一種硫酸銅快速定量分析發酵液提取物中長鏈二元酸含量的方法

2023-05-23 21:19:51 1

專利名稱：一種硫酸銅快速定量分析發酵液提取物中長鏈二元酸含量的方法
技術領域：
本發明涉及二元酸發酵技術領域的檢測方法，具體地，涉及一種利用硫酸銅比色法快速定量分析發酵液提取物中長鏈二元酸的方法。
背景技術：
長鏈二元酸(long chain dicarboxylic acids, DCAs)是指碳鏈中含有10個以上碳原子的脂肪族二元羧酸。長鏈二元酸是重要的有機酸產品，用於合成高性能工程塑料尼龍1212、高檔服裝用尼龍熱熔膠和高級塗料等，市場需求量相當大。用化學法生產長鏈二元酸存在技術、設備要求，高能耗大等缺點，而且一些長鏈二元酸也難以用化學方法製備，目前長鏈二元酸的生產逐步採用微生物發酵法進行。在長鏈二元酸發酵過程中，必須經常性的對發酵液中長鏈二元酸含量進行分析，以合理的控制發酵進程。對發酵過程產酸量分析可以採用氣相色譜法、薄層色譜法、以及NaOH滴定法，其中氣相色譜法需使用價格昂貴的氣相色譜儀、還需對長鏈二元酸進行衍生處理，不但成本高、檢測時間長，而且對系統的各項要求也很高(中國科學院微生物研究所烴代謝組.微生物的正烷烴代謝I假絲醉母的正烷經代謝產物的研究.微生物學報，1981，21(1) 88-95)；薄層色譜法同樣也存在檢測時間長、儀器設備要求高的問題(王麗華等.薄層色譜法分析十三碳二元酸及其單、雙甲酯.石油化工高等學校學報，2003，16 O) :29-32)。NaOH滴定法由於操作簡單，常用於發酵過程粗提產品中長鏈二元酸的快速分析，但滴定法存在較大誤差一直難以克服。李佔朝等研究表明為了獲得較準確的檢測結果，需要經過多次重複實驗，取其平均值(李佔朝.十二碳二元酸的重結晶精製工藝研究.北京化工大學碩士學位論文，2009，17-26.)。此外，發酵生產長鏈二元酸粗提工藝大多採用酸沉澱法，直接利用NaOH滴定計算二元酸產量，提取物中無機酸殘留也會造成較大誤差。因此，研究建立一種簡便、準確、高效的長鏈二元酸檢測方法， 可供實驗研究及實際生產的分析檢測所需。

