一種螢光分析方法和裝置製造方法
2023-05-23 21:29:21
一種螢光分析方法和裝置製造方法
【專利摘要】本發明涉及一種螢光分析方法和裝置，具體地，本發明公開了一種用於定量檢測樣品中的待測物的滲漏檢測裝置，所述裝置包括(1)包含檢測區的多孔膜和(2)位於多孔膜下方的吸收墊。本發明還公開了一種基於所述滲漏檢測裝置的定量檢測待測物的檢測方法和一種基於所述檢測方法的檢測裝置。
【專利說明】一種螢光分析方法和裝置
【技術領域】
[0001]本發明屬於體外檢測【技術領域】，具體地涉及一種基於測量螢光強度的分析方法和
>J-U ρ?α裝直。
【背景技術】
[0002]在免疫檢測領域中，常常需要對各類抗原或抗體進行定性或定量檢測。現有技術中，以「競爭抑制和雙抗夾心」為基礎衍生出多種免疫反應分析方法，如:放射免疫法、酶聯免疫法、化學發光法、時間分辨螢光法和螢光免疫法等，可用於確定病原微生物，對人體的特異性蛋白定量檢測，從而對疾病進行輔助診斷或監測等等，用途非常廣泛。這類免疫反應分析方法，通常將捕獲抗體固定於固相載體，然後與抗原(目標蛋白)反應，洗滌後再與標記抗體反應，洗滌，最後檢測放射性強度、溶液吸光度或光信號等，從而報告檢測樣本中目標蛋白的濃度。上述方法的自 動化免去了人工洗滌的煩瑣，但正因為自動化，使得儀器體積龐大價格昂貴，一般只在大型實驗室使用。
[0003]斑點金免疫滲濾技術(dotimmunogold filtration assay, DIGFA)是 Spielberg等最初於1989年通過檢測抗HIV建立，隨著膠體金技術、材料技術以及計算機的高速發展，斑點金免疫滲濾技術日臻完備，作為以膜為載體的膠體金快速診斷技術中的一種，具有檢測快速、便捷、不需要特殊設備、結果判斷直觀等優點。由於該方法只需肉眼觀察即可，非專業人士也可操作，使急診、基層醫院、病人床邊和現場等遠離大型實驗室的地方開展相關檢測成為可能，所以應用範圍相當廣泛。如:已應用於多種寄生蟲病標誌物、心臟病標誌物、傳染性疾病標誌物、毒物、性傳播疾病和其他生化指標的檢測等，在其他領域如食品衛生、環境保護等領域都有報導。
[0004]DIGFA法已經超過20年的發展，但其基本的工作原理並未改變，這決定了到目前為止，它只用於定性或半定量檢測且靈敏度也不如前述的定量免疫分析方法，進一步的應用遇到了瓶頸。因此，本領域急需對現有的DIGFA方法進行變革，在賦予其高靈敏度和定量準確的新優勢的同時，保持其快捷、簡便、成本低廉等特點，從而進一步擴展其應用領域。
【發明內容】
[0005]本發明提供了一種滲漏檢測裝置，用於定量檢測樣品中的待測物。
[0006]本發明提供了一種定量檢測待測物的檢測方法，所述方法靈敏度高，定量準確。
[0007]本發明還提供了一種定量檢測待測物的檢測裝置。
[0008]在本發明第一方面中，提供了一種滲漏檢測裝置，該滲漏檢測裝置包括:
[0009](al)包含檢測區的多孔膜，其中，所述的檢測區包含固定化捕獲劑，並且
[0010]所述固定化捕獲劑能同時與可流動的螢光物質和可流動的第一結合劑結合，從而形成「螢光物質一捕獲劑一第一結合劑」複合物；所述第一結合劑可與待測物結合，且所述待測物能與第二結合劑結合，從而形成「第一結合劑一待測物一第二結合劑」複合物；
[0011]從而當檢測區接觸所述的螢光物質、第一結合劑、待測物和第二結合劑後，在檢測區形成「螢光物質一捕獲劑一第一結合劑一待測物一第二結合劑」複合物，其中，所述的第二結合劑被吸光物質標記，且所述吸光物質影響所述螢光物質的螢光強度；
[0012](a2)位於多孔膜下方的吸收墊，所述吸收墊具有吸收能力，使得加至檢測區的樣品和液體透過多孔膜並被吸收墊吸收。
