因的共同保守性，可推測水稻中miR390及靶基因可能與生長素應答途徑相關。另外文獻報導，miR390的靶蛋白RLK是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，它參與植物抗逆性反應、調節植物發育和介導植物激素信號轉導等過程。如水稻的 LRR型類受體蛋白激酶OsRLKl基因受低溫和鹽脅迫誘導表達，但有關RLK蛋白激酶在重金屬脅迫中的作用尚未見報導。

發明內容
本發明提供了一種水稻miR390在增加植物鎘脅迫敏感性中的應用。一種水稻miR390在增加植物鎘脅迫敏感性中的應用，所述水稻miR390的鹼基序列如SEQ ID NO. 1所示。優選的，所述植物為水稻。具體方法為將包含所述水稻miR390的前體基因連接到載體上，通過農桿菌介導轉化到水稻愈傷組織，篩選，培養，獲得轉基因株系。由於miRNA本身序列很短，只有20幾個bp，而前體序列相對較長，連接到載體上， 有利於轉化實現，優選的，所述前體基因的鹼基序列如SEQ ID N0. 2所示。
本發明通過將水稻miR390轉化到水稻愈傷組織，將獲得的T2代種子播種在含鎘培養液中，發現過表達miR390的水稻植株對鎘敏感。


圖1為7天齡水稻幼苗60uM Cd脅迫Mi根的miRNA晶片圖譜，(Cy3對照；Cy5處理樣品)；圖2為7天齡水稻幼苗60uM Cd處理3，6，12，24h後，miR390及其靶基因RLK的表達分析；圖3為miR390過表達載體構建的過程凝膠圖譜。a. miR390前體PCR擴增凝膠圖譜；b. pMD19-T-miR390質粒酶切鑑定圖；c. pl301-miR390重組質粒菌液PCR擴增凝膠圖譜。圖4為生長五周的miR390過表達水稻經200uM Cd處理30d的表型(WT對照；35S MIR390轉基因水稻)。
具體實施例方式實施例1基因的獲得以野生型水稻(中花11)七天苗齡幼苗為材料，取60uM CdCl2處理Mi和對照組 (未處理)的根0. lg，用液氮研磨並加入Iml TrizoKInvitrogen生產)繼續研磨至勻漿， 轉入1.5ml離心管中，12000 Xg離心lOmin，收集上清至新離心管中。室溫放置5min，加入 0. 2ml氯仿用力震蕩15s，使溶液充分混勻。室溫放置5min，12000Xg離心15min，收集上清。加兩倍上清體積的異丙醇，_20°C過夜沉澱。12000 Xg離心lOmin，去上清，加ImL預冷的75%乙醇(DEPC-H2O配製)洗沉澱。12000 Xg離心lOmin，倒盡液體，室溫乾燥5min，沉澱重溶於50 μ L DEPC (焦碳酸二乙酯)水。取2 μ g Total RNA進行電泳檢測，並稀釋樣品測 OD 260/280, OD 260/230 及濃度。利用 2-5 μ g 總 RNA 樣品，通過 YM-100 (Millipore)微離心過濾柱得到片段小於300nt的小RNA。Poly(A)聚合酶在分離到的小RNA 3'端加上 poly(A)尾巴，再將一個寡聚核苷酸標記與這個poly(A)尾巴連接，(ligation)用於後續的螢光標記。用兩個不同的標記物Cy3和Cy5來標記處理組和對照組的兩個RNA樣品。利用 Versionll. OmicroRNA 數據 庫，(http://microrna.sanger.ac.uk/ sequences/)製作μ Paraf Ιο 微流體晶片探針。雜交反應通過利用μ Paraf Ιο 微流體晶片，檢測在60uM CdClJA迫下水稻根中miRNA的表達差異，如圖1所示，結果發現miR390在 Cd處理他後表達量比對照(未處理)下降2倍以上。根據Sanger microRNA資料庫(miRBase)和TIGR資料庫，發現水稻miR390位於 3號染色體，來源於基因間區域。