用於在酵母細胞表面上展示多肽的方法和組合物的製作方法

2023-05-23 17:34:11 1

專利名稱：用於在酵母細胞表面上展示多肽的方法和組合物的製作方法
技術領域：
本文中提供了用於在酵母的細胞表面上展示多肽(例如，抗體多肽或抗體多肽片段)的方法和組合物。可以與本文中公開的各種方法和組合物聯合使用的例示性酵母包括耶氏酵母屬(Yarrowia)的那些酵母,例如,解脂耶氏酵母(Yarrowia Iipolytica)。
背景技術：
高親和力試劑，例如抗體或其片段對於臨床和研究應用兩者都是有用的工具。許多體外和體內平臺已經用於分離和表徵抗體，包括核糖體展示、噬菌體展示、和大腸桿菌(E. coli)中的周質表達。已經使用的另一種平臺是是酵母細胞表面展示(YSD)。用於在耶氏酵母屬菌株的細胞表面上展示抗體及其片段的組合物和方法會是有 利的。發明概述本文中提供了用於在酵母細胞的表面上展示多肽(例如，抗體多肽或抗體多肽片段)的方法和組合物。可以與本文中公開的各種方法和組合物聯合使用的例示性酵母包括耶氏酵母屬的那些酵母，例如，解脂耶氏酵母。在某些實施方案中，本文中提供的組合物包含表達盒，所述表達盒包含與融合序列可操作連接的啟動子，所述融合序列包含與第二核酸序列以符合讀碼框的方式融合的第一核酸序列，所述第一核酸序列包含編碼錨多肽的核苷酸序列，所述第二核酸序列包含編碼抗體多肽或抗體多肽片段的核苷酸序列。在某些實施方案中，本文中提供的組合物包含表達盒，所述表達盒包含與第一核酸序列可操作連接的啟動子，所述第一核酸序列包含編碼錨多肽的錨核苷酸序列，其中所述第一核酸序列可以在融合多肽中作為第一融合配偶體表達，所述融合多肽包含由第二核酸序列編碼的感興趣的第二融合配偶體。在某些實施方案中，表達盒進一步包含編碼所述感興趣的第二融合配偶體的第二核酸序列，例如，整個或部分的限制性位點。在某些實施方案中，所述感興趣的第二融合配偶體包含抗體多肽或抗體多肽片段。在某些實施方案中，抗體多肽片段是scFv片段、Fab片段的重鏈、或Fab片段的輕鏈。在某些實施方案中，在第二核酸序列3』融合表達盒的第一核酸序列，使得自所述融合序列生成的融合多肽包含N端抗體多肽或抗體多肽片段和C端錨多肽。在某些實施方案中，在第二核酸序列5』融合表達盒的第一核酸序列，使得自所述融合序列生成的融合多肽包含N端錨多肽和C端抗體多肽或抗體多肽片段。在某些實施方案中，表達盒包含組成性啟動子。在某些實施方案中，表達盒包含誘導型啟動子，例如，P0X2或LIP2啟動子。在某些實施方案中，表達盒包含半誘導型啟動子，例如ph4d啟動子。在某些實施方案中，表達盒包含前導核酸序列，所述的前導核酸序列包含編碼前導多肽的核苷酸序列，其中在所述第一和第二核酸序列的5』以符合讀碼框的方式融合所述前導核酸序列。例示性的前導核酸序列包括但不限於前LIP2 (LIP2 pre)、前原LIP2 (LIP2prepro)、前 XPR2 (XPR2 pre)、和前原 XPR2 (XPR2 prepro)。
在某些實施方案中，表達盒包含接頭核酸序列，所述接頭核酸序列包含編碼接頭多肽的核苷酸序列。例如，所述接頭核酸序列可以在所述第一和第二核酸序列間以符合讀碼框的方式融合。在某些實施方案中，所述抗體多肽包含SCFv抗體多肽，且所述接頭核酸序列在編碼所述scFv多肽的可變區的重鏈核酸序列和編碼可變區的輕鏈核酸序列間以符合讀碼框的方式融合。接頭多肽的非限制性例子包括(Gly4Ser)3* (GlySer)5。在某些實施方案中，表達盒包含一種或多種核酸序列，所述一種或多種核酸序列包含編碼一種或多種表位標籤的核苷酸序列。例不性的表位標籤包括但不限於c_Myc、V5、六組氨酸、穀胱甘肽-S-轉移酶、鏈黴親合素、生物素、血凝素、Flag標籤、和E標籤。在某些實施方案中，表達盒包含錨多肽。錨多肽的非限制性例子包括Agalp多肽或其片段、Aga2p多肽或其片段、和Saglp多肽或其片段。在某些實施方案中，表達盒包含抗體多肽或抗體多肽片段、錨多肽、或這兩者，其經密碼子優化以在耶氏酵母屬細胞中表達。
在某些實施方案中，本文中提供的組合物包含一種載體，其包含上文描述的任何表達盒。在某些實施方案中，載體包含捷塔(zeta，元件。例示性的捷塔元件包括但不限於反轉錄轉座子的長末端重複，諸如例如Yltl或Tyl6反轉錄轉座子。在某些實施方案中，載體包含一種或多種常染色體複製元件，例如，包含著絲粒(CEN)和複製起點(ORI)的常染色體複製元件。例示性的著絲粒包括但不限於CENl和CEN3。例示性的複製起點包括但不限於0RI1068或0RI3018。在某些實施方案中，載體包括自主複製序列(ARS)，其包含著絲粒和複製起點。例示性的ARS包括但不限於ARS18和ARS68。在某些實施方案中，載體包含一種或多種核酸序列，所述一種或多種核酸序列包含編碼一種或多種選擇標誌的核苷酸序列。選擇標誌的非限制性例子包括LEU2、URA3dl、ADE2、Lys、Arg、Gut、Trp, G3p、和
hpho在某些實施方案中，本文中提供的方法包括用於在耶氏酵母屬細胞的表面上展示抗體多肽或抗體多肽片段的方法。例如，可以如下在耶氏酵母屬細胞的表面上展示抗體多肽或抗體多肽片段，即將第一載體導入第一耶氏酵母屬細胞中，所述第一載體包含與融合序列可操作連接的啟動子，所述融合序列包含與第二核酸序列以符合讀碼框的方式融合的第一核酸序列，所述第一核酸序列包含編碼抗體多肽或抗體多肽片段的核苷酸序列，所述第二核酸序列包含編碼錨多肽的核苷酸序列，並將所述第一耶氏酵母屬細胞在耶氏酵母屬細胞操作條件下溫育一段時間。例示性的第一載體包括但不限於上文描述的任何載體。在某些實施方案中，抗體多肽片段是scFv片段、Fab片段的重鏈、或Fab片段的輕鏈。在某些實施方案中，方法可以包括將第二載體導入所述第一耶氏酵母屬細胞中，所述第二載體包含與編碼Fab片段輕鏈或Fab片段重鏈的核酸序列可操作連接的第二啟動子。在某些實施方案中，第一耶氏酵母屬細胞是單倍體，且導入所述第二載體的步驟包括將包含第一載體的第一單倍體耶氏酵母屬細胞與包含第二載體的第二單倍體耶氏酵母屬細胞交配，所述第一和第二耶氏酵母屬細胞是相反交配型的。在某些實施方案中，在第二核酸序列5』融合第一核酸序列，使得由所述融合序列生成的融合多肽包含N端抗體多肽或其抗體多肽片段和C端錨多肽。在某些實施方案中，在第二核酸序列3』融合第一核酸序列，使得由所述融合序列生成的融合多肽包含N端錨多肽和C端抗體多肽或抗體多肽片段。