[0013]在另一優選例中，所述固定化捕獲劑為鏈親和素，所述螢光物質被生物素標記，所述第一結合劑被生物素標記。
[0014]在另一優選例中，所述的第一結合劑和第二結合劑的種類或數量為一種或多種；較佳地，可同時用於檢測一種或多種待測物。
[0015]在另一優選例中，所述的滲漏檢測裝置是定量檢測裝置。
[0016]在另一優選例中，所述待測物為抗原或抗體。
[0017]在另一優選例中，所述的待測物是抗原，則所述的第一結合劑和第二結合劑是可同時結合於所述抗原的抗體；或者所述的待測物是抗體，則所述的第一結合劑和第二結合劑是可同時結合於所述抗體的抗原或所述抗體的抗體(抗抗體)。
[0018]在本發明第二方面中，提供了一種滲漏檢測裝置，該滲漏檢測裝置包括:
[0019](bl)包含檢測區的多孔膜，其中，所述的檢測區包含固定化捕獲劑，並且
[0020]所述固定化捕獲劑能同時與可流動的螢光物質和可流動待測物等同物結合，從而形成「螢光物質一捕獲劑一待測物等同物」複合物；所述待測物等同物能與結合劑結合，從而形成「待測物等同物一結合劑」複合物，且所述結合劑能與待測物結合；
[0021]從而當檢測區接觸所述的螢光物質、結合劑、待測物和待測物等同物後，在檢測區形成「螢光物質一捕獲劑一待測物等同物一結合劑」複合物，其中，所述的結合劑被吸光物質標記，且所述吸光物質影響所述螢光物質的螢光強度；
[0022](b2)位於多孔膜下方的吸收墊，所述吸收墊具有吸收能力，使得加至檢測區的樣品和液體透過多孔膜並被吸收墊吸收。
[0023]在另一優選例中，所述固定化捕獲劑為鏈親和素，則所述螢光物質被生物素標記，所述待測物等同物被生物素標記。
[0024]在另一優選例中，所述的結合劑的種類或數量為一種或多種；較佳地，可同時用於檢測一種或多種待測物。
[0025]在另一優選例中，所述的滲漏檢測裝置是定量檢測裝置。
[0026]在另一優選例中，所述待測物為抗原或抗體。
[0027]在另一優選例中，所述的待測物是抗原，則所述的結合劑是可結合於所述抗原的抗體；或者所述的待測物是抗體，則所述的結合劑是可結合於所述抗體的抗原或所述抗體的抗體(抗抗體)。
[0028]在另一優選例中，所述的滲漏檢測裝置還包括:
[0029]在吸收墊下方存在一底部裝置；
[0030]在多孔膜上方還存在一蓋部裝置，所述蓋部裝置上具有可供加入樣品的開孔，且所述多孔膜位於該開孔下方。
[0031]在另一優選例中，所述螢光物質的激發或發射光譜與所述吸光物質的吸收光譜全部或部分重疊。
[0032]在另一優選例中，所述多孔膜上還包括不同於檢測區的對照區，所述對照區含有固定化的對照劑，其中，所述對照劑用於特異性結合被吸光物質標記的結合劑。
[0033]在另一優選例中，所述對照區用於顯示待測物的檢測結果的有效性。
[0034]在另一優選例中，所述的待測物包括:蛋白、核酸或小分子化合物。
[0035]在另一優選例中，所述的待測物是液相(溶液)、懸浮液或固相。
[0036]在另一優選例中，所述螢光物質選自下組:螢光素、羧基螢光素、2-甲氧基螢光素、4，5_ 二甲氧基螢光素、羅丹明、藻紅蛋白、量子點、或稀土元素離子或其螯合物。
[0037]在另一優選例中，所述的吸光物質選自下組:膠體金、納米金棒、納米銀棒或其組
八
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[0038]在另一優選例中，所述的吸光物質為納米金棒。
[0039]在另一優選例中，所述的納米金棒的縱橫比為1.5-10，較佳地為1.5-5。
[0040]在另一優選例中，所述的納米金棒的長度為10-200nm，較佳地為20-100nm。
