一種從膠原蛋白製備rgd活性多肽的方法
2023-05-23 15:15:26 2
專利名稱：一種從膠原蛋白製備rgd活性多肽的方法
技術領域：
本發明涉及一種從膠原蛋白製備RGD活性多肽的方法。
背景技術：
膠原蛋白是由動物細胞合成的一類蛋白質家族，膠原蛋白由三條肽鏈組成，肽鏈自身為左手螺旋結構，三條α肽鏈則以平行右手螺旋形式纏繞成三股螺旋結構而構成膠原蛋白分子。膠原蛋白可根據多肽的胺基酸序列差異及其交聯方式分為多種類型，現在已經發現30餘種不同類型的膠原蛋白。不同類型的膠原蛋白顯示出高度的歧異性，包括大小、序列、組織分布和分子組成等，各類型膠原蛋白在理化性質、組織分布和合成機制以及在胚胎期、成年期的結構與功能上存在一定差異。目前，膠原蛋白多肽開發的重點集中於採用化學法、酶法及其耦合實現膠原蛋白製備工藝及不同分子量範圍的膠原多肽分離分級， 所分離組分區分度和特徵性均存在不足。膠原蛋白在體內具有重要的生物學功能，含有多種生物活性肽。Byuu HG和KIM SK 等人首先利用鹼性蛋白酶、鏈酶蛋白酶E和膠原酶共同水解魚膠原蛋白，進而利用凝膠過濾、離子交換和反相層析分離到兩種具有抑制血管緊張素轉化酶活性的三肽Gly-Pro-Leu 和 Gly-Pro-Met [Process Biochemistry, 2001，36:1155-1162]，他們採用同樣的方法水解牛膠原蛋白，得到了具有類似活性的三肽Gly-Pro-Val [Journal of Agriculture Food Chemistry, 2001, 49: 2992-2997] 0 XY Gao等人以酶解明膠為原料，採用纖維連接蛋白親和色譜法-凝膠過濾和反相層析法，分離得到具有抗腫瘤活性的12肽和15肽，此兩肽位於膠 HiSi=I W^HiliJiE-1 ;^IS [European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics, 1998，45: 275-284]。Maruyama S等人從豬膠原蛋白嗜熱菌蛋白酶水解液中分離的Gly-Pro-Arg是一種纖維蛋白原/凝血酶凝集抑制劑[Biochimica et Biophysica Acta, 1993，1164:215-223]。RGD肽是指含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(Arg-Gly-Asp)序列的多肽，RGD肽是細胞發生特異性識別的結構基礎之一，RGD肽在腫瘤治療、抗血栓、治療急性腎衰等方面均具有一定效果和應用價值。目前R⑶肽的製備方式主要有三種(1)從天然動植物體內提取；(2)化學法合成；(3)重組DNA技術製備。第一種方法針對性強，但R⑶肽在生物體內含量極低，大規模製備受限；第二種對結構特殊、或天然不存在的RGD肽製備具有優勢，但該方法成本高，且副產物多；第三種方法應用廣泛，但多適用於製備長肽和蛋白質，對R⑶小肽製備不具備成本優勢。
發明內容
本發明的目的在於針對現有技術中的上述不足，提供一種從膠原蛋白製備RGD活性多肽的方法。本發明通過以下技術方案實現上述目的 一種從膠原蛋白製備RGD活性多肽的方法，步驟如下(1)將膠原蛋白溶於水，調節PH值為7.(Γ9. 0 ；
(2)酶解在膠原蛋白水溶液中加入胰蛋白酶，或者不會完全破壞膠原蛋白中RGD序列的酶，如胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶等，加入量為膠原蛋白質量的1/500(T5/100，3(T45°C條件下酶解，酶解時間為廣8小時，用2，4，6-三硝基苯磺酸衍生-分光光度法測定酶解液吸光度，當吸光度不再增長時視為酶解完成，升高溫度到55飛5°C保溫1(Γ30分鐘使胰蛋白酶失活，終止反應，得到膠原蛋白酶解液；
(3)過濾在15飛0°C溫度範圍內，採用截留分子量為3，00(Γ20，000道爾頓的濾膜過濾或採用凝膠過濾色譜法過濾，收集濾液得到膠原蛋白多肽溶液；
