細胞凍存液及細胞凍存方法與流程
2023-05-23 13:28:06 3
本發明屬於細胞凍存領域，尤其涉及細胞凍存液及細胞凍存方法。
背景技術：
脂肪幹細胞即脂肪來源間充質幹細胞(adipose-derivedstemcells，adscs)，是近年來從脂肪組織中分離得到的一種尚不成熟的具有自我複製能力的多潛能細胞。在一定條件下，它可以分化成多種功能細胞，具有再生各種組織器官的潛在功能。
脂肪幹細胞在無菌條件下從人體自身組織中取出，經分離、純化後在模擬的體內生理條件下，通過核心的優化技術將其在體外進行培養，使未完全分化的細胞不斷地分化生長,大量增殖，並使細胞保持良好的生長狀態，以及旺盛的增殖活力，然後注射回自身，從而提高人體整個器官功能，改善機能老化狀態，滿足各種治療需要。因此，脂肪幹細胞目前已廣泛地應用於衰老醫學和再生組織工程。
但是，脂肪幹細胞分離培養的周期比較長，多次傳代後容易分化或失去多向分化的潛能。而科研研究以及臨床應用中對脂肪幹細胞的需求非常強烈，需要隨時提供大批量的脂肪幹細胞，因此，有必要將生產好的脂肪幹細胞進行冷凍保存，待到有使用需求時再復甦使用。然而，目前常見的脂肪幹細胞凍存液往往含有動物血清和dmso。動物血清容易給細胞引入外源性病毒，給脂肪幹細胞的臨床應用帶來潛在風險。dmso對脂肪幹細胞具有毒性，容易對細胞造成損傷。而且傳統的細胞凍存過程需要程序降溫，操作繁瑣。
因此，尋找一種無毒、凍存效果好的細胞凍存液和操作簡單的凍存方法是本領域技術人員亟待解決的技術問題。
技術實現要素：
有鑑於此，本發明提供了細胞凍存液及細胞凍存方法能有效解決現有技術的凍存液凍存效果差和現有凍存方法操作繁瑣的技術缺陷。
本發明提供了一種細胞凍存液，包括基礎培養基、血小板裂解物、bfgf和l-穀氨醯胺。
作為優選，所述血小板裂解物在所述細胞凍存液的體積百分比為5％。
作為優選，所述bfgf在所述細胞凍存液的濃度為50ng/ml。
作為優選，所述l-穀氨醯胺在所述細胞凍存液的濃度為4mmol/l。
其中，所述細胞凍存液包括基礎培養基、血小板裂解物、bfgf和l-穀氨醯胺；所述血小板裂解物在所述細胞凍存液的體積百分比為5％；所述bfgf在所述細胞凍存液的濃度為50ng/ml；所述l-穀氨醯胺在所述細胞凍存液的濃度為4mmol/l。
作為優選，所述細胞凍存液還包括羥乙基澱粉、海藻糖、羧甲基纖維素鈉和甘油中的至少一種。
作為優選，所述羥乙基澱粉在所述細胞凍存液體積百分比為0％～5％；所述海藻糖在所述細胞凍存液體積百分比為0％～5％；所述羧甲基纖維素鈉在所述細胞凍存液體積百分比為0％～0.1％；所述甘油在所述細胞凍存液體積百分比為0％～20％。
次優選的，所述細胞凍存液所述細胞凍存液包括基礎培養基、血小板裂解物、bfgf、l-穀氨醯胺、羥乙基澱粉、海藻糖、羧甲基纖維素鈉和甘油；所述血小板裂解物在所述細胞凍存液的體積百分比為5％；所述bfgf在所述細胞凍存液的濃度為50ng/ml；所述l-穀氨醯胺在所述細胞凍存液的濃度為4mmol/l；所述羥乙基澱粉在所述細胞凍存液體積百分比為1％～5％，所述海藻糖在所述細胞凍存液體積百分比為1％～5％，所述羧甲基纖維素鈉在所述細胞凍存液體積百分比為0.05％～0.1％，所述甘油在所述細胞凍存液體積百分比為5％～20％。
更為優選，所述細胞凍存液所述細胞凍存液包括基礎培養基、血小板裂解物、bfgf、l-穀氨醯胺、羥乙基澱粉、海藻糖、羧甲基纖維素鈉和甘油；所述血小板裂解物在所述細胞凍存液的體積百分比為5％；所述bfgf在所述細胞凍存液的濃度為50ng/ml；所述l-穀氨醯胺在所述細胞凍存液的濃度為4mmol/l；所述羥乙基澱粉在所述細胞凍存液體積百分比為5％，所述海藻糖在所述細胞凍存液體積百分比為5％，所述羧甲基纖維素鈉在所述細胞凍存液體積百分比為0.1％，所述甘油在所述細胞凍存液體積百分比為20％。