[0041]在另一優選例中，所述的膠體金是平均粒徑為10_70nm的膠體金顆粒。
[0042]在本發明第三方面中，提供了一種定量檢測待測物的螢光分析方法，包括步驟:
[0043](al)將第一結合劑、待測物樣品和第二結合劑分別添加於滲漏檢測裝置的檢測區，或將第一結合劑、待測物樣品和第二結合劑的混合後添加於所述的檢測區，
[0044]並且將螢光物質添加於所述的檢測區；其中，所述的檢測區包含固定化捕獲劑，並且所述固定化捕獲劑能同時與可流動的螢光物質和可流動的第一結合劑結合，從而形成「螢光物質一捕獲劑一第一結合劑」複合物；所述第一結合劑可與待測物結合，且所述待測物能與第二結合劑結合，從而形成「第一結合劑一待測物一第二結合劑」複合物；
[0045]從而當檢測區接觸所述的螢光物質、第一結合劑、待測物和第二結合劑後，在檢測區形成「螢光物質一捕獲劑一第一結合劑一待測物一第二結合劑」複合物，其中，所述的第二結合劑被吸光物質標記，且所述吸光物質影響所述螢光物質的螢光強度；
[0046](2)檢測所述檢測區的螢光強度F，從而測得待測物的存在與否或數量。
[0047]在本發明第四方面中，提供了一種定量檢測待測物的螢光分析方法，包括步驟:
[0048](bl)將待測物樣品、待測物等同物和結合劑依次添加於滲漏檢測裝置的檢測區，
[0049]或者
[0050]首先提供一將待測物樣品和待測物等同物的第一混合物，然後將結合劑和第一混合物依次添加於所述的檢測區，或者將結合劑和第一混合物所形成的第二混合物添加於所述的檢測區，
[0051]或者
[0052]首先提供一待測物樣品和結合劑的第三混合物，然後將待測物等同物和第三混合物依次添加於所述的檢測區、或者將待測物等同物與第三混合物所形成的第四混合物添加於所述的檢測區，
[0053]並且將螢光物質添加於所述的檢測區；其中，所述的檢測區包含固定化捕獲劑，並且所述固定化捕獲劑能同時與可流動的螢光物質和可流動待測物等同物結合，從而形成「螢光物質一捕獲劑一待測物等同物」複合物；所述待測物等同物能與結合劑結合，從而形成「待測物等同物一結合劑」複合物，且所述結合劑能與待測物結合；
[0054]從而當檢測區接觸螢光物質、待測物樣品、待測物等同物和結合劑後，在檢測區形成「螢光物質一捕獲劑一待測物等同物一結合劑」複合物，其中，所述的結合劑被吸光物質標記，且所述吸光物質影響所述螢光物質的螢光強度；
[0055](2)檢測所述檢測區的螢光強度F，從而測得待測物的存在與否或數量。
[0056]在另一優選例中，所述的步驟(2)包括:將檢測區的螢光強度F和標準曲線或者與未加樣的初始螢光強度H)進行比較，從而確定待測物的存在與否或數量。
[0057]在另一優選例中，所述的待測物是液相(溶液)、懸浮液或固相。
[0058]在另一優選例中，當待測物為固相時，步驟(I)還包括加入溶劑(如水或緩衝液)
[0059]在另一優選例中，所述的方法還包括用已知濃度的待測物標準品進行測量，從而製作標準曲線的步驟。
[0060]在本發明第五方面中，提供了一種定量檢測待測物的螢光測量裝置，所述的裝置包括:
[0061](a) 一本發明第一方面或本發明第二方面所述的滲漏檢測裝置；和
[0062](b) 一用於檢測螢光強度的檢測器。
[0063]在另一優選例中，所述裝置還包括光源和計算機。
[0064]所述光源照射到檢測區處，激發出的螢光進入檢測器，由計算機進行數據處理和分析。
[0065]應理解，在本發明範圍內中，本發明的上述各技術特徵和在下文(如實施例)中具體描述的各技術特徵之間都可以互相組合，從而構成新的或優選的技術方案。限於篇幅，在
此不再一一累述。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0066]圖1A是滲漏檢測裝置示意圖。