在某些實施方案中，耶氏酵母屬細胞操作條件包含低誘導溫度，例如，約15攝氏度和25攝氏度間的溫度。非限制性的低誘導溫度包括約20攝氏度的溫度。在某些實施方案中，耶氏酵母屬細胞操作條件包括短誘導時間，例如，約24小時或更少、約16小時或更少、或約16小時。在某些實施方案中，耶氏酵母屬細胞操作條件包括低pH，例如，約2和約4間的pH，或約3的pH。在某些實施方案中，耶氏酵母屬細胞操作條件包括高通氣條件，例如，在搖瓶中溫育。在某些實施方案中，耶氏酵母屬細胞操作條件包括在極限培養基，例如，缺乏酵母提取物、細菌用蛋白腖、或這兩者的培養基中溫育。在某些實施方案中，將第一載體整合入耶氏酵母屬基因組中。在某些實施方案中，耶氏酵母屬細胞表達蛋白伴侶，例如，蛋白質二硫鍵異構酶，和/或Kar2/Bip。在某些實施方案中，本文中提供的組合物包含通過上文描述的任何方法獲得的抗體多肽或抗體多肽片段。在某些實施方案中，提供了選擇包含結合靶多肽的抗體多肽或抗體多肽片段的耶 氏酵母屬細胞的方法。例如，可以如下選擇包含結合靶多肽的抗體多肽或抗體多肽片段的耶氏酵母屬細胞，即提供在其表面上展示抗體多肽或抗體多肽片段的親本耶氏酵母屬細胞(例如，通過上文描述的任何方法生成的耶氏酵母屬細胞)，使所述親本耶氏酵母屬細胞與測試多肽接觸，並且如果所述展示的抗體多肽或抗體多肽片段結合所述靶多肽，那麼選擇所述親本耶氏酵母屬細胞。在某些實施方案中，此類方法包括自所述選定的親本耶氏酵母屬細胞分離所述抗體多肽或抗體多肽片段的第一表達盒，在編碼所述抗體多肽或抗體多肽片段的核苷酸序列中引入一處或多處變化以生成經修飾的表達盒，將所述經修飾的表達盒導入缺乏所述第一表達盒的第二耶氏酵母屬細胞中以生成經修飾的耶氏酵母屬細胞，將所述經修飾的耶氏酵母屬細胞在耶氏酵母屬細胞操作條件下溫育一段時間，將所述經修飾的耶氏酵母屬細胞與所述靶多肽接觸，並且如果所述經修飾的耶氏酵母屬細胞以比所述親本耶氏酵母屬細胞更大的親和力或親合力結合所述靶多肽，那麼選擇所述經修飾的耶氏酵母屬細胞。在某些實施方案中，本文中提供了試劑盒。在某些實施方案中，本文中提供的試劑盒包含表達盒，諸如上文描述的任何表達盒。在某些實施方案中，本文中提供的試劑盒包含載體，諸如上文描述的任何載體。在某些實施方案中，本文中提供的試劑盒包含耶氏酵母屬細胞。在某些實施方案中，本文中提供的試劑盒包含關於使用表達盒、載體、或這兩者的書面用法說明書。除非另有定義，本文中所使用的所有技術和科學術語與本發明所屬領域普通技術人員的通常理解具有相同的意義。本文中描述了用於本發明的方法和材料；也可以使用本領域中已知的其它合適的方法和材料。材料、方法和例子僅是例示性的，而並不意圖為限制性的。通過提及而完整收錄本文中提及的所有出版物、專利申請、專利、序列、資料庫條目、和其它參考文獻。在矛盾的情況中，應以本說明書，包括定義為準。從以下發明詳述和附圖，及從權利要求書看，本發明的其它特徵和優點會是顯而易見的。附圖簡述圖I是用於scFv和Fab片段的解脂耶氏酵母展不的表達質粒和表達盒的圖不。圖IA顯示用於隨機整合的耶氏酵母屬表達質粒的構件和圖。靶基因的表達由誘導型pP0X2啟動子驅動。不同轉化標誌物可用於容許創建完全互補的菌株(Leu2，Ade2，Ura3)。使用此質粒作為模板來克隆不同抗體片段。圖IB顯示用於AGA1、scFv片段和Fab片段輕鏈ckl域的可溶性表達的表達盒。使用顯示的限制性位點將合成的盒克隆入耶氏酵母屬表達質粒中。可以將輕鏈可變域分開克隆入所得的質粒中，創建含有輕鏈可變區(VL)和輕鏈恆定區的全長Fab輕鏈片段(VL-Ckl)的展示質粒。圖IC顯示使用顯示的限制性位點克隆入耶氏酵母屬表達質粒中的scFv抗體片段。生成總共4種合成構建體，其容許以不同融合模式並使用不同錨定分子錨定。圖ID顯示使用顯示的限制性位點克隆入耶氏酵母屬表達質粒中的Fab CHl抗體片段(含有重鏈恆定區CHl域的Fab片段)。生成總共4種合成構建體，其容許以不同融合模式並使用不同錨定分子錨定。可以將重鏈可變域分開克隆入所得的質粒中，創建由VH和重鏈恆定區CHl域構成的全長Fab重鏈(VH-CHl)的展示質粒。圖IE顯示就像它們會在解脂耶氏酵母細胞表面上表達那樣自scFv和Fab片段之每種及其合適的錨 多肽表達的各種多肽的共轉化策略和圖示。圖2是一系列一維螢光流式細胞術(FFC)直方圖，其描繪了對於FALCON和搖瓶(SF)培養物(86%)兩者在極限補充培養基(MM)和豐富培養基(RM)中於20° C誘導20小時的解脂耶氏酵母細胞中加有C-Myc標籤的scFv表達。還將細胞在麗中於28° C在搖瓶中培養。頂部小圖顯示加有C-Myc標籤的scFv片段的FFC直方圖，而底部小圖顯示表達完全大小單克隆赫賽汀抗體的菌株1T2的FFC直方圖。檢測螢光，如下文實施例I中所描述的。加陰影的直方圖顯示自身螢光(陰性對照)，而實線代表c-myc表達。圖3是一系列一維FFC直方圖，其描繪了誘導不同時間量的解脂耶氏酵母細胞中加有c-Myc標籤的scFv表達。直方圖描繪了誘導時間對加有c_Myc標籤的scFv在解脂耶氏酵母細胞中表面展示水平的影響。將細胞培養16、20、24、32和43小時。表達c_Myc的細胞的相對比例隨誘導時間延長而降低(24小時後的54%、32小時後的19%、和43小時後的7%)。檢測螢光，如實施例I中所描述的。加陰影的直方圖顯示自身螢光(陰性對照)，而實線代表c-myc表達。圖4是一系列一維FFC直方圖，其描繪了 pH對加有c-Myc標籤的scFv在解脂耶氏酵母細胞中表面展示水平的影響。將細胞於pH 6.8, pH 5和pH3培養24小時(頂部小圖)和32小時(底部小圖)。左側小圖顯示不在其表面上表達scFv的細胞的背景螢光。右側小圖顯示在其表面上表達scFv的細胞的螢光。檢測螢光，如實施例I中所描述的。圖5是一系列一維FFC直方圖,其描繪了兩種不同加有c-Myc標籤的scFv片段的表面表達4-4-20scFv (在「4-4-20scFv」標記下的圖)和赫賽汀scFv (在「赫賽汀scFv」標記下的圖)。創建總共4種展示質粒,其容許以與釀酒酵母(S. cerevisiae) Saglp的C端部分(320個C端AA ;標記為「Al」的行中的直方圖)的N端融合物、與釀酒酵母Aga2p的N端融合物(標記為「A2」的行中的直方圖)、與解脂耶氏酵母CwpIp的C端部分(110個C端AA)的N端融合物(標記為「A3」的行中的直方圖)和與Aga2p的C端融合物(標記為「A4」的行中的直方圖)展示scFv片段。scFv片段能夠結合抗原(標記為「配體結合」的欄中的小圖)。對於配體結合檢測，用鏈黴親合素-藻紅蛋白檢測生物素化的抗原。檢測螢光，如實施例I中所描述的。對於每幅圖，加陰影的直方圖代表自身螢光(陰性對照)。實線代表c-myc表達或配體結合，如每欄上方標示的。圖6是表達加有c-Myc標籤的4-4_20scFV融合蛋白(圖6A)或加有c_Myc標籤的4-4-20重和輕鏈融合蛋白(圖6B)的細胞的一系列免疫螢光顯微圖。通過用抗c-Myc抗體染色檢測表達。圖7是一系列一維FFC直方圖,其描繪了兩種不同加有c-Myc標籤的Fab片段的表面表達4-4-20Fab (在「4_4_20Fab」題目下的直方圖)和赫賽汀Fab (在「赫賽汀Fab」題目下的直方圖)。創建總共4種展示質粒，其容許以與釀酒酵母Saglp的C端部分(320個C端AA)的N端融合物(標記為「Al」的行中的直方圖)、與釀酒酵母Aga2p的N端融合物(標記為「A2」的行中的直方圖)、與解脂耶氏酵母CwpIp的C端部分(110個C端AA)的N端融合物(標記為「A3」的行中的直方圖)和與Aga2p的C端融合物(標記為「A4」的行中的直方圖)展示Fab重鏈片段。Fab輕鏈以可溶性片段表達。檢測重鏈(HC)和輕鏈(LC)表達。對於配體結合檢測，用鏈黴親合素-藻紅蛋白檢測生物素化的抗原。檢測螢光，如實施例I中所描述的。對於每幅圖，加陰影的直方圖代表自身螢光(陰性對照)。實線代表c-myc表達(指示錨定的重鏈片段表達)、V5表達(指示輕鍊表達)或配體結合，如每欄上方標示的。圖8是一系列一維FFC直方圖，其描繪了赫賽汀Fab的表面表達。重鏈是與釀酒酵母Aga2p的N端融合物。可溶性表達輕鏈。個別檢測重鏈(HC)和輕鏈(LC)(分別標·記為「HC」和「LC」的行中的直方圖)。使用二色FACS分析的HC和LC的同時標記(標記為「HC+LC」的行中的直方圖)表明這兩條鏈在各個酵母細胞表面上配對。檢測螢光，如實施例I中所描述的。加陰影的直方圖代表自身螢光(陰性對照)，而實線代表HC或LC表達，如標示的。圖9是一對柱形圖，其描繪了蛋白伴侶對Her-scFv和Her-Fab表達的影響。WT=野生型。TEF PD=在TEF啟動子控制下表達的I3DI (蛋白質二硫鍵異構酶)。P0X2HACI=在P0X2啟動子控制下表達的HACI，即一種誘導UPR (解摺疊蛋白質應答)的轉錄因子。