(4)將膠原蛋白多肽溶液依次通過親和色譜柱和反相色譜柱，收集洗脫液，冷凍乾燥， 所得粉末即為膠原蛋白RGD活性多肽。上述製備方法，其中步驟(2)所述膠原蛋白為動物源未降解的完整膠原蛋白，或者經過酸法、鹼法、酶法處理過的膠原蛋白，或直接採用明膠。動物源的膠原蛋白原料可以是人、豬、牛、馬、驢和魚的皮、骨等來源的膠原蛋白。如果採用的膠原蛋白原料直接是水溶液的形式，則可以省去溶於水的步驟，直接調節PH值為7. (Γ9. 0即可。步驟(2)酶解優選加入胰蛋白酶，胰蛋白酶比活為1，000-5, 000 U/mg，使用該比活的酶，能夠在高效酶解膠原蛋白的前提下節省用量，降低生產成本。步驟(3)濾膜截留分子量優選為5，000道爾頓，適合於小分子RGD活性肽的篩選。步驟(3)凝膠過濾色譜法用到的凝膠過濾色譜柱有效分離範圍為3，000^100, 000 道爾頓。步驟(4)所述親和色譜柱是以整合素作為配基的。整合素可以與含RGD序列的膠原蛋白活性多肽特異結合，利用整合素作為配基，採用親和色譜法分離膠原蛋白RGD活性多肽，具有高特異性和高分離效率。反相色譜法的基本原理是利用不同序列多肽的疏水性差異，在反相色譜柱上具有不同的保留性質，從而實現多組分分離。本發明採用反相色譜法是為了在親和色譜法的基礎上，獲得分離效果更好、純度更高的含RGD序列活性多肽，如果膠原蛋白多肽溶液中含 RGD序列活性多肽的種類少於三種，且直接通過親和色譜法可以獲得完全分離，則反相色譜分離過程可以省去。本發明的方法製備得到的RGD活性多肽也在本發明的保護範圍之內，所製備得到的膠原蛋白RGD活性多肽在醫藥、食品和化妝品領域均具有明確的應用價值，如作為抗腫瘤藥物、抗血栓藥物、藥物靶向受體製劑、腫瘤受體顯像劑、膠原蛋白多肽保健食品和美容護膚品添加劑等。與現有技術相比，本發明具有以下有益效果
本發明通過一步酶解法處理膠原蛋白原料、過濾後採用以整合素為配基的親和色譜法，特異性分離膠原蛋白酶解產物中含RGD序列活性多肽，所分離多肽具有明確序列和結構特徵，製備過程簡單易控，適宜於大規模製備和生產，促進膠原蛋白高值化利用，本發明也可用於基於膠原蛋白多肽的血漿代用品活性成份去除，提升血漿代用品的臨床療效。
具體實施例方式實施例1以5mg/mL牛I型膠原蛋白水溶液為原料，從該膠原蛋白溶液中分離膠原蛋白RGD活性多肽。(1)將牛I型膠原蛋白(購自西格瑪-奧德裡奇中國有限公司)水溶液的PH值調至8.0，體積為10 mL。(2)向膠原蛋白溶液中加入比活為3，000 U/mg的胰蛋白酶粉50 yg，於45°C下震蕩反應30 min後，用2，4，6-三硝基苯磺酸衍生-分光光度法測定酶解液吸光度，吸光度不再增長，酶解反應完成，反應液升溫到55°C，保溫20 min使胰蛋白酶失活，終止反應，獲得膠原蛋白酶解液。(3)採用截留分子量為5，000道爾頓的超濾膜，在55°C條件下對上述膠原蛋白酶解液進行過濾，收集的透過液為膠原蛋白多肽溶液。(4)將膠原蛋白多肽溶液循環上樣至以整合素為配基的親和色譜柱，直至上樣溶液和透過溶液中膠原蛋白含量一致。柱填料體積100 mL，填料粒徑5(Γ150 μ m。(5)使用200 mL 0.2 M碳酸氫銨溶液作為淋洗劑淋洗色譜柱，流速3 mL/min，將未與整合素配基結合的多肽從親和色譜柱洗脫出來。(6)使用25%乙醇溶液在25°C下淋洗親和色譜柱，將與整合素配基結合的多肽洗脫，流速2 mL/min，收集流出溶液至無多肽檢測信號。(7)將所收集的溶液於45-55°C減壓低溫蒸發至體積為10 mL的膠原蛋白溶液。(8)將減壓低溫蒸發所得膠原蛋白溶液上樣至反相C18色譜柱(孔徑300埃)，以乙腈和水為流動相進行梯度洗脫，並依據色譜峰收集洗脫液，得到序列分別為RGDAGPK(SEQ ID NO:1),RGDK (SEQ ID NO:2)，RGDIGSPGR (SEQ ID NO:3),RGDQGPVGR (SEQ ID N0:4)的四種含RGD序列膠原蛋白活性多肽的溶液。(9)將上述四種含RGD序列的活性多肽收集液冷凍乾燥，所得白色或淡黃色粉末即為膠原蛋白RGD活性多肽。實施例2
以人II型膠原蛋白為原料，從該膠原蛋白分離膠原蛋白RGD活性多肽。(1)將50 mg人II型膠原蛋白(購自西格瑪-奧德裡奇中國有限公司)溶於10 mL水中，調節PH值至8.0。(2)向膠原蛋白溶液中加入比活2，000 U/mg的胰蛋白酶粉50 yg，於40°C下震蕩反應1 h後，用2，4，6-三硝基苯磺酸衍生-分光光度法測定酶解液吸光度，吸光度不再增長，酶解完成，升高溫度到65°C保溫10 min使胰蛋白酶失活，終止反應，獲得膠原蛋白酶解液。(3)採用凝膠過濾色譜法對膠原蛋白酶解液進行分級，將膠原蛋白酶解液上樣至有效分離範圍為3，000至100，000道爾頓的凝膠過濾色譜柱，柱填料體積100 mL，流速3 ml/min。利用標準蛋白建立保留時間_分子量對數值之間的線性關係，收集5，000道爾頓以下的流出液，所收集流出液為膠原蛋白多肽溶液。(4)將膠原蛋白多肽溶液循環上樣至以整合素為配基的親和色譜柱，直至上樣溶液和透過溶液中膠原蛋白含量一致。柱填料體積100 mL，填料粒徑50-150 μ m。(5)使用200 mL 0. 2 M碳酸氫銨溶液作為淋洗劑淋洗色譜柱，流速3 mL/min，將未與整合素配基結合的多肽從親和色譜柱洗脫出來。