[0067]圖1B是滲漏檢測裝置示意圖。
[0068]圖2是檢測裝置示意圖。
[0069]圖3是實施例1的AFP標準系列濃度(IgC)與相應螢光強度(F)標準曲線圖。
[0070]圖4是實施例2的CRP標準系列濃度(C)與相應螢光強度(F)標準曲線圖。
【具體實施方式】
[0071]本發明人通過長期而深入的研究，發現了一種基於螢光淬滅原理的檢測方法，所述方法通過親和素將可流動的螢光物質和含吸光物質的複合物結合，不僅可以通過目測檢測區的顏色來判斷是否含有待測物，還可以通過測量檢測區處螢光強度的方式來定量檢測待測物。所述方法不僅具有靈敏度高，定量準確的優點，而且操作仍然十分簡便、快捷、且成本低廉。所述方法是基於本發明提供的一種滲濾測試裝置，通過一種含有光源和檢測器的裝置實現了對待測物的定量檢測。在此基礎上，發明人完成了本發明。
[0072]滲漏檢測裝置
[0073]現在更詳細地描述用於製造本發明滲漏檢測裝置的方法和材料。應注意，滲漏檢測裝置的具體構造可以變化，這取決於意圖用滲漏檢測裝置來進行的具體測試。在實施例之外製造滲漏檢測裝置的變動方法，也落於本發明範圍之中。
[0074]滲漏檢測裝置可包括蓋部裝置1，所述蓋部裝置具有一個便於加樣的開孔11，所述開孔可以是圓形、方形等多種形狀。[0075]多孔膜2(或微孔膜)位於蓋部裝置I的開孔下方，所述多孔膜包括:檢測區和優選的設置有對照區，且通常對照區與檢測區之間有適當的空間。
[0076]吸收墊3位於多孔膜下方。
[0077]位於吸收墊下方還具有一底部裝置4。
[0078]按圖1B所示，分別將多孔膜2、吸收墊3、蓋部裝置I和底部裝置4裝配成滲濾測
試裝置。
[0079]所述滲漏檢測裝置可以是多種形式存在，例如板，片或盒等。以盒為例，所述蓋部裝置為盒蓋，所述底部裝置為盒底，可以將多孔膜安放在盒蓋開孔(如0.4?0.8cm的圓孔)正下方，吸收墊在多孔膜的正下方，緊密閉合蓋、底，使多孔膜貼緊吸收墊，即製備成圖1A所示的滲漏檢測裝置。
[0080]所述蓋部裝置和底部裝置可以用任何穩定的、無孔的材料製成。因為許多測定用水作為擴散介質，因此底部裝置較佳地是基本上不透水的，且其強度應足以支承粘於其的滲漏檢測裝置。在一個優選例中，背襯片是用聚合物物(如塑料)製成的。
[0081]所述吸收墊可以用任何能吸收作為樣品和緩衝液的液體的材料製成。吸收墊片的吸收能力應足夠大，以便吸收添加至滲漏檢測裝置的液體。適用於吸收墊片的材料的例子包括纖維素和玻璃纖維。
[0082]所述多孔膜可以用任何材料製成，只要該材料有足夠孔隙度從而允許在表面和內部發生流體的毛細管作用。多孔膜應有足夠的孔隙度，從而允許塗有抗體或抗原的顆粒移動。多孔膜還可被含待檢測分析物的樣品中所用的液體潤溼(例如，對於水性液體具有親水性，對於有機溶劑具有疏水性)。通過例如在美國專利N0.4，340, 482或N0.4，618，533中所述的方法(這些方法描述了將疏水表面轉變成親水表面)，可以改變其疏水性從而使其具有親水性以便用於水性液體。可用於製造多孔膜的材料例子包括:聚脂膜、纖維素、硝酸纖維素、乙酸纖維素、玻璃纖維、尼龍、聚電解質離子交換膜、丙烯共聚物/尼龍、和聚醚碸(polyethersulfone)。在一優選例中,所述多孔膜為硝酸纖維素膜片。
[0083]檢測方法
[0084]本發明滲漏檢測裝置可用於大量不同的滲漏分析方法，而這些分析方法涉及使用一種可流動的突光物質、一種或多種結合劑和一種固定化捕獲劑，其中，至少一種結合劑被吸光物質標記。當捕獲劑捕獲所述的螢光物質和吸光物質標記的結合劑後，可形成含有吸光物質和螢光物質的複合物。具體地，當所述吸光物質影響(部分淬滅或全部淬滅)所述螢光物質的螢光強度時，本發明的檢測方法即可通過檢測螢光物質的螢光強度來測定待測物的數量。