成熟序列如SEQ ID NO. 1所示，前體序列如SEQ ID N0. 2 所示。根據miRU靶基因預測軟體發現，miR390的靶基因是富含亮氨酸的類受體蛋白激酶(receptor-like protein kinase, RLK)。根據 NCBI 和 TIGR 資料庫查詢，RLK 基因號為 0s02gl0100，基因序列長度為6694bp，CSD為4242bp，基因編碼產物大小1413個胺基酸。以野生型水稻(中花11)七天苗齡幼苗為材料，用60uM CdCl2處理0，3，6，12， Mh，用Trizol法分別提取RNA，並用DNase I消化以去除DNA汙染。採用I^rimeScriptTMRT reagent kit (ΤεΛε Γει， Japgrn) ☆ cDNA。以 i亥 cDNA 力牛莫fe，MM SYBR Premix Ex TaqTM(Takara, Japan), ^t LightCycler480 (Roche, Shanghai, China) — 擴增miR390和RLK基因，PCR反應條件為95°C lmin，變性95°C 10s，退火58°C 15s，延伸 72°C 15s，45個循環。PCR引物如下:miR390-F, 5 』 -TTCTTCCCCTATCATCACC-3 ’miR390-R，5，-CCTCAAAACATCTCTCCC T-3'RLK-F，5 』 -CCTTCGCAAACTTCTCCG-3 』RLK-R,5，-ACTGCCTCCTTCTCAACA-3，如圖2所示，實時定量PCR實驗結果驗證了 miR390對RLK的負調控。實施例2基因克隆與轉化以野生型水稻中花11七天苗齡幼苗DNA為模板，利用PCR方法擴增到miR390前體基因的序列。具體操作如下首先，提取野生型水稻中花11七天齡幼苗DNA。取約0.2g水稻葉片用液氮研磨成粉末，轉移粉末到加有500 μ 1提取液(IOOmM Tris-HCl,pH 8. 0 ；20mM EDTA ； 500mMNaCl)的離心管中，輕輕混勻。向管中加入ΙΟΟμΙ 10% SDS溶液，混勻，65°C保溫20min。然後加氯仿/異戊醇/乙醇QO 1 4)混合液600 μ 1，室溫靜止lOmin。4°C， 12000rpm離心lOmin，轉移上清至另一離心管中。加入Iml預冷的無水乙醇充分混勻，_20°C 沉澱DNA20min。4°C，12000rpm離心lOmin，棄上清，加70%乙醇500 μ 1進行洗滌。4°C， 12000rpm離心lOmin，棄上清。輕微離心，用移液器將殘留液體吸乾。吹乾DNA沉澱後，溶於 100 μ 1 含 RNase 酶(10 μ g/ml) TE 中，37°C水浴 30min，-20°C保存。根據已知的 miR390 前體序列(http://www. mirbase. org/cgi-bin/get_seq. pi),在 database 中查閱其所在基因組位點的兩端的序列，分別在前體髮夾結構兩端約20bp處設計引物，所設引物如下miR390-F, 5 』 -CGGGGTACCGGAGAGATGTTTTGAGGAAGG-3 ’miR390-R,5' -AACTGCAGCAGATTTAATTGGTCGTGTGG-3『
接著以DNA為摸板，利用所設引物擴增miR390前體基因。PCR反應體系為 20μ 1，依次加入 DNA 模板 1 μ 1U0XPCR buffer 2 μ 1、IOmMdNTPs 2μ1、10μΜ 正向引物(miR390-F) 0. 5 μ 1、10 μ M 反向引物(miR390_R) 0. 5 μ 1、TaKaRa Taq (5U/ μ 1)聚合酶