圖10是一系列線圖，其描繪了展示的赫賽汀scFv的劑量響應曲線。顯示了三次獨立滴定。前Al-赫賽汀scFv=以與釀酒酵母Saglp的C端320個胺基酸的N端融合物融合併在前Lip2前導序列的情況中表達的赫賽汀scFv。前原Al-赫賽汀scFv=以與釀酒酵母Saglp的C端320個胺基酸的N端融合物融合併在前原Lip2前導序列的情況中表達的赫賽汀scFv。前A2-赫賽汀scFv=以與釀酒酵母Aga2p的N端融合物融合併在前Lip2前導序列的情況中表達的赫賽汀scFv。「 [Ag] 」 =HER2-Fc嵌合蛋白(抗原)濃度。Y軸顯示結合的分數，其以MFI/(MFI最大-MFI最小)計算，標準化，並以百分比表示。對每個滴定曲線顯示計算的kD。圖11是一對線圖，其描繪了展示的scFv Dl. 3和突變體M3(它們各自識別雞蛋溶菌酶01EL))的劑量響應曲線。M3比Dl. 3具有高2倍的針對雞蛋溶菌酶的親和力。展示的多肽以Saglp (標記為「前A1D1. 3對M3」的線圖)和Aga2p (標記為「前A2D1. 3對M3」的線圖)融合多肽表達。將Dl. 3或M3展示細胞與不同濃度的生物素化的雞蛋溶菌酶一起溫育(X軸顯示以nM計的濃度)。對每個滴定曲線顯示計算的kD。圖12是用於轉化解脂耶氏酵母的複製型載體的示意圖。將複製型載體構建為含有由pP0X2啟動子驅動的scFv-AGA2表達盒和用於複製性增殖的ARS18。圖13是一對直方圖，其描繪了 scFv-AGA2在用基於捷塔的整合型質粒(圖13A)或複製型質粒(圖13B)轉化的解脂耶氏酵母細胞中的細胞表面表達。關於複製型質粒的數據代表10個克隆的平均值。將用複製型載體轉化的細胞在非選擇性和選擇性條件下培養。X軸(標記為「FL2-H」)顯示c-myc螢光信號，其使用經藻紅蛋白綴合的二抗在通道2中記錄。Y軸(標記為「計數」)顯示細胞數目。圖14是一系列一維FFC直方圖,其描繪單一加c-Myc標籤的全長曲妥單抗(赫賽汀)IgG的表面表達。創建總共2種展示質粒，其容許以與釀酒酵母Aga2p的N端融合物(標記為「A2」的行中的直方圖)和與Aga2p的C端融合物(標記為「A4」的行中的直方圖)展示IgG重鏈。IgG輕鏈以可溶性片段表達。檢測重鏈(HC)和輕鏈(LC)表達。檢測螢光，如實施例I中所描述的。圖14A是顯示c-myc和V5表達的點圖。清楚地，對於與AGA2的N和C端融合物兩者，所有細胞同時顯示全長重鏈和輕鏈的表達。未標記的細胞沒有顯示錶位標籤的檢出。圖14B加陰影的直方圖對這兩種融合物顯示c-myc和V5表達。與對赫賽汀Fab展示觀察到的事情類似，與N端融合物相比，可以對將重鏈在AGA2錨的C端融合的細胞觀察到展示效率的顯著改善(如通過虛線標示的)。圖14C顯示表達的HC和LC的圖示。圖15是一副線圖，其描繪了來自scFv親和力成熟篩選的兩種分離的克隆(克隆13和克隆38)的劑量響應曲線。自平衡滴定曲線測定Kd，並與野生型Dl. 3Kd比較。對於克隆 13和克隆38，Kd值分別測定為2. 2和I. 8nM。與野生型Kd (4. OnM)相比，這分別代表I. 8和2. 4倍改善，其與M3突變體位於相同範圍中。發明詳述本文中提供了用於在酵母細胞的表面上展示多肽(例如，抗體多肽或抗體多肽片段)的方法和組合物。可以與本文中公開的各種方法和組合物聯合使用的例示性酵母包括耶氏酵母屬的那些酵母，例如，解脂耶氏酵母(Yl)。抗體多肽和抗體多肽片段依照本文中描述的方法和組合物，可以在酵母細胞表面上表達多種抗體多肽或其片段之任一種。「抗體多肽」在該術語在本文中使用時指作為或源自免疫球蛋白重鏈和/或免疫球蛋白輕鏈多肽的多肽。如本領域中已知的，野生型IgG抗體一般包含兩條相同的重鏈多肽和兩條相同的輕鏈多肽。給定的抗體包括五類重鏈(稱作a、S、e、Y和iO之一，其分類基於重鏈恆定區的胺基酸序列。在人類中，存在有a恆定區的兩種亞類和Y恆定區的四種亞類。這些不同類的重鏈分別產生五類抗體，即IgA (包括IgAl和IgA2亞類)、IgD、IgE、IgG (包括IgGl、IgG2、IgG3和IgG4亞類)和IgM。給定的抗體還包含兩類輕鏈(稱作K或、)之一，其分類基於輕鏈恆定域的胺基酸序列。在某些實施方案中，本文中公開的方法提供了在酵母，例如耶氏酵母屬菌株諸如解脂耶氏酵母的細胞表面上表達抗體多肽。在某些實施方案中，在酵母中表達全長重鏈、全長輕鏈、或這兩者。在某些實施方案中，在酵母中表達全長重鏈、全長輕鏈、或這兩者的片段。「抗體片段」或「抗體多肽片段」在該術語在本文中使用時指不包括如上文所定義的全長抗體多肽，但是仍至少包含全長抗體多肽的一部分的自抗體多肽分子衍生的多肽。抗體多肽片段經常包含如下的多肽，其包含全長抗體多肽的切割部分，儘管該術語不限於此類經切割的片段。因為抗體多肽片段在該術語在本文中使用時涵蓋包含自抗體多肽(例如重或輕鏈抗體多肽)衍生的單一多肽鏈的片段，所以應當理解抗體多肽片段獨自可以不結合抗原。例如，抗體多肽片段可以包含重鏈抗體多肽中會包含在Fab片段中的那部分；此類抗體多肽片段通常不會結合抗原，除非它與自輕鏈抗體多肽衍生的另一抗體多肽片段(例如，輕鏈抗體多肽中會包含在Fab片段中的那部分)聯合，使得抗原結合位點得到重建。抗體多肽片段可以包括例如如下的多肽，其會包含在Fab片段、F(ab』)2片段、scFv (單鏈Fv)片段、Fv片段、雙抗體、線性抗體、多特異性抗體片段諸如雙特異性、三特異性、和多特異性抗體(例如,雙抗體、三抗體、四抗體)、微型抗體、螯合重組抗體、三體(tribody)或二體(bibody)、胞內抗體、納米抗體、小模塊免疫藥物(SMIP)、結合域免疫球蛋白融合蛋白、駱駝源化(camelize)抗體、和含有Vhh的抗體中。應當領會，「抗體片段」或「抗體多肽片段」包括「抗原結合抗體片段」和「抗原結合抗體多肽片段」。見例如美國專利號7，422，890、7，422，742、和7，390, 884，通過提及而將每篇完整收入本文。「人源化抗體多肽」在該術語在本文中使用時指已經工程化改造為包含其可變區中的一個或多個人可變區(輕和/或重鏈)框架區以及重和/或輕鏈多肽的非人(例如，小鼠、大鼠、或倉鼠)互補決定區(CDR)和人重和/或輕鏈恆定區的抗體多肽。在某些實施方案中，人源化抗體包含除了 CDR區外的完全人的序列。相對於非人源化抗體，人源化抗體對人通常不太有免疫原性，並且如此在治療應用中提供某些益處。本領域普通技術人員 會知道人源化抗體，而且還會知道適合於生成人源化抗體多肽的技術。見例如美國專利號7，442，772,7, 431，927,6, 872，392、和5，585，089，通過提及而將每篇完整收入本文。「嵌合抗體多肽」在該術語在本文中使用時指已經工程化改造為包含至少一個人恆定區的抗體多肽。重和或輕鏈可以具有人恆定區。相對於非嵌合抗體，嵌合抗體對人通常不太有免疫原性，並且如此在治療應用中提供某些益處。本領域普通技術人員會知道嵌合抗體，而且還會知道適合於生成嵌合抗體多肽的技術。見例如美國專利號7，442，772、7，431，927,6, 872，392、和5，585，089，通過提及而將每篇完整收入本文。