[0085]如本文所用，術語「待測物」、「其等同物」或「分析物」指待用滲漏檢測裝置檢測以及可任選地被定量測定的、樣品中的任何組份，待測物或其等同物或分析物的例子包括:蛋白質，如激素或其他分泌蛋白質、酶和細胞表面蛋白；糖蛋白；肽；小分子；多糖；抗體(包括單克隆抗體或多克隆抗體及其片段)；核酸；藥物(包括地高辛等強心甙類藥物)；毒素；病毒或病毒顆粒；細胞壁組份；或其他具有表位的化合物。
[0086]優選地，所述的待測物包括腫瘤標誌物、心肌標誌物等特異性的蛋白，所述腫瘤標誌物選自下組:甲胎蛋白(AFP)、C-反應蛋白(CRP)、癌胚抗原(CEA)、癌抗原125 (CA125)、糖抗原19-9 (CA19-9)、總前列腺特異性抗原(PSA)、游離前列腺特異性抗原(f-PSA)、神經原特異性烯醇化酶(NSE)、糖鏈抗原(CA242)、癌抗原(CA15-3)、或人絨毛膜促性腺激素(β -HCG)。
[0087]結合劑
[0088]本發明所用的結合劑可以是任何能夠結合於待測物或其等同物的物質。具體地，為特異性結合待測物或其等同物的物質。
[0089]有各種不同類型的分子可用作分析物結合劑，其中包括例如:寡核苷酸、抗體、工程化蛋白、肽、半抗原、或含有抗原(該抗原具有分析物結合位點)的異源混合物的裂解物。P.Holliger 等人，Trends in Biotechnology 13:7-9 (1995) ; S.M.Chamow 等人，Trends inBiotechnology 14:52-60(1996)。如果待檢測分析物是配體,那麼可使用結合於該配體的受體，反之亦然。
[0090]標記物質
[0091]用於結合劑的標記物，本發明優先選用吸光物質標記物(簡稱吸光物質)。當螢光物質和吸光標記物通過特定的方式結合後，當螢光物質的激發或發射光譜與吸光物質的吸收光譜部分或完全重疊時，吸光物質會影響(部分淬滅或全部淬滅)螢光物質的螢光，從而通過檢測螢光物質的螢光強度來測定待測物的數量。
[0092]在一優選例中，可檢測標記物是顆粒。可使用的顆粒例子包括(但並不限於):膠體金顆粒；膠體硫顆粒；膠體硒顆粒；膠體硫酸鋇顆粒；膠體硫酸鐵顆粒；金屬碘酸鹽顆粒；滷化銀顆粒；二氧化娃顆粒；膠體(水合)金屬氧化物顆粒；膠體金屬硫化物顆粒；膠體硒化鉛顆粒；膠體硒化鎘顆粒；膠體金屬磷酸鹽顆粒；膠體金屬鐵酸鹽顆粒；塗有有機或無機層的上述任一種膠體顆粒；蛋白質或肽分子；脂質體；或有機聚合物乳膠顆粒，例如聚苯乙烯乳膠珠。
[0093]螢光物質和吸光物質的選擇
[0094]用於本發明標記的螢光物質和吸光物質應配合使用，基本原則是螢光物質的激發或發射光譜與吸光物質的吸收光譜部分或完全重疊。最優的是完全重疊，如此會有較高的檢測靈敏度。
[0095]代表性的螢光物質包括(但並不限於):螢光素、羧基螢光素、2-甲氧基螢光素、4,5-二甲氧基突光素、羅丹明、藻紅蛋白(Phycoerythrin, PE)、量子點、稀土元素離子(如Eu3+)及其螯合物等組合，只要所選螢光物質的激發或發射光譜與所選吸光物質的吸收光譜
有重疊即可。
[0096]代表性的吸光物質包括(但並不限於):膠體金、納米金棒、納米銀棒等組合，只要所選吸光物質的吸收光譜與所選螢光物質的激發或發射光譜重疊即可。