作為優選，所述基礎培養基為dmem/f12。
本發明還公開了一種細胞凍存方法，包括：
1)配置細胞凍存液；
2)將幹細胞與步驟1)的凍存液按照5×106個/ml～1×107個/ml的密度混合，得到混合物；
3)將步驟2)的混合物直接置於-80℃凍存8-24h後轉存於液氮保存；
或，將步驟2)的混合物置於4℃凍存40min，然後放入-20℃凍存2h，再放入-80℃凍存3h，最後轉入液氮中保存。
其中，所述步驟1)的細胞凍存液為上述製備得到的細胞凍存液。
本發明所公開的細胞凍存液和細胞凍存方法在凍存脂肪幹細胞中的應用。
其中，所述血小板裂解物可以降低溶液中電解質的濃度，減少陽離子進入細胞的數量；所述羥乙基澱粉和所述海藻糖優先與溶液中的水分子相結合，降低溶液中自由水的含量，使冰點降低，減少冰晶的形成；同時，由於其分子量大，使溶液中電解質濃度降低，從而減輕溶質損傷；所述甘油，能在細胞冷凍懸液完全凝固之前，滲透到細胞內，使細胞內外產生一定的摩爾濃度，降低細胞內外未結冰溶液中電解質的濃度，從而保護細胞免受高濃度電解質的損傷；所述羧甲基纖維素鈉，能分散和乳化細胞懸液，減小細胞在凍存中聚集成團。
本發明的目的針對現有凍存液往往含有動物血清和dmso，其中，動物血清容易給細胞引入外源性病毒，給脂肪幹細胞的臨床應用帶來潛在風險；dmso對脂肪幹細胞具有毒性，容易對細胞造成損傷；此外，傳統的細胞凍存方法過程需要程序降溫，操作繁瑣中。本發明提供的細胞凍存液，包括：基礎培養基、血小板裂解物、bfgf、l-穀氨醯胺、羥乙基澱粉、海藻糖、羧甲基纖維素鈉和甘油，該細胞凍存液不含動物血清和不含dmso，消除動物血清可能引入外源性病毒的可能性和消除dmso對脂肪幹細胞的不良影響；本發明公開的細胞凍存液與細胞混合後能採用-80℃凍存後轉存液氮，無需複雜的程序性降溫，操作簡單。採用本發明公開的細胞凍存液和凍存法凍存脂肪幹細胞一年後，細胞存活率能達到93％，且不影響脂肪幹細胞分化能力。
附圖說明
為了更清楚地說明本發明實施例或現有技術中的技術方案，下面將對實施例或現有技術描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹。
圖1是採用實施例3凍存復甦的p6代細胞的成脂分化圖。
具體實施方式
本發明提供了細胞凍存液及其細胞凍存方法，用於解決現有技術的凍存液凍存效果差和現有凍存方法操作繁瑣的技術缺陷。
下面將對本發明實施例中的技術方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發明一部分實施例，而不是全部的實施例。基於本發明中的實施例，本領域普通技術人員在沒有做出創造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬於本發明保護的範圍。
其中，以下實施例所用的試劑均為市售。
實施例1
以dmem/f12為基礎溶液，加入血小板裂解物、bfgf、l-穀氨醯胺、羥乙基澱粉、海藻糖、羧甲基纖維素鈉、甘油、dmso和fbs，使血小板裂解物、bfgf、l-穀氨醯胺、羥乙基澱粉、海藻糖、羧甲基纖維素鈉、甘油、dmso和fbs在細胞凍存液的終濃度/體積百分比分別對應為5％(v/v)、50ng/ml、4mmol/l、0％～5％(v/v)、0％～5％(v/v)、0％～0.1％(v/v)、0％～20％(v/v)、5％(v/v)和10％(v/v)。其中，在細胞凍存液添加的具體體積百分比/濃度如表1所示。