在某些實施方案中，表達的抗體多肽或抗體多肽片段是人抗體多肽或片段。在某些實施方案中，表達的抗體多肽或其片段是非人抗體多肽或其片段，例如，小鼠或大鼠抗體多肽或其片段。在某些實施方案中，表達的抗體多肽或其片段是嵌合的，即它含有人重和/或輕鏈恆定區。在某些實施方案中，表達的抗體多肽或其片段是人源化的，即它含有可變區中的一個或多個人框架區以及重和/或輕鏈的非人(例如，小鼠、大鼠或倉鼠)互補決定區(CDR)。在某些實施方案中，要在酵母細胞的表面上表達的抗體多肽包含抗體的重鏈多肽。在某些實施方案中，在酵母細胞的表面上表達重鏈多肽的片段，例如，重鏈多肽中會包含在Fab片段(例如，VH-CHl)、Fv片段、或scFv片段中的那部分。在某些實施方案中，要在酵母細胞的表面上表達的抗體多肽包含整個或部分的重鏈恆定區，例如，Fe區、鉸鏈區，等等。在某些實施方案中，要在酵母細胞的表面上表達的抗體多肽缺乏重鏈恆定區。在某些實施方案中，要在酵母細胞的表面上表達的抗體多肽缺乏重鏈恆定區的一部分，例如，Fe區。在某些實施方案中，要在酵母細胞的表面上表達的抗體多肽包含抗體的輕鏈多肽。在某些實施方案中，在酵母細胞的表面上表達輕鏈多肽的片段，例如，Fv片段、或scFv片段。在某些實施方案中，要在酵母細胞的表面上表達的抗體多肽包含輕鏈恆定區。在某些實施方案中，要在酵母細胞的表面上表達的抗體多肽缺乏輕鏈恆定區。在某些實施方案中，抗體多肽片段是包含如下的胺基酸鏈的多肽，其作為Fab片段、F(ab』)2片段、Fv片段、雙抗體、線性抗體、多特異性抗體片段諸如雙特異性、三特異性、或多特異性抗體(例如，雙抗體、三抗體、四抗體)、微型抗體、螯合重組抗體、三體或二體、胞內抗體、納米抗體、小模塊免疫藥物(SMIP)、結合域免疫球蛋白融合蛋白、駱駝源化抗體、或含有Vhh的抗體的一部分。在某些實施方案中，抗體多肽片段是scFv片段。在某些實施方案中，在酵母細胞的表面上表達重鏈抗體多肽或抗體多肽片段和輕鏈抗體多肽或抗體多肽片段兩者。例如，可以在本文中描述的任何酵母(例如，解脂耶氏酵母)中表達完全重鏈抗體多肽和完全輕鏈抗體多肽。作為另一個例子，可以與輕鏈抗體多肽中包含在Fab片段、Fv片段、或scFv片段中的那部分一起在酵母中表達重鏈抗體多肽中包含在Fab片段、Fv片段、或scFv片段中的那部分。如本領域普通技術人員會理解的，在酵母細胞表面上表達重鏈抗體多肽和輕鏈抗體多肽(或其抗體多肽片段)時，此類抗體多肽或片段可以彼此聯合以重建功能性抗原結合分子。在某些實施方案中，在第一交配型的第一單倍體酵母細胞表面上表達重鏈抗體多肽或抗體多肽片段，在第二交配型的第二單倍體酵母細胞表面上表達輕鏈抗體多肽或抗體多肽片段，並將第一和第二單倍體酵母細胞交配以生成二倍體酵母細胞。相反地，在第一交配型的第一單倍體酵母細胞表面上表達輕鏈抗體多肽或其片段，在第二交配型的第二單倍 體酵母細胞表面上表達重鏈抗體多肽或其片段，並將第一和第二單倍體酵母細胞交配以生成二倍體酵母細胞。由於此類交配生成的此類二倍體酵母細胞會表達重鏈抗體多肽和輕鏈抗體多肽(或其抗體多肽片段)。酵母交配型是本領域中已知的。例如，在單倍體形式中，釀酒酵母(S. cerevisiae)以兩種交配型之一存在MATA和MATB。此外,可以將MATA交配型解脂耶氏酵母細胞工程化改造成MATB交配型。單倍體MATA和MATB酵母細胞可以彼此交配以形成二倍體酵母細胞。本領域普通技術人員會知道可以交配的酵母物種，而且還會知道合適的交配型。在某些實施方案中，可以如下生成表達抗體多肽或抗體多肽片段的單倍體酵母細胞，即用包含編碼抗體多肽或抗體多肽片段的核酸序列的載體或表達盒(見題目為「表達盒和載體」的部分)轉化單倍體酵母細胞。或者，可以如下生成表達抗體多肽或其片段的單倍體酵母細胞，即用包含編碼抗體多肽或其片段的核酸序列的載體轉化二倍體酵母細胞，並使經轉化的二倍體酵母細胞形成孢子以生成單倍體酵母細胞。在某些實施方案中，通過用兩種載體或表達盒(包含編碼重鏈抗體多肽或抗體多肽片段的核酸序列的第一載體或表達盒和包含編碼輕鏈抗體多肽或抗體多肽片段的核酸序列的第二載體或表達盒)轉化單倍體酵母細胞而在酵母細胞表面上表達重鏈抗體多肽或抗體多肽片段和輕鏈抗體多肽或抗體多肽片段兩者。在某些實施方案中，通過用單一載體轉化單倍體酵母細胞而在酵母細胞表面上表達重鏈抗體多肽或抗體多肽片段和輕鏈抗體多肽或抗體多肽片段兩者，所述載體包含表達盒，該表達盒包含編碼重鏈抗體多肽或抗體多肽片段和輕鏈抗體多肽或抗體多肽片段的核酸序列。此類酵母細胞可以是單倍體或二倍體。在某些實施方案中，要在酵母細胞表面上表達的重鏈抗體多肽或抗體多肽片段和/或輕鏈抗體多肽或抗體多肽片段是包含錨多肽(見下文題目為「錨多肽」的部分)的融合多肽。雖然經由其重鏈抗體多肽或片段來錨定抗體多肽或片段是典型的，但是經由輕鏈抗體多肽或片段進行錨定也是有可能的。見例如Lin等，App. Microbiol Biotechol, 2003年8月；62 (2-3) : 226-32，通過提及而將其完整收入本文。在某些實施方案中，僅將抗體多肽或其片段的重鏈與錨多肽融合。在某些實施方案中，僅將抗體多肽或其片段的輕鏈與錨多肽融合。在某些實施方案中，將抗體多肽或其片段的重鏈和抗體多肽或其片段的輕鏈兩者與錨多肽融合。在某些實施方案中，在融合多肽的氨基端融合錨多肽。在某些實施方案中，在融合多肽的羧基端融合錨多肽。在某些實施方案中，通過本文中公開的多種方法之任一種獲得抗體多肽或抗體多肽片段。此類抗體多肽或其片段可以作為細胞的一部分獲得。或者，抗體多肽或其片段可以在其表達後自細胞純化。可以使用用於純化多肽的標準技術。可以通過本領域普通技術人員已知的多種方法之任一種來檢測和篩選表達感興趣多肽的酵母細胞。例如，可以採用FACS (螢光激活細胞分選)。在FACS中，使酵母細胞與結合感興趣多肽(例如，本公開內容的抗體多肽或抗體多肽片段結合的抗原)的經標記試劑接觸。可以使用任何標記物，只要它是可檢測的。合適的標記物包括但不限於螢光模塊、化學發光模塊，等等。本領域普通技術人員會知道合適的標記物。在某些實施方案中，用間接標記物標記試劑，所述間接標記物可以通過結合與間接標記物結合的經可檢測標記的試劑(例如，螢光或化學發光模塊)來檢測。多種間接標記物是本領域中已知的，包括但不限於生物素(其可以被親合素或鏈黴親合素結合)、表位標籤(例如本文中描述的任何表 位標籤)，等等。可以使用對特定表位標籤特異性的經標記抗體或其片段來檢測表位標籤。或者，可以通過結合對特定表位標籤特異性的第一抗體或其片段，並用經標記的第二抗體或其片段檢測第一抗體或片段來檢測表位標籤。然後，將酵母細胞通過細胞分選儀，其分開細胞並且測定經標記藥劑是否與每個個別細胞聯合。展現螢光的那些細胞在其表面上表達感興趣多肽。或者，可以在用結合感興趣抗體多肽或片段的藥劑(例如抗原)包被的平板上「淘選」細胞。或者，可以將細胞結合至固體支持物(例如珠)，其與結合感興趣抗體多肽或片段的藥劑(例如抗原)連接。然後，可以分離固體支持物(例如，通過離心、若支持物是順磁性的，則磁性除去，等等)；結合固體支持物的任何細胞在其表面上表達感興趣多肽。本領域普通技術人員會知道適合於鑑定和分離在其表面上表達感興趣多肽的酵母細胞的其它方法。見例如 Yeung 和 ffittrup, Biotechnol. Prog. , Mar-Apr; 18 (2) : 212-20，2002 ；Ackerman 等，Biotechnol. Prog.