[0097]膠體金顆粒可用任何常規方法製造,例如總結於G.Frens, 1973 Nature PhysicalScience, 241:20(1973)中的方法。其他方法描述於美國專利N0.5，578，577,5, 141，850、4，775，636、4，853，335、4，859，612、5，079，172、5，202，267、5，514，602、5，616，467、5，681，775。
[0098]如本文所用，術語「納米金棒」指具有一定縱橫比、且橫軸和縱軸處於5-200納米範圍的金顆粒。
[0099]一種特別優選的吸光物質是膠體金，尤其是粒徑為20_40nm的膠體金。
[0100]優選地，本領域技術人員常用螢光標記物質包括PE，PE的吸收光譜在55(T650nm之間，最大發射波長為575nm,而30nm膠體金的吸收光譜在30(T800nm,較寬泛,最大吸收峰為525飛30nm處，與PE的發射光譜有部分重疊，所以選擇30nm膠體金作為相應的吸光物質。
[0101]螢光淬滅原理
[0102]含有螢光標記的物質與含有吸光物質標記的物質結合後，當螢光物質的激發或發射光譜與作為螢光淬滅劑的吸光物質的吸收光譜全部或部分重疊時，因共振能量轉移，吸光物質會對該螢光物質的螢光產生淬滅作用。
[0103]本發明中，引起螢光淬滅的原因包括兩個方面:一是複合物內部吸光物質對螢光物質的淬滅；二是堆積在一起的複合物之間的相互淬滅，如:複合物甲的吸光物質淬滅複合物乙的螢光，複合物乙的吸光物質淬滅複合物丙的螢光，複合物丙的吸光物質淬滅複合物甲的螢光，依此類推。
[0104]工作原理
[0105]現結合圖1A和圖1B和具體的實施方式說明本發明檢測方法的工作原理:
[0106]方法一、
[0107]檢測區處也可固定其他能捕獲「夾心複合物」的螢光標記物質。
[0108](1.1)用針對待測物(記為Ag,如抗原)的一抗體(記為Abl)標記biotin (記為biotin-Abl)，用針對該待測物的另一抗體(記為Ab2)標記吸光物質G (記為Ab2-G，也稱為抗原的金標抗體)，將2個被標記的抗體與待測物混合，復溶，形成如biotin-Abl-Ag-Ab2-G的複合物I ;
[0109](1.2)用一突光物質(記為F)標記biotin,形成如biotin-F的複合物2,其中G的吸收光譜與F的激發和(或)發射光譜完全和(或)部分重疊；
[0110](1.3)通過加樣孔11，將複合物I與複合物2 (或複合物2與構成複合物I的各種物質，反應後仍得到複合物I與複合物2)加在多孔膜上，待完全滲入，於小孔內滴加緩衝液，待完全滲入，固定在此的捕獲劑親和素(streptavidin,SA)捕獲上述複合物I與複合物2，形成同時含有螢光物質和吸光物質的沉積物，其中的金淬滅螢光物質的螢光。
[0111](1.4)同時游離金標抗體被對照劑(如抗金標抗體的抗體)捕獲，呈現紅色，說明檢測有效。
[0112](1.5)測定檢測區處螢光物質的螢光強度，螢光越強說明待測物濃度越低，反之則待測物的濃度越高；如樣本中無抗原時，則檢測區處的螢光強度為原始螢光強度，最強。
[0113]本發明還適用於競爭抑制法:
[0114]方法二、
[0115](2.1)用待測物的標準抗原(記為AgO)標記biotin,形成biotin-AgO ;用針對待測物(如抗原，記為Ag)的一抗體(記為Abl)標記吸光物質G，形成Abl-G，將Abl-G與biotin-AgO混合,復溶,形成如biotin-AgO-Abl-G的複合物I ;
[0116](2.2)用一突光物質(記為F)標記biotin,形成如biotin-F的複合物2,其中G的吸收光譜與F的激發和(或)發射光譜完全和(或)部分重疊；
[0117](2.3)將 biotin-AgO、待測物(記為 Ag)、Abl_G 和 biotin-F 混合,通過加樣孔 11,將所形成的混合物加至多孔膜上，固定在檢測區的捕獲劑親和素(streptavidin，SA)同時捕獲上述複合物I與複合物2，形成含有螢光物質和吸光物質的沉積物，其中的金淬滅螢光物質的螢光；