(6)使用25%乙醇溶液在25°C下淋洗親和色譜柱，將與整合素配基結合的多肽洗脫，流速2 mL/min，收集流出溶液至無多肽檢測信號。(7)將所收集溶液於45-55°C減壓低溫蒸發至體積為10 mL的膠原蛋白溶液。(8)將減壓低溫蒸發所得膠原蛋白溶液上樣至反相C18色譜柱(孔徑300埃)，以乙腈和水為流動相進行梯度洗脫，並依據色譜峰收集洗脫液，得到序列分別為RGDRGD (SEQ ID NO:5)，RGDVGE (SEQ ID NO:6)，RGDSGPPGRAGEPGLQGPAGPPGE (SEQ ID NO:7)的三種含 RGD序列膠原蛋白活性多肽的溶液。(9)將上述三種含RGD序列的活性多肽收集液冷凍乾燥，所得白色或淡黃色粉末即為膠原蛋白RGD活性多肽。
權利要求
1.一種從膠原蛋白製備RGD活性多肽的方法，其特徵在於步驟如下(1)將膠原蛋白溶於水，調節PH值為7.(Γ9. 0 ；(2)酶解在膠原蛋白水溶液中加入胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶或胃蛋白酶，加入量為膠原蛋白質量的1/5000 5/100，30^45 °C條件下酶解，酶解時間為0. 5、小時，用2，4，6-三硝基苯磺酸衍生-分光光度法測定酶解液吸光度，當吸光度不再增長時視為酶解完成，升高溫度到55飛5°C保溫1(Γ30分鐘使胰蛋白酶失活，終止反應，得到膠原蛋白酶解液；(3)過濾在15飛0°C溫度範圍內，採用截留分子量為3，00(Γ20，000道爾頓的濾膜過濾或採用凝膠過濾色譜法過濾，收集濾液得到膠原蛋白多肽溶液；(4)將膠原蛋白多肽溶液依次通過親和色譜柱和反相色譜柱，收集洗脫液，冷凍乾燥， 所得粉末即為RGD活性多肽。
2.根據權利要求1所述從膠原蛋白製備RGD活性多肽的方法，其特徵在於步驟(2)所述膠原蛋白為動物源未降解的完整膠原蛋白，或者經過酸法、鹼法、酶法處理過的膠原蛋白，或直接採用明膠。
3.根據權利要求1所述從膠原蛋白製備RGD活性多肽的方法，其特徵在於步驟(2)在膠原蛋白水溶液中加入胰蛋白酶，胰蛋白酶比活為1，000-5，000 U/mg。
4.根據權利要求1所述從膠原蛋白製備RGD活性多肽的方法，其特徵在於步驟(3)濾膜截留分子量為5，000道爾頓。
5.根據權利要求1所述從膠原蛋白製備RGD活性多肽的方法，其特徵在於步驟(3)凝膠過濾色譜法用到的凝膠過濾色譜柱有效分離範圍為3，00(Γ100，000道爾頓。
6.根據權利要求1所述從膠原蛋白製備RGD活性多肽的方法，其特徵在於步驟(4)所述親和色譜柱是以整合素作為配基的。
7.權利要求廣6任意一項所述方法製備得到的RGD活性多肽。
8.權利要求7所述RGD活性多肽在製備RGD活性多肽藥物、RGD活性多肽食品或RGD 活性多肽化妝品中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種從膠原蛋白製備RGD活性多肽的方法，該方法是以膠原蛋白為原料，溶於水後調整pH值為7.0~9.0，然後加入佔膠原蛋白原料質量的1/5000~5/100的胰蛋白酶，30~45℃條件下酶解，反應完成後升高溫度到55~65℃保溫10~30分鐘使胰蛋白酶失活，得到膠原蛋白酶解液，在15~60℃溫度範圍內，採用截留分子量為3,000~20,000道爾頓的濾膜過濾或採用凝膠過濾色譜法過濾，收集濾液得到膠原蛋白多肽溶液，最後依次通過親和色譜柱和反相色譜柱，收集洗脫液，冷凍乾燥，所得粉末即為RGD活性多肽。本發明的方法操作簡便，產品品質高，所得RGD活性多肽適用於醫藥、食品及化妝品等多個領域。
文檔編號C07K1/20GK102533917SQ20121001056
公開日2012年7月4日 申請日期2012年1月14日 優先權日2012年1月14日
發明者劉濤, 尹輝, 朱家勇, 金小寶 申請人:廣東藥學院