發明內容
本發明的目的在於提供一種利用硫酸銅比色法快速定量分析發酵液提取物中長鏈二元酸的方法。通過長鏈二元酸與硫酸銅-甲醇溶液的Cu2+反應形成沉澱，離心去除沉澱後，在600-850nm檢測上清液吸光值，根據標準曲線計算長鏈二元酸的含量。本發明包括發酵長鏈二元酸樣品的製備，比色法快速分析長鏈二元酸含量兩部分。操作步驟如下(1)發酵長鏈二元酸樣品的製備取體積為V1的發酵液加lmol/1氫氧化鈉調節pH至9. 5、60°C下振蕩30min使長鏈二元酸充分溶於水相中。離心使發酵液中固相、水相及發酵剩餘烷烴分離，取出體積為V2 的水相部分，用6mol/L HCl調pH值至2. 0，加入2倍V2體積的乙醚進行抽提，分相後乙醚萃取液倒入燒杯中，再以2倍V2體積的乙醚重新萃取一次，合併萃取液，在通風櫥中吹去乙醚，得到白色固體即為長鏈二元酸粗提物。(2)比色法快速分析長鏈二元酸含量①配製硫酸銅-甲醇溶液稱取Ig硫酸銅加入乾燥的錐形瓶中，量取20_200mL甲醇與硫酸銅混合，搖勻，至硫酸銅完全溶解。②檢測波長的選擇取硫酸銅-甲醇溶液進行光譜掃描，以最強吸收峰波長為檢測分析波長。對空白測定20次，方法的檢出限(3s/k)為0.011mg/mL。③標準曲線的建立精確稱量標準十二烷二酸25、50、75、100、125、150、175、 200mg，加入5mL硫酸銅-甲醇反應溶液，使標準十二烷二酸濃度分別為5、10、15、20、25、 30、35、40mg/mL(每個標準樣設3個平行)，常溫120rpm振蕩反應10_60min，5000rpm離心 IOmin,取上清液於820nm波長處測定吸光值。以OD82tl為橫坐標，標準十二烷二酸含量為縱坐標繪製工作曲線，線性回歸方程為C1 = -91. 185X0D82Q+101.66，決定係數R2 = 0. 9920。④樣品中長鏈二元酸含量分析將一定量的待測物加入到5mL硫酸銅-甲醇反應監測溶液中，常溫120rpm振蕩反應10_60min，5000rpm離心lOmin，取上清液於820nm波長處測定吸光值。將吸光值代入標準曲線的線性回歸方程中，即可計算出檢測反應液中長鏈
二元酸的含量。根據以下公式即可算出發酵液中長鏈二元酸含量(以十二烷二酸為標準)
…r、 C C1 c 101.66-91.185XOD820C(g/L) = 5x-^ = 5x---^
廠2*2本發明的優點在於長鏈二元酸易溶於甲醇，在均相條件下和顯色劑硫酸銅反應迅速、完全；利用比色法檢測反應上清液吸光值，操作簡單，提高檢測結果的精確度；整個分析檢測不需要昂貴儀器設備或貴重試劑，成本低。
具體實施例方式為了更好的理解本發明，下面結合實施例子對本發明做進一步的描述。實例1 (1)發酵長鏈二元酸樣品的製備取IOOmL發酵液加lmol/L氫氧化鈉調節pH至9. 5、60°C下振蕩30min使長鏈二元酸充分溶於水相中。SOOOrpm離心IOmin使發酵液中固體、水相以及發酵剩餘烷烴分離，取出IOmL水相部分，用6mol/LHCl調pH值至2. 0，加入20mL乙醚進行抽提，分相後乙醚萃取液倒入燒杯中，再以20mL的乙醚重新萃取一次，合併萃取液，在通風櫥中吹去乙醚，得到白色固體即為長鏈二元酸提取物。(2)比色法快速分析長鏈二元酸含量將長鏈二元酸提取物加入到5mL硫酸銅-甲醇反應監測溶液中，常溫120rpm振蕩反應10-60min，5000rpm離心lOmin，取上清液於820nm波長處測定吸光值。根據公式
C(8/L) = 5χ·| = 5χ !Ο1.66-9 5·82。算出發酵液中長鏈二元酸含量。檢測結果發酵液中長鏈二元酸的濃度為6. 17g/L實例2:(1)發酵長鏈二元酸樣品的製備取IOOmL發酵液加lmol/L氫氧化鈉調節pH至9. 5、60°C下振蕩30min使長鏈二元酸充分溶於水相中。SOOOrpm離心IOmin使發酵液中固體、水相、發酵剩餘烷烴分離，取出 30mL水相部分，用6mol/LHCl調pH值至2.0，加入60mL乙醚進行抽提，分相後乙醚萃取液倒入燒杯中，再以60mL的乙醚重新萃取一次，合併萃取液，在通風櫥中吹去乙醚，得到長鏈二元酸提取物。(2)比色法快速分析長鏈二元酸含量將長鏈二元酸提取物加入到5mL硫酸銅-甲醇反應監測溶液中，常溫120rpm振蕩反應10-60min，5000rpm離心lOmin，取上清液於820nm波長處測定吸光值。根據公式
權利要求
1.一種硫酸銅快速定量分析發酵液提取物中長鏈二元酸含量的方法，包括發酵產長鏈二元酸樣品的製備，比色法快速分析長鏈二元酸含量；其特徵在於利用長鏈二元酸與硫酸銅-甲醇溶液反應，沉澱溶液中銅離子，固液分離後使用比色法檢測上清液吸光值，長鏈二元酸含量與吸光值成反比關係，根據由標準長鏈二元酸繪製的標準曲線計算發酵液提取物中長鏈二元酸含量。
2.如權利要求1所述的方法，其特徵在於使用十二烷二酸作為長鏈二元酸標準，十二烷二酸在硫酸銅-甲醇反應溶液的濃度範圍為0-40mg/mL。
3.如權利要求1所述的方法，其特徵在於硫酸銅-甲醇反應溶液濃度為5-50g/L。
4.如權利要求1所述的方法，其特徵在於分析測量波長為600-850nm。
全文摘要
本發明提供了一種硫酸銅快速定量分析發酵液提取物中長鏈二元酸含量的方法。發酵液中長鏈二元酸經提取後，加入硫酸銅-甲醇溶液並充分反應，固液分離後利用比色法檢測上清液吸光值，根據長鏈二元酸含量與吸光值成反比關係計算出發酵液提取物中長鏈二元酸含量。本發明操作簡單，精確度高，成本低，是一種很好的長鏈二元酸檢測分析方法。
文檔編號G01N21/78GK102183514SQ201110028098
公開日2011年9月14日 申請日期2011年1月26日 優先權日2011年1月26日
發明者餘運玲, 林日輝 申請人:廣西民族大學