[0118]優選地，在加至多孔膜之前，將biotin-F、biotin-AgO和待測物(記為Ag)混合後，再與Abl-G混合，或者將biotin-AgO和待測物(記為Ag)混合後，再與Abl-G和biotin-F 混合；
[0119](2.4)測定檢測區處螢光物質的螢光強度，biotin-AgO與Ag競爭性地與Abl-G結合，Ag越多，生成的複合物I越少，從而使得螢光強度越強。
[0120]因此，螢光越強，待測物濃度越高，反之，則待測物的濃度越低；若樣本中無待測物，則多孔膜上檢測區處形成的複合物I最多，相應地，螢光最弱。
[0121]檢測裝置
[0122]現結合圖2說明本發明的檢測裝置:
[0123]如圖2所示，所述裝置可以包括:滲漏檢測裝置、檢測器、光源、光導纖維和計算機。還可以包括一份檢測方法的使用說明。其中滲漏檢測裝置的工作原理如上所述，螢光強度的檢測方法可以如下所述(但不僅限於此)，任何可用於檢測螢光強度的方法均可用於本發明的檢測裝置。[0124]激發光通過Y型光導纖維的I個分支照射到多孔膜的檢測區處，激發出的螢光通過Y型光導纖維的另I分支進入檢測器，由計算機進行數據處理和分析。
[0125]本發明中，光源用於提供某一發射波長的光線，從而激發突光物質發出突光。可選用任何可以提供合適波長的光源，包括(但不限於):LED、氙燈、滷鎢燈、雷射等。一種優選的光源是雷射光源，雷射光源可用本領域常規的方法和設備(如雷射器)產生。代表性的雷射器包括(但並不限於):半導體雷射器、氦氖雷射器、氬離子雷射器、還包括波長可選的雷射器、多波長雷射器和雙波長雷射器等。
[0126]雷射器產生的雷射波長與雷射介質有關，常見的雷射波長見下表:
[0127]
【權利要求】
1.一種滲漏檢測裝置，其特徵在於，該滲漏檢測裝置包括: (al)包含檢測區的多孔膜，其中，所述的檢測區包含固定化捕獲劑，並且所述固定化捕獲劑能同時與可流動的螢光物質和可流動的第一結合劑結合，從而形成「螢光物質一捕獲劑一第一結合劑」複合物；所述第一結合劑可與待測物結合，且所述待測物能與第二結合劑結合，從而形成「第一結合劑一待測物一第二結合劑」複合物； 從而當檢測區接觸所述的螢光物質、第一結合劑、待測物和第二結合劑後，在檢測區形成「螢光物質一捕獲劑一第一結合劑一待測物一第二結合劑」複合物，其中，所述的第二結合劑被吸光物質標記，且所述吸光物質影響所述螢光物質的螢光強度； (a2)位於多孔膜下方的吸收墊，所述吸收墊具有吸收能力，使得加至檢測區的樣品和液體透過多孔膜並被吸收墊吸收。
2.一種滲漏檢測裝置，其特徵在於，該滲漏檢測裝置包括: (bl)包含檢測區的多孔膜，其中，所述的檢測區包含固定化捕獲劑，並且所述固定化捕獲劑能同時與可流動的螢光物質和可流動待測物等同物結合，從而形成「螢光物質一捕獲劑一待測物等同物」複合物；所述待測物等同物能與結合劑結合，從而形成「待測物等同物一結合劑」複合物，且所述結合劑能與待測物結合； 從而當檢測區接觸所述的螢光物質、結合劑、待測物和待測物等同物後，在檢測區形成「螢光物質一捕獲劑一待測物等同物一結合劑」複合物，其中，所述的結合劑被吸光物質標記，且所述吸光物質影響所述螢光物質的螢光強度； (b2)位於多孔膜下方的吸收墊，所述吸收墊具有吸收能力，使得加至檢測區的樣品和液體透過多孔膜並被吸收墊吸收。
3.如權利要求1或2所述的滲漏檢測裝置，其特徵在於，所述的滲漏檢測裝置還包括: 在吸收墊下方存在一底部裝置； 在多孔膜上方還存在一蓋部裝置，所述蓋部裝置上具有可供加入樣品的開孔，且所述多孔膜位於該開孔下方。