，May-Jun;25(3) :774-83，2009 ；ffang 等，J. TmmunoI.Methods, Sep; 304 (1-2) : 30-42，2005 ;及 Chao 等，Nat. Protoc.，I ⑵:755-68，2006，通過提及而將每篇完整收入本文。本領域普通技術人員會知道可以依照本文中描述的方法和組合物在酵母(例如，解脂耶氏酵母)細胞表面上表達的其它抗體多肽和片段。錨多肽可以依照本文中描述的方法和組合物使用多種錨多肽之任一種在酵母細胞表面上表達多肽(例如，抗體多肽或抗體多肽片段)。「錨多肽」在該術語在本文中使用時指拴系至細胞表面，並且如此可以用於將其它多肽(例如，抗體多肽或抗體多肽片段)與拴系至細胞表面的多肽。例如，錨多肽可以是跨膜或細胞壁蛋白，諸如例如，糖基磷脂醯肌醇(GPI)細胞壁蛋白。多種錨多肽是本領域中已知的，並且可以依照本文中公開的組合物和方法用於在酵母表面上表達多肽。此類錨肽包括但不限於釀酒酵母Agal_Aga2 (交配型A凝集素基因)異二聚體、釀酒酵母a-凝集素(Saglp)、Pirlp、Pir2p、Pir4p、Flolp、耶氏酵母屬CWPI及其片段(見例如 Ueda 等,J. Biosci. Bioeng. 90:125-36，2000 ；Abe, H. , Shimma 等，Pi r. Glycobiology13, 87-95, 2003 ；Andres, I.，等，Biotechnol Bioeng 89, 690-7，2005 ；ffang, Q.，等，Curr.Microbiol. 56, 352-7，2008 ；Tanino, T.,等，Biotechnol. Prog. 22, 989-93，2006 ；Yue等，J. Microbiol. Methods. 2008年2月；72 (2) :116-23 ;通過提及而將每篇完整收入本文)。在某些實施方案中，使用錨多肽將感興趣多肽(例如，抗體多肽或抗體多肽片段)與酵母細胞表面，例如，解脂耶氏酵母細胞的表面拴系在一起。例如，可以將錨多肽與感興趣多肽融合，使得在細胞表面上表達錨多肽和感興趣多肽兩者。在某些實施方案中，可以通過用載體或表達盒(見題目為「表達盒和載體」的部分)轉化酵母細胞來生成表達感興趣多肽(例如，抗體多肽或抗體多肽片段)的酵母細胞，所述載體或表達盒包含與編碼錨多肽的第二核酸序列以符合讀碼框的方式融合的編碼感興趣多肽的第一核酸序列。在某些實施方案中，在第二核酸序列5』融合第一核酸序列，使得自融合序列生成的融合多肽包含N端感興趣多肽和C端錨多肽。在某些實施方案中，在第二核酸序列3』融合第一核酸序列，使得自融合序列生成的融合多肽包含N端錨多肽和C端感興趣多肽。在某些實施方案中，將第一核酸序列與第二核酸序列以符合讀碼框的方式直接 融合。在某些實施方案中，將第一核酸序列與接頭序列融合，將接頭序列與第二核酸序列融合。如題目為「表達盒和載體」的部分中更為詳細描述的，接頭序列通常編碼接頭多肽，諸如不限於GlySer接頭多肽,例如，(Gly4Ser) 3或(GlySer) 5。表達盒和載體在某些實施方案中，在酵母細胞表面上表達多肽(例如，抗體多肽或抗體多肽片段)通過用包含編碼所述多肽的核酸序列的表達盒轉化所述酵母來進行。如本文中使用的，術語「表達盒」指如下的核酸序列，其最低限度包含(I)編碼感興趣多肽的核苷酸序列，和
(2)驅動感興趣多肽表達的核苷酸序列(例如，啟動子)。在某些實施方案中，由表達盒的核苷酸序列編碼的感興趣多肽包含抗體多肽或抗體多肽片段。表達盒可以包含編碼本文中描述的任何抗體多肽或片段，例如自Fab片段、Fv片段、或scFv片段衍生的抗體多肽或片段的核苷酸序列。在某些實施方案中，感興趣多肽是Fab片段的重鏈。在某些實施方案中，感興趣多肽是Fab片段的輕鏈。在某些實施方案中，由表達盒的核苷酸序列編碼的感興趣多肽包含錨多肽。表達盒可以包含編碼本文中描述的任何錨多肽，例如釀酒酵母Agal_Aga2異二聚體、釀酒酵母a凝集素(Saglp)、Pirlp、Pir2p、Pir4p、Flolp、耶氏酵母屬CWPI及其片段的核苷酸序列。在某些實施方案中，由表達盒的核苷酸序列編碼的感興趣多肽包含與錨多肽以符合讀碼框的方式融合的抗體多肽或抗體多肽片段。例如，表達盒可以包含編碼抗體多肽或片段的第一核苷酸序列，所述第一核苷酸序列與編碼錨多肽的第二核苷酸序列以符合讀碼框的方式融合。在某些實施方案中，在編碼錨多肽的第二核苷酸序列5』以符合讀碼框的方式融合編碼抗體多肽或片段的第一核苷酸序列，使得在表達核苷酸序列時，抗體多肽或片段在錨多肽的N端。在某些實施方案中，在編碼錨多肽的第二核苷酸序列3』以符合讀碼框的方式融合編碼抗體多肽或片段的第一核苷酸序列，使得在表達核苷酸序列時，抗體多肽或片段在錨多肽的C端。在某些實施方案中，表達盒包含編碼抗體多肽或抗體多肽片段的核苷酸序列，其與編碼錨多肽的核苷酸序列以符合讀碼框的方式融合，使得沒有居間核苷酸殘基。在此類實施方案中，自表達盒表達的多肽會包含在無居間胺基酸殘基的情況中與錨多肽直接融合的抗體多肽或片段。在某些實施方案中，表達盒包含編碼抗體多肽或抗體多肽片段的核苷酸序列，其與編碼接頭多肽的接頭序列以符合讀碼框的方式融合，所述接頭序列與編碼錨多肽的核苷酸序列以符合讀碼框的方式融合，使得接頭序列在編碼抗體多肽或片段的第一核苷酸序列與編碼錨多肽的核苷酸序列間以符合讀碼框的方式融合。在此類實施方案中，自表達盒表達的多肽會包含抗體多肽或抗體多肽片段、接頭多肽、和錨多肽。在此段中描述的任何實施方案中，可以在編碼錨多肽的核苷酸序列5』或3』融合編碼抗體多肽或片段的核苷酸序列。可以依照目前描述的組合物和方法使用多種接頭多肽之任一種。接頭多肽充當融合多肽內包含的兩種感興趣多肽間的間隔物。有利地，接頭多肽不幹擾兩種感興趣多肽的功能，或僅以微小的程度幹擾。在某些實施方案中，接頭多肽容許兩種感興趣多肽有顯著的構象自由，使得兩種感興趣多肽相對於彼此能夠採取多種空間位置和取向。接頭多肽的非限制性例子是 GlySer 接頭多肽，例如，(Gly4Ser) 3 (SEQ ID NO: 14)或(GlySer) 5(SEQ IDNO: 15)。在某些實施方案中，接頭多肽可以位於抗體多肽或抗體多肽片段的兩部分間。例如，可以將編碼接頭多肽的接頭序列在I)編碼scFv片段的重鏈可變區的重鏈核酸序列和2)編碼scFv片段的輕鏈可變區的輕鏈核酸序列間以符合讀碼框的方式融合。在某些實施 方案中，感興趣多肽包含超過一個接頭序列。例如，融合多肽可以包含DscFv抗體多肽片段，其可以包含scFv片段的重和輕鏈可變區多肽間的第一接頭多肽、2)錨多肽、和3)scFv抗體多肽和錨多肽間的第二接頭多肽。本領域普通技術人員會知道其它合適的接頭多肽及其編碼核苷酸序列。在某些實施方案中，表達盒包含前導核酸序列，其包含編碼前導多肽的核苷酸序列。可以依照目前描述的組合物和方法使用多種前導多肽之任一種。前導多肽經由分泌裝置發揮功能以幫助驅動對多肽的加工，最終導致正確加工的表面展示的多肽。前導序列在加工期間自多肽切割，並且不是完全加工的多肽的一部分。如本領域普通技術人員會理解的，前導核酸序列通常會在編碼感興趣多肽的核苷酸序列5』以符合讀碼框的方式融合，使得前導多肽在表達的融合多肽的N端。前導多肽的非限制性例子包括前LIP2、前原LIP2、前 XPR2、和前原 XPR2。