0.2μ 1，最後加ddH20補至20μ 1。PCR反應條件預變性94°C 5min，變性94°C 30s，退火 58°C 30s，延伸72°C 30s，30個循環，最後延伸72°C 10min，4°C保存。PCR產物凝膠圖譜如圖 3. a所不。擴增後將miR390前體基因DNA產物，利用天根生化科技(北京)有限公司生產的瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收，操作如下將DNA條帶從瓊脂糖凝膠中切下放入1. 5ml的 Eppendorf管中，稱取重量。加入6倍體積溶膠液PN，50°C水浴放置30min。將溶膠液加入吸附柱CA2中，室溫放置2min，12000rpm離心60s，倒掉收集管中的廢液。加入600 μ 1漂洗液PW，12000rpm離心30_60s，倒掉收集管中的廢液。12000rpm離心2min，室溫放置數分鐘徹底晾乾。將吸附柱CA2放到一個乾淨離心管中，加入40 μ 1洗脫緩衝液EB，12000rpm離心2min收集DNA溶液。將回收的miR390前體基因DNA與pMD19-T載體(TakaRa)進行連接反應，連接體系 10 μ 1，分別加入 0. 5 μ 1 PMD19-T 載體、4. 5μ 1 純化的 miR390 前體的 DNA、5y 1 Solution
1。16°C下連接Mi後將連接產物轉化到大腸桿菌DH5a感受態細胞中。通過Amp篩選，挑
6取陽性克隆，經PCR反應驗證及測序鑑定正確後，選取正確的菌液提取質粒pMD19-miR390。 利用天根公司生產的普通質粒小提試劑盒提取質粒操作如下取3ml菌液加入離心管中，12000rpm離心lmin，儘量吸出上清液。向留有菌體沉澱的離心管中加入250 μ 1的溶液Pl (含RNaseA)，徹底懸浮細菌沉澱。加入250 μ 1溶液 Ρ2，溫和的上下翻轉6-8次使菌體充分裂解。加入350 μ 1溶液Ρ3，立即溫和的上下翻轉6_8 次，充分混勻，12000rpm離心lOmin。收集上清液，轉移到吸附柱CP3中，12000rpm離心60s， 倒掉廢液。加入600 μ 1已加入無水乙醇的漂洗液PW，12000rpm離心60s，倒掉廢液並漂洗兩次。將吸附柱CP3放入收集管，12000rpm離心aiiin，置於室溫徹底晾乾。加入55μ1洗脫緩衝液ΕΒ，室溫放置2min，12000rpm離心lmin，將質粒溶液收集到離心管中。將提取的質粒pMD19-miR390和DNA雙元質粒載體pCAMBIA1301同時都用iTakafci 公司生產的KpnI和I3StI進行雙酶切。酶切體系50μ 1，包括5μ 1 IOXM buffer, 30 μ 1 pMD19-miR390 質粒(或 pCAMBIA1301 質粒)、1μ 1 KpnIU μ 1 PstI 禾口 13μ1 ddH20，37°C 水浴過夜。pMD19-miR390質粒酶切結果如圖3. b所示。將DNA雙元質粒載體pCAMBIA1301 和克隆質粒pMD19-miR390酶切後，割膠回收DNA片段。接著用T4連接酶連接，連接體系 10口1,包括1「1 pCAMBIA1301 載體、7· 5μ 1 miR390DNA、1 μ 1 10 X Τ4 連接酶 buffer 和 0.5μ1 Τ4連接酶，16°C連接過夜。然後將連接產物轉化到大腸桿菌DH5 α感受態細胞中， 進行菌液PCR，並提取質粒進行酶切鑑定，結果如圖3. c和圖3. d所示。將正確的植物表達載體pl301-miR390導入農桿菌感受態細胞EHA105，操作如下取200 μ 1農桿菌感受態細胞，加入1 μ gpl301-miR390質粒，混勻，冰浴5min，液氮中速凍5min，37°C水浴5min，然後加入Iml YM培養基恢復培養4h。IOOOOg離心30s，棄上清，吸200 μ 1菌液塗布於含有 50mg/L卡那黴素和40 μ g/1利福平的YM平板，培養，約4 後長出農桿菌單菌落。