4.如權利要求1或2所述的滲漏檢測裝置，其特徵在於，所述螢光物質的激發或發射光譜與所述吸光物質的吸收光譜全部或部分重疊。
5.如權利要求1或2所述的滲漏檢測裝置，其特徵在於，所述多孔膜上還包括不同於檢測區的對照區，所述對照區含有固定化的對照劑，其中，所述對照劑用於特異性結合被吸光物質標記的結合劑。
6.如權利要求1或2所述的滲漏檢測裝置，其特徵在於，所述的待測物包括:蛋白、核酸或小分子化合物。
7.如權利要求1或2所述的滲漏檢測裝置，其特徵在於，所述螢光物質選自下組:螢光素、羧基螢光素、2-甲氧基螢光素、4，5_ 二甲氧基螢光素、羅丹明、藻紅蛋白、量子點、或稀土元素離子或其螯合物。
8.如權利要求1或2所述的滲漏檢測裝置，其特徵在於，所述的吸光物質選自下組:膠體金、納米金棒、納米銀棒或其組合。
9.一種定量檢測待測物的螢光分析方法，其特徵在於，包括步驟: (al)將第一結合劑、待測物樣品和第二結合劑分別添加於滲漏檢測裝置的檢測區，或將第一結合劑、待測物樣品和第二結合劑的混合後添加於所述的檢測區，並且將螢光物質添加於所述的檢測區；其中，所述的檢測區包含固定化捕獲劑，並且所述固定化捕獲劑能同時與可流動的螢光物質和可流動的第一結合劑結合，從而形成「螢光物質一捕獲劑一第一結合劑」複合物；所述第一結合劑可與待測物結合，且所述待測物能與第二結合劑結合，從而形成「第一結合劑一待測物一第二結合劑」複合物； 從而當檢測區接觸所述的螢光物質、第一結合劑、待測物和第二結合劑後，在檢測區形成「螢光物質一捕獲劑一第一結合劑一待測物一第二結合劑」複合物，其中，所述的第二結合劑被吸光物質標記，且所述吸光物質影響所述螢光物質的螢光強度； (2)檢測所述檢測區的螢光強度F，從而測得待測物的存在與否或數量。
10.一種定量檢測待測物的螢光分析方法，其特徵在於，包括步驟: (bl)將待測物樣品、待測物等同物和結合劑依次添加於滲漏檢測裝置的檢測區， 或者 首先提供一將待測物樣品和待測物等同物的第一混合物，然後將結合劑和第一混合物依次添加於所述的檢測區，或者將結合劑和第一混合物所形成的第二混合物添加於所述的檢測區， 或者 首先提供一待測物樣品和結合劑的第三混合物，然後將待測物等同物和第三混合物依次添加於所述的檢測區、或者將待測物等同物與第三混合物所形成的第四混合物添加於所述的檢測區， 並且將螢光物質添加於所述的檢測區；其中，所述的檢測區包含固定化捕獲劑，並且所述固定化捕獲劑能同時與可流動的螢光物質和可流動待測物等同物結合，從而形成「螢光物質一捕獲劑一待測物等同物·」複合物；所述待測物等同物能與結合劑結合，從而形成「待測物等同物一結合劑」複合物，且所述結合劑能與待測物結合； 從而當檢測區接觸螢光物質、待測物樣品、待測物等同物和結合劑後，在檢測區形成「螢光物質一捕獲劑一待測物等同物一結合劑」複合物，其中，所述的結合劑被吸光物質標記，且所述吸光物質影響所述螢光物質的螢光強度； (2)檢測所述檢測區的螢光強度F，從而測得待測物的存在與否或數量。
11.如權利要求9或10所述的方法，其特徵在於，步驟(2)包括:將檢測區的螢光強度F和標準曲線或者與未加樣的初始螢光強度H)進行比較，從而確定待測物的存在與否或數量。
12.一種定量檢測待測物的螢光測量裝置，其特徵在於，所述的裝置包括: (a)一權利要求1或2所述的滲漏檢測裝置；和 (b)一用於檢測螢光強度的檢測器。
【文檔編號】G01N21/64GK103712963SQ201210378343
【公開日】2014年4月9日 申請日期:2012年9月29日 優先權日:2012年9月29日
【發明者】不公告發明人 申請人:龐磊