表1試驗組1～11與對比例1～2的細胞凍存液的配方
實施例2
脂肪幹細胞凍存、復甦，步驟如下：
細胞凍存：取培養至p6代的脂肪幹細胞，消化、離心收集後，用實施例1配置的試驗組1～11和對比例1～2的凍存液分別重懸細胞，脂肪幹細胞在凍存液中的密度為1×107個/ml。
凍存方法一：先將細胞在4℃凍存40min，然後放入-20℃凍存2h，再放入-80℃凍存3h。最後轉入液氮中保存。分別凍存1周、1個月、6個月和1年。
凍存方法二：直接將細胞放入-80℃凍存12小時後轉存於液氮中保存。分別凍存1周、1個月、6個月和1年。
復甦：從液氮罐中取出凍存管，快速置於38℃水浴鍋中，輕輕震蕩凍存管，直至細胞懸液完全融化。
實施例3
將實施例2採用兩種方法凍存的脂肪幹細胞進行復甦後檢測細胞存活率，步驟如下：
活率檢測：細胞復甦後，用dmem/f12培養基稀釋，於1200rpm/min，離心3min，棄上清後，用dmem/f12培養基重懸細胞，計算脂肪幹細胞進行復甦後的細胞存活率，結果見表2和表3。
其中，凍存方法一為先將復甦的細胞在4℃凍存40min，然後放入-20℃凍存2h，再放入-80℃凍存3h。最後轉入液氮中保存。分別凍存1周、1個月、6個月和1年；凍存方法二為直接將細胞放入-80℃凍存12小時後轉存於液氮中保存。分別凍存1周、1個月、6個月和1年。
表2凍存方法一凍存的細胞復甦後細胞存活率統計表
表3凍存方法二凍存的細胞復甦後細胞存活率統計表
如表2和表3所示，採用本發明提供的凍存液，程序性降溫(凍存方法一)，試驗組1～11之間凍存的細胞在液氮中保存一年後，細胞存活率均大於94％，而對比例1～2凍存一年後細胞存活只達到90％，直接將細胞放入-80℃凍存12h後轉存於液氮中保存(凍存方法二)中試驗組1～7凍存一年後細胞存活率均大於93％，試驗組8～11凍存一年後細胞存活率均有所下降，這是因為試驗組8～11凍存液缺少羥乙基澱粉，海藻糖、羧甲基纖維素鈉或甘油中的某一成分，實驗說明這些成分對於採用凍存方法二時起到重要的保護作用，復甦後存活率才大大提高；而比較例1～2為直接將細胞放入-80℃凍存12h後轉存於液氮中保存時，復甦後大部分死亡，凍存一年後細胞存活率只有6％。
實施例4
成脂誘導分化能力檢測，步驟如下：
採用adipogenesisdifferentiationkit(gibco)試劑盒對所獲取的脂肪幹細胞進行成脂誘導分化實驗。
取採用試驗組3的凍存液放入-80℃凍存12h後轉存於液氮中保存的p6脂肪幹細胞，以2×104個/孔接種於12孔板，37℃，5％co2培養箱中培養。24h後細胞融合度達到約80％時，將所有脂肪幹細胞平均分成兩半，一半的脂肪幹細胞將細胞培養液更換成誘導培養基繼續培養，標記為試驗組，每3天換新鮮誘導液；另一半的脂肪幹細胞將細胞培養液更換普通培養基，標記為對照組，每3天更換新鮮普通培養基，持續培養14-21天。誘導14-21天後，油紅0染色鑑定，將試驗組和對照組造染色前與染色後進行分化能力檢測。
結果如圖1所示，採用試驗組3直接凍存到-80℃，12h再轉存於液氮中保存6個月的p6代脂肪幹細胞的仍然具有成脂分化能力，表明採用試驗組3所配置的凍存液在不經過常規的程序性降溫的情況下，對脂肪幹細胞的成脂分化能力沒有影響。
以上所述僅是本發明的優選實施方式，應當指出，對於本技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發明的保護範圍。