見例如 Pignede 等，J. Bacteriol. , May; 182 (10) :2802-10, 2000 ；Davidow 等,J. Bacteriol. , Oct; 169 (10) : 4621-9，1987 ;及 Madzak 等,J. Biotechnol. , 4 月8日；109(1-2) :63-81, 2004，通過提及而將每篇完整收入本文。本領域普通技術人員會知道其它合適的前導多肽及其編碼核苷酸序列。在某些實施方案中，表達盒包含表位核酸序列，其包含編碼表位標籤的核苷酸序列。可以依照目前描述的組合物和方法使用多種表位標籤之任一種。表位標籤通常是短的多肽序列，其便於表達多肽的檢測、測量、定量、和/或純化(或分離)。表位標籤可以位於給定多肽內的任何地方，例如，在N端、在C端、或在內部。表位標籤的非限制性例子包括C-Myc (髓細胞組織增生(myelocytomatosis)細胞癌基因)、V5 (自猿病毒5的P和V蛋白的C端序列衍生)、多組氨酸(例如，6-his，或六組氨酸)、穀胱甘肽-S-轉移酶、鏈黴親合素、生物素、血凝素、Flag標籤(FLAG八肽)、和E標籤[GAPVPYPDPLEPR，SEQ ID NO: 13]。本領域普通技術人員會知道其它合適的表位標籤及其編碼核苷酸序列。在某些實施方案中,表達盒包含啟動子。如本領域中已知的,啟動子是驅動下遊核苷酸序列轉錄成核糖核酸(RNA)的核苷酸序列，所述轉錄是經由多種轉錄因子之任一種介導的。在某些實施方案中，轉錄的RNA編碼感興趣多肽。在某些實施方案中，表達盒包含與融合序列可操作連接的啟動子，所述融合序列包含(I)第一核酸序列，其包含編碼抗體多肽或抗體多肽片段的核苷酸序列，其以符合讀碼框的方式融合(2)第二核酸序列，其包含如下的核酸序列，所述核酸序列包含編碼錨多肽的核苷酸序列。有利的啟動子是那些通常在感興趣的細胞中發揮功能的。例如，已知在酵母中，例如在耶氏酵母屬物種，諸如但不限於解脂耶氏酵母中發揮功能的許多啟動子。在某些實施方案中，使用在解脂耶氏酵母中發揮功能的啟動子來驅動編碼抗體多肽或抗體多肽片段的RNA表達。在某些實施方案中，使用在解脂耶氏酵母中發揮功能的啟動子來驅動編碼錨多肽的RNA表達。在某些實施方案中，使用在解脂耶氏酵母中發揮功能的啟動子來驅動編碼與錨多肽融合的抗體多肽或抗體多肽片段的RNA表達。可以依照目前描述的組合物和方法使用多種啟動子之任一種以在酵母細胞表面上表達感興趣多肽。在某些實施方案中，用於表達多肽(例如，抗體多肽或抗體多肽片段)的啟動子是組成性的。多種組成性啟動子是本領域中已知的，包括但不限於TEFl和甘油 醛-3-磷酸脫氫酶啟動子。在某些實施方案中，用於表達多肽(例如，抗體多肽或抗體多肽片段)的啟動子是誘導型的。在從業人員期望控制何時表達感興趣多肽時，誘導型啟動子是有用的。許多誘導型啟動子是本領域中已知的，包括但不限於P0X3和LIP2啟動子。在某些實施方案中，用於表達多肽(例如，抗體多肽或抗體多肽片段)的啟動子是半組成性的。「半組成性啟動子」在該術語在本文中使用時指不是完全組成性的，並且很大程度上或僅在某些條件下驅動某些基因表達的啟動子。例如，半組成性啟動子可以以生長階段依賴性方式驅動基因表達。許多半組成性啟動子是本領域中已知的，包括但不限於hp4d啟動子。本領域普通技術人員會知道在感興趣的細胞中，例如在耶氏酵母屬物種，諸如但不限於解脂耶氏酵母中發揮功能的合適的組成性、誘導型和半組成性啟動子。在某些實施方案中，在酵母細胞表面上表達多肽(例如，抗體多肽或抗體多肽片段)通過用包含表達盒，例如本文中描述的任何表達盒的載體轉化所述酵母來進行。「載體」如該術語在本文中使用時指包含表達盒，而且進一步包含一種或多種別的元件的核酸。在某些實施方案中，載體包含便於載體在選擇條件下複製、同源或非同源整合、和/或維持的元件。可以依照目前描述的組合物和方法使用多種載體之任一種來在酵母細胞表面上表達感興趣多肽。可以使用的載體的非限制性例子包括那些在美國專利公開文本No. 2008-0171359中披露的，通過提及而將其完整收入本文。本領域普通技術人員會知道用於給定的感興趣細胞(例如，酵母細胞)的其它合適的載體。此外，可以修飾多種載體之任一種以用於在酵母細胞表面上表達感興趣多肽。例如，商品化或其它載體可以適合於用於給定的酵母物種，但是此類載體可以不包含如下的表達盒，所述表達盒包含與融合序列可操作連接的啟動子，所述融合序列包含(I)第一核酸序列，其包含編碼抗體多肽或抗體多肽片段的核苷酸序列，其以符合讀碼框的方式融合(2)第二核酸序列，其包含如下的核酸序列，所述核酸序列包含編碼錨多肽的核苷酸序列。此類載體可以修飾為包含啟動子和編碼抗體多肽或抗體多肽片段和錨多肽的核酸序列。許多分子技術適合於修飾載體，其中許多可參見 Sambrook, J.，Fritsch, E. F.和 Maniatis, T. Molecular Cloning:A LaboratoryManual.第 2 版，Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor LaboratoryPress, Cold Spring Harbor, N. Y.，1989，通過提及而將其內容完整收入本文。本領域普通技術人員會知道適合於修飾載體以用於在酵母(例如，解脂耶氏酵母)細胞表面上表達感興趣多肽的多種其它分子技術。在某些實施方案中，載體包含編碼選擇標誌的核苷酸序列。「選擇標誌」在該術語在本文中使用時指容許含有選擇標誌的細胞在缺乏選擇標誌的細胞不能存活和/或增殖的條件下存活和/或增殖的多肽。選擇標誌的術語和概念是本領域普通技術人員公知的。選擇標誌的非限制性例子包括那些關於亮氨酸(例如，LEU2)、尿嘧啶(例如，URA3dl)、腺嘌呤(例如，ADE2)、賴氨酸(Lys)、精氨酸(Arg)、甘油利用(Gut)、色氨酸(Trp)、甘油-3-磷酸脫氫酶(G3p)、和潮黴素B磷酸轉移酶(hph)的。本領域普通技術人員會知道可以依照本文中公開的組合物和方法使用的其它合適的標誌物。在某些實施方案中，將載體整合入細胞(例如，耶氏酵母屬細胞諸如解脂耶氏酵母)的基因組中。用於將載體整合入細胞的基因組中的多種技術是本領域中已知的。在某些實施方案中，載體包含捷塔元件。捷塔元件是容許載體通過同源重組整合入攜帶Yltl反 轉錄轉座子的解脂耶氏酵母菌株的基因組中，或者在缺乏Yltl反轉錄轉座子的酵母中通過非同源重組來整合的序列。在某些實施方案中，捷塔元件包含反轉錄轉座子，諸如但不限於Yltl或Tyl6反轉錄轉座子的長末端重複。本領域普通技術人員會知道其它元件，而且會能夠依照本文中公開的組合物和方法在載體中使用它們。在某些實施方案中，不將載體整合入細胞的基因組中。例如,可以例如通過轉化將複製型載體導入酵母細胞中。複製型載體含有適合於在宿主細胞中維持、複製和/或其它功能的元件。例如，載體可以含有一種或多種常染色體複製元件。此類常染色體複製元件的非限制性例子包括著絲粒(CEN)和複製起點(ORI)。在某些實施方案中，著絲粒包含 CENl 或 CEN3 (Vernis, L.等，Mol. Cell Biol. 17，1995-2004，2007，通過提及而將其完整收入本文)。在某些實施方案中，複製起點包含0RI1068或0RI3018 (Fournier等，Yeast, Jan ;7(1) : 25-36, 1991，通過提及而將其完整收入本文)。在某些實施方案中，不整合入細胞的基因組中的載體可以含有自主複製序列(ARS)。