搖菌，提取農桿菌質粒DNA重新轉入大腸桿菌DH5 α中，再提取質粒進行酶切鑑定。經鑑定正確的陽性質粒pl301_miR390，通過農桿菌介導法轉化到水稻愈傷。操作如下首先活化農桿菌，在含50mg/L卡那黴素和40mg/L利福平的YM培養基上劃線，28°C暗培養。收集農桿菌菌體，將其懸浮於含有200 μ M己醯丁香酮(As)的AAM液體懸浮培養基中。調整菌體濃度至0D600為0. 8 1. 0，倒入含繼代培養1周的水稻愈傷組織的無菌三角瓶，侵染lOmin，並不時晃動。然後將愈傷組織置於無菌的濾紙上浙幹30min後，置於鋪有一層無菌濾紙的固體共培養培養基上，25°C暗培養3天。將共培養後的愈傷組織用無菌水清洗5-6次，再用含500mg/L頭孢拉定的無菌水清洗1 2遍，置於無菌濾紙上浙幹1小時。將晾乾的愈傷轉入含500mg/L頭孢拉定和50mg/L潮黴素的選擇培養基上進行第一輪選擇J8°C，暗培養14天。然後將長有抗性愈傷的初始愈傷轉到新的含500mg/L頭孢拉定和50mg/L潮黴素的培養基上進行第二輪選擇J8°C，光照培養，直到顆粒性的抗性愈傷組織長出。選擇生長旺盛的抗性愈傷組織轉移到含有潮黴素的分化培養基上，於25°C，12h光照/1 黑暗條件下培養。待再生小苗長成約Icm高時，將其移到生根培養基上壯苗，25°C， 12h光照/1 黑暗條件下培養。最後將轉基因苗挑出，加入適量蒸餾水煉苗3天至一周左右，洗去瓊脂，培養箱水培1周，移栽到溫室的土缽中生長。挑選生長正常的植株，進行潮黴素PCR篩選和⑶S染色，獲得陽性TO代植株，共14個株系。收穫Tl代種子繁種並鑑定至 T2代，獲得純合的轉基因株系。實施例3 miRNA鎘敏感性功能鑑定
取T2代轉基因株系種子和中花11野生型的種子，稀HNO3破休眠處理16h。倒去稀HNO3,10% NaClO(有效氯約1 1. 2% )消毒20min後用蒸餾水衝洗。將種子浸泡在水中，37°C暗處催芽約兩天，再在鋪有溼潤濾紙的培養皿中培養一天至露白。挑選生長一致的露白的轉基因株系和野生型的種子播於網格上，放入盛有水稻營養液(按國際水稻所標準營養液配方進行配製)的桶中，置於水稻培養箱中(白天/黑夜^TC/22°C，i;3h/llh; Rh 80%)培養，營養液每5天換一次。將轉基因株系和野生型水稻在正常的營養液中培養五周後，挑選生長一致的水稻植株用200uMCdCl2處理，觀察轉基因株系與野生型大苗在鎘脅迫下的表型。如圖4所示，結果發現在200uM CdCl2處理40d後，miR390過表達的轉基因幼苗相比野生型幼苗，生物量下降，苗枯黃萎蔫更為嚴重，說明miR390超量表達株系增加了對鎘的敏感性。
權利要求
1.水稻miR390在增加植物鎘脅迫敏感性中的應用，所述水稻miR390的鹼基序列如SEQ ID NO. 1 所示。
2.根據權利要求1所述的應用，其特徵在於，所述植物為水稻。
3.根據權利要求2所述的應用，其特徵在於，包括將包含所述水稻miR390的前體基因連接到載體上，通過農桿菌介導轉化到水稻愈傷組織，篩選，培養，獲得轉基因株系。
4.根據權利要求3所述的應用，其特徵在於，所述前體基因的鹼基序列如SEQID NO. 2 所示。
全文摘要
本發明公開了一種水稻miR390在增加植物鎘脅迫敏感性中的應用，所述水稻miR390的鹼基序列如SEQ ID NO.1所示。本發明通過將水稻miR390轉化到水稻愈傷組織，將獲得的T2代種子播種在含鎘培養液中，發現過表達miR390的水稻植株對鎘敏感。
文檔編號A01H5/00GK102250902SQ20111019394
公開日2011年11月23日 申請日期2011年7月12日 優先權日2011年7月12日
發明者丁豔菲, 劉海麗, 朱誠, 江瓊, 潘家榮, 王飛娟 申請人:中國計量學院