見例如Fournier等，Yeast7，25-36，1991 和 Matsuoka 等，Mol. Gen. Genet. 237，327-333，1993，通過提及而將每篇完整收入本文)。在某些實施方案中，ARS包含著絲粒和複製起點。ARS的非限制性例子包括ARS18 和 ARS18。在某些實施方案中，表達盒包含與錨核苷酸序列核酸序列可操作連接的啟動子，所述錨核苷酸序列核酸序列包含編碼錨多肽的核苷酸序列，其中所述錨核酸序列可以在包含感興趣的第二融合配偶體的融合蛋白中作為第一融合配偶體表達。在某些此類實施方案中，表達盒包含另一核酸序列，其包含編碼感興趣的第二融合配偶體的核苷酸序列。感興趣的第二融合配偶體可以是多種多肽之任一種。例如，感興趣的第二融合配偶體可以是抗體多肽或抗體多肽片段，儘管第二融合配偶體不限於此類抗體多肽或片段。因為第二融合配偶體會與錨多肽融合，所以第二融合配偶體也會在細胞表面上表達。在某些實施方案中，此段中包括的表達盒包含如下的核酸序列，所述核酸序列包含限制性位點以容易融合感興趣的第二融合配偶體。多種限制性位點之任一種可以包含在表達盒中。本領域普通技術人員會知道合適的限制性位點，而且會能夠工程化改造包含它們的表達盒。在某些實施方案中，編碼感興趣多肽的核苷酸序列經密碼子優化以用於表達多肽的生物體(例如，酵母細胞)。密碼子優化是將編碼感興趣多肽的核苷酸序列修飾為使得核苷酸序列經優化以在特定生物體中表達，但是多肽的胺基酸序列保持相同的過程。密碼子是被細胞翻譯成給定胺基酸的三個核苷酸的序列。因為存在著20種天然編碼的胺基酸，但是三個核苷酸的序列存在有64種可能的組合，所以大多數胺基酸由多種密碼子編碼。給定物種中某些密碼子經常比編碼相同胺基酸的其它密碼子更好地得到翻譯，並且每種物種在其密碼子偏愛上有所不同。因此，來自一種物種的基因在導入另一種物種中時可以較差地表達。一種克服此問題的方式是利用遺傳密碼的簡併性，並且修飾編碼感興趣多肽的核苷酸序列，使得核苷酸序列現在含有在感興趣的物種中有效使用的密碼子，但是該核苷酸序列仍編碼相同多肽。有可能確定哪些密碼子在感興趣的生物體中最廣泛使用。實際上，這已經對多種生物體，包括解脂耶氏酵母完成。下文表I中顯示了基於2，945，919個密碼子的解脂耶氏酵母樣品密碼子優化表。本領域普通技術人員會知道而且會能夠確定其它生物體的密碼子選擇。表I :解脂耶氏酵母密碼子選擇表
UUU 15. 9(46804) CU 21. 8(64161)~ AU 6.8(20043)GU 6. 1(17849)
UUC 23. 0(67672) CC 20. 6(60695) AC 23. 1(68146) GC 6. 1(17903)
UUA I. 8(5280)CA 7. 8(22845) AA 0. 8(2494)GA 0. 4(1148)
UUG 10. 4(30576) CG 15. 4(45255) AG 0. 8(2325)GG 12. 1(35555)
CUU13. 2(38890)CU 17. 4(51329)AU 9. 6(28191)GU6. 0(17622)
CUC22. 6(66461)CC 23. 3(68633)AC 14. 4(42490)GC4. 4(12915)
CUA5. 3(15548)CA 6. 9(20234)AA 9. 8(28769)GA21. 7(63881)
CUG33. 5(98823)CG 6. 8(20042)AG 32. I(94609)GG7. 7(22606)
AUU 22. 4(66134)CU 16. 2(47842)AU8. 9(26184)GU 6. 7(19861)
AUC 24. 4(71810)CC 25. 6(75551)AC31. 3(92161)GC 9. 8(28855)
AUA 2.2(6342)CA 10. 5(30844)AA12.4(36672)GA 8.4(24674)
AUG 22. 6(66620)CG 8. 5(25021)AG46. 5(136914)GG 2.4(7208)
GUU 15. 8(46530) CU 25. 5(75193) AU 21. 5(63259) GU 16. 6(48902)
GUC 21. 5(63401) CC 32. 7(96219) AC 38. 3(112759) GC 21. 8(64272)
權利要求
1.一種表達盒，其包含 與融合序列可操作連接的啟動子，所述融合序列包含與第二核酸序列以符合讀碼框的方式融合的第一核酸序列，所述第一核酸序列包含編碼錨多肽的核苷酸序列，所述第二核酸序列包含編碼抗體多肽或抗體多肽片段的核苷酸序列。
2.一種表達盒,其包含 與第一核酸序列可操作連接的啟動子，所述第一核酸序列包含編碼錨多肽的錨核苷酸序列，其中所述第一核酸序列可以在融合多肽中作為第一融合配偶體表達，所述融合多肽包含由第二核酸序列編碼的感興趣的第二融合配偶體。
3.權利要求2的表達盒，其進一步包含編碼所述感興趣的第二融合配偶體的第二核酸序列。
4.權利要求3的表達盒，其進一步包含整個或部分的限制性位點。
5.權利要求3的表達盒，其中所述感興趣的第二融合配偶體包含抗體多肽或抗體多肽片段。
6.權利要求I或權利要求5的表達盒，其中所述抗體多肽片段是scFv片段。
7.權利要求I或權利要求5的表達盒，其中所述抗體多肽片段是Fab片段的重鏈。
8.權利要求I的表達盒載體，其中所述抗體多肽片段是Fab片段的輕鏈。
9.權利要求I或3-8中任一項的表達盒，其中在所述第二核酸序列3』融合所述第一核酸序列，使得自所述融合序列生成的融合多肽包含N端抗體多肽或抗體多肽片段和C端錨多肽。
10.權利要求1-8的表達盒，其中在所述第二核酸序列5』融合所述第一核酸序列，使得自所述融合序列生成的融合多肽包含N端錨多肽和C端抗體多肽或抗體多肽片段。
11.前述權利要求中任一項的表達盒，其中所述啟動子是組成性的。
12.前述權利要求中任一項的表達盒，其中所述啟動子是誘導型的。
13.權利要求12的表達盒，其中所述啟動子是POX2或LIP2啟動子。
14.前述權利要求中任一項的表達盒，其中所述啟動子是半組成性的。
15.權利要求14的表達盒,其中所述啟動子是hp4d啟動子。
16.前述權利要求中任一項的表達盒，其進一步包含前導核酸序列，所述前導核酸序列包含編碼前導多肽的核苷酸序列，其中在所述第一和第二核酸序列5』以符合讀碼框的方式融合所述前導核酸序列。
17.權利要求16的表達盒，其中所述前導多肽選自下組前LIP2、前原LIP2、前XPR2、和前原XPR2。
18.前述權利要求中任一項的表達盒，其進一步包含接頭核酸序列，所述接頭核酸序列包含編碼接頭多肽的核苷酸序列。
19.權利要求18的表達盒，其中所述接頭核酸序列在所述第一和第二核酸序列間以符合讀碼框的方式融合。
20.權利要求18的表達盒，其中所述抗體多肽包含scFv抗體多肽，且其中所述接頭核酸序列在編碼所述scFv多肽的可變區的重鏈核酸序列和編碼可變區的輕鏈核酸序列間以 符合讀碼框的方式融合。
21.權利要求18-20中任一項的表達盒，其中所述接頭多肽包含(Gly4Ser)3(SEQIDNO:14)或(GlySer)5(SEQ ID NO:15)。
22.前述權利要求中任一項的表達盒,其進一步包含一種或多種核酸序列,所述一種或多種核酸序列包含編碼一種或多種表位標籤的核苷酸序列。
23.權利要求22的表達盒，其中所述一種或多種表位標籤選自下組c-Myc、V5、六組氨酸、穀胱甘肽-S-轉移酶、鏈黴親合素、生物素、血凝素、Flag標籤、和E標籤。
24.前述權利要求中任一項的表達盒，其中所述錨多肽選自下組=Agalp多肽或其片段、Aga2p多肽或其片段、和Saglp多肽或其片段。
25.前述權利要求中任一項的表達盒，其中所述抗體多肽或抗體多肽片段、所述錨多肽、或這兩者經密碼子優化以在耶氏酵母屬細胞中表達。
26.一種包含前述權利要求中任一項的表達盒的載體。
27.權利要求26的載體,其進一步包含捷塔(zeta)元件。
28.權利要求27的載體，其中所述捷塔元件是反轉錄轉座子的長末端重複。
29.權利要求28的表達盒，其中所述捷塔元件是Yltl或Tyl6反轉錄轉座子的長末端重複。
30.權利要求26的載體，其進一步包含一種或多種常染色體複製元件。
31.權利要求30的載體，其中至少一種常染色體複製元件包含著絲粒(CEN)和複製起點(ORI)。
32.權利要求31的載體，其中所述著絲粒是CENl或CEN3，而所述複製起點是ORI1068或 0RI3018。
33.權利要求26的載體，其進一步包含自主複製序列(ARS)，其中所述ARS包含著絲粒和複製起點。
34.權利要求33的載體，其中所述ARS包含ARS18。
35.權利要求33的載體，其中所述ARS包含ARS68。
36.權利要求26-35中任一項的載體,其進一步包含一種或多種核酸序列,所述一種或多種核酸序列包含編碼一種或多種選擇標誌的核苷酸序列。
37.權利要求30的載體，其中所述一種或多種選擇標誌選自下組LEU2、URA3dl、ADE2、Lys、Arg、Gut、Trp、G3p、和 hph。
38.一種在耶氏酵母屬細胞的表面上展示抗體多肽或抗體多肽片段的方法，該方法包括 將第一載體導入第一耶氏酵母屬細胞中，所述第一載體包含與融合序列可操作連接的啟動子，所述融合序列包含與第二核酸序列以符合讀碼框的方式融合的第一核酸序列，所述第一核酸序列包含編碼抗體多肽或抗體多肽片段的核苷酸序列，所述第二核酸序列包含編碼錨多肽的核苷酸序列；並 將所述第一耶氏酵母屬細胞在耶氏酵母屬細胞操作條件下溫育一段時間。
39.權利要求38的方法,其中所述第一載體是權利要求20-25中任一項的載體。
40.權利要求38或39的方法，其中所述抗體多肽片段是scFv片段。
41.權利要求38或39的方法，其中所述抗體多肽片段是Fab片段的重鏈。
42.權利要求41的方法，其進一步包括將第二載體導入所述第一耶氏酵母屬細胞中，所述第二載體包含與編碼Fab片段輕鏈的核酸序列可操作連接的第二啟動子。
43.權利要求38或39的方法，其中所述抗體多肽片段是Fab片段的輕鏈。
44.權利要求43的方法，其進一步包括將第二載體導入所述第一耶氏酵母屬細胞中，所述第二載體包含與編碼Fab片段重鏈的核酸序列可操作連接的第二啟動子。
45.權利要求42或44的方法，其中所述第一耶氏酵母屬細胞是單倍體，且其中導入所述第二載體的步驟包括將包含所述第一載體的所述第一單倍體耶氏酵母屬細胞與包含所述第二載體的第二單倍體耶氏酵母屬細胞交配； 其中所述第一和第二耶氏酵母屬細胞是相反交配型的。
46.權利要求38-45中任一項的方法,其中在所述第二核酸序列5』融合第一核酸序列，使得由所述融合序列生成的融合多肽包含N端抗體多肽或其抗體多肽片段和C端錨多肽。
47.權利要求38-45中任一項的方法,其中在所述第二核酸序列3』融合第一核酸序列，使得由所述融合序列生成的融合多肽包含N端錨多肽和C端抗體多肽或抗體多肽片段。
48.權利要求38-47中任一項的方法，其中所述耶氏酵母屬細胞操作條件包括低誘導溫度。
49.權利要求48的方法，其中所述低誘導溫度包括約15攝氏度和25攝氏度間的溫度。
50.權利要求49的方法，其中所述低誘導溫度包括約20攝氏度的溫度。
51.權利要求38-50中任一項的方法，其中所述耶氏酵母屬細胞操作條件包括短誘導時間。
52.權利要求51的方法，其中所述短誘導時間包括約24小時或更少。
53.權利要求52的方法，其中所述短誘導時間包括約16小時或更少。
54.權利要求53的方法，其中所述短誘導時間包括約16小時。
55.權利要求38-54中任一項的方法,其中所述耶氏酵母屬細胞操作條件包括低pH。
56.權利要求55的方法，其中所述低pH包括約2和約4間的pH。
57.權利要求56的方法，其中所述低pH包括約3的pH。
58.權利要求38-57中任一項的方法，其中耶氏酵母屬細胞操作條件包括高通氣條件。
59.權利要求58的方法，其中所述高通氣條件包括在搖瓶中溫育。
60.權利要求38-59中任一項的方法，其中耶氏酵母屬細胞操作條件包括將所述第一耶氏酵母屬細胞在極限培養基中溫育。
61.權利要求60的方法，其中所述極限培養基是缺乏酵母提取物、細菌用蛋白腖、或這兩者的培養基。
62.權利要求38-61中任一項的方法，其中所述第一載體整合入所述耶氏酵母屬基因組中。
63.權利要求38-62中任一項的方法，其中所述耶氏酵母屬細胞表達蛋白伴侶。
64.權利要求63的方法,其中所述蛋白伴侶選自下組蛋白質二硫鍵異構酶、Kar2/Bip、及其組合。
65.權利要求38-64中任一項的方法,其中所述錨多肽選自下組Agalp多肽或其片段、和Aga2p多肽或其片段、或Saglp多肽或其片段。
66.通過權利要求38-65中任一項的方法獲得的抗體多肽或抗體多肽片段。
67.一種選擇包含結合靶多肽的抗體多肽或抗體多肽片段的耶氏酵母屬細胞的方法，包括提供在其表面上展示抗體多肽或抗體多肽片段的親本耶氏酵母屬細胞； 使所述親本耶氏酵母屬細胞與測試多肽接觸；並 如果所述展示的抗體多肽或抗體多肽片段結合所述靶多肽，那麼選擇所述親本耶氏酵母屬細胞。
68.權利要求67的方法，其中通過權利要求38-65中任一項的方法生成所述親本耶氏酵母屬細胞。
69.權利要求67或68的方法，其進一步包括 自所述選定的親本耶氏酵母屬細胞分離所述抗體多肽或抗體多肽片段的第一表達盒; 在編碼所述抗體多肽或抗體多肽片段的核苷酸序列中引入一處或多處變化以生成經修飾的表達盒； 將所述經修飾的表達盒導入缺乏所述第一表達盒的第二耶氏酵母屬細胞中以生成經修飾的耶氏酵母屬細胞； 將所述經修飾的耶氏酵母屬細胞在耶氏酵母屬細胞操作條件下溫育一段時間； 將所述經修飾的耶氏酵母屬細胞與所述靶多肽接觸；並 如果所述經修飾的耶氏酵母屬細胞以比所述親本耶氏酵母屬細胞更大的親和力或親合力結合所述靶多肽，那麼選擇所述經修飾的耶氏酵母屬細胞。
70.一種試劑盒，其包含權利要求1-25中任一項的表達盒。
71.—種試劑盒，其包含權利要求26-37中任一項的載體。
72.權利要求70或71的試劑盒，其進一步包含耶氏酵母屬細胞。
73.權利要求70或72的試劑盒，其進一步包含關於使用所述表達盒的書面用法說明書。
74.權利要求71或72的試劑盒，其進一步包含關於使用所述載體的書面用法說明書。
全文摘要
本文中提供了用於在酵母細胞的表面上展示多肽(例如，抗體多肽或抗體多肽片段)的方法和組合物。可以與本文中公開的各種方法和組合物聯合使用的例示性酵母包括耶氏酵母屬(Yarrowia)的那些酵母，例如，解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)。
文檔編號C12N15/10GK102803491SQ201180014889
公開日2012年11月28日 申請日期2011年1月21日 優先權日2010年1月21日
發明者S.裡卡爾特, G.萊隆德爾 申請人:奧克西雷恩英國有限公司