一種檢測喹乙醇的酶聯免疫試劑盒的製作方法

2023-05-23 06:55:46 3

專利名稱：一種檢測喹乙醇的酶聯免疫試劑盒的製作方法
技術領域：
本發明涉及酶聯免疫和獸藥殘留檢測領域。具體而言，本發明涉及一種用於檢測喹乙醇的酶聯免疫試劑盒。
背景技術：
喹乙醇(Olaquindox)，又名快育靈、倍育諾(Bayonox)、奧拉金、喹醯胺醇、Fedan。分子式C-(12)H-(13)N-3甲酸甲酯-3-O-4。由2-甲基喹噁啉-1、4-二氧化物與乙醇胺縮合而成的淡黃色結晶性粉末，微溶於水。
喹乙醇抗菌效力好，促進生長發育，增加瘦肉率，價格便宜。因此曾經被作為抗菌促生長作用的飼料添加劑大量使用。
然而，喹乙醇在被大量使用後，人們也發現了許多問題，如雞等禽類對喹乙醇敏感。人們對使用喹乙醇添加劑的雞進行病理解剖時，發現雞的臟器有藥物致損的現象。喹乙醇在動物體內的殘留時間長，蓄積毒性大，不僅能使動物中毒或死亡，而且殘留在肉中對人體也有較大危害。由於喹乙醇是由2-甲酸甲酯-3-甲基喹噁啉-1、4-二氧化物與乙醇胺縮合而成的，有人認為喹乙醇在動物體內代謝後會生成甲基喹噁啉-1、4-二氧化物，這種物質能抑制脫氧核糖核酸的合成，對染色體畸變有影響，是一種致癌物。
鑑於喹乙醇的毒性和存在的潛在危害，因而人們重新對喹乙醇的安全性進行評價，對喹乙醇的使用也做出了新的規定。美國沒有批准使用；歐盟也從1999年開起始全面禁止使用喹乙醇；我國對喹乙醇使用的限制也更加嚴格。我國農業部頒布的《動物性食品獸藥最高殘留限量》中也列入了喹乙醇。國家進出口檢驗檢疫局制定了肉中喹乙醇殘留量的檢驗方法《中華人民共和國進出口商品檢驗行業標準——出口肉中喹乙飼料添加劑質量監督檢測實施細則》也把雞飼料、飲水及魚飼料中的喹乙醇作為違禁藥物進行監督檢驗。
現有的喹乙醇檢測方法多為色譜法，但是這些方法的靈敏度受樣品的淨化、濃縮等步驟的影響較大；再者這些方法需要複雜的儀器，且過程繁瑣，不適應現場大量樣本的篩查。基於抗原抗體免疫反應的免疫學檢測技術為小分子殘留物的分析檢測提供了一個新的途徑。該技術研究的關鍵是半抗原分子的設計、合成和人工全抗原及抗體的製備。
因為喹乙醇是小分子化合物，本身沒有免疫原性，必須將其與大分子載體蛋白偶聯得到具有免疫原性的人工抗原。喹乙醇人工抗原和特異性抗體以及在此基礎上建立免疫分析方法尚未見報導。並且本發明首次用固體光氣作為連接劑用於製備喹乙醇的人工抗原。

發明內容
本發明的目的在於提供一種快速檢測喹乙醇的酶聯免疫試劑盒。
本發明提供了一種快速檢測喹乙醇的酶聯免疫試劑盒，該試劑盒包括喹乙醇特異性抗體、喹乙醇-載體蛋白偶聯物和酶標二抗。其中喹乙醇特異性抗體為兔抗喹乙醇的多克隆抗體，可用喹乙醇與載體蛋白偶聯物作為免疫原通過免疫動物(例如兔)製得。所述的載體蛋白為牛血清白蛋白、人血清白蛋白、卵清蛋白或鑰孔銅蘭蛋白(KLH)。所述的喹乙醇-載體蛋白偶聯物採用化學方法偶聯得到。所述酶標二抗的標記酶為辣根過氧化物酶，所述酶標二抗可以用商品化的辣根過氧化物酶酶標二抗，也可以通過過碘酸鈉法或戊二醛法將辣根過氧化物酶與二抗偶聯製得。在本發明的一個優選實施方案中，所述酶標二抗為羊抗兔IgG抗體。
用於製備所述酶標板的固相材料，包括但不限於，例如，聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯。載體的形式是微量反應板凹孔。
為方便現場檢測和大量樣本篩查，所述試劑盒還可以進一步包括喹乙醇抗原或抗喹乙醇特異性抗體的酶標板、喹乙醇標準溶液、底物顯色劑、洗滌液、終止液和濃縮樣品稀釋液。
所述的洗滌液為0.05％-0.5％吐溫-20磷酸鹽緩衝液。所述的顯色劑由顯色劑A液和顯色劑B液組成(例如，體積比為1∶1)，顯色劑A液為過氧化氫或過氧化脲，顯色劑B液為四甲基聯苯胺或鄰苯二胺或四甲基聯苯胺。所述的濃縮樣品稀釋液為含0.1％吐溫-20的磷酸鹽緩衝液。
另一方面，本發明還提供了一種檢測樣品中喹乙醇含量的方法，包括步驟(1)樣品前處理；(2)用權利要求1-9任一所述的試劑盒進行檢測，向包被有喹乙醇抗原的酶標板孔中加入標準品或樣品溶液，再加入抗喹乙醇多克隆抗體，孵育後洗滌拍幹，加入酶標記二抗，孵育後洗滌拍幹，顯色、終上，用酶標儀測定吸光度值；(3)分析檢測結果。
本發明試劑盒的檢測原理為將喹乙醇抗原吸附於固相載體上，加入樣本或喹乙醇標準品溶液並加入喹乙醇抗體工作液，待測樣品中喹乙醇和固相載體上包被的喹乙醇抗原競爭喹乙醇抗體，再加入酶標記抗抗體進行酶活性的放大作用，顯色後終止，測定樣品的吸光度值，該值與樣品中喹乙醇的量呈負相關，與標準曲線比較即可得出喹乙醇濃度範圍。
有益效果本發明檢測喹乙醇的試劑盒主要採用間接競爭酶聯免疫測定法定性或定量樣品中喹乙醇含量；對樣品的前處理要求低，樣品前處理過程簡單，能同時快速檢測大批樣品。
本發明該試劑盒採用高特異性的喹乙醇多克隆抗體，主要試劑以工作液形式提供，可以減少試劑盒的操作步驟，為使用者節省時間並降低因操作步驟冗繁造成的誤差，本發明具有靈敏度高、特異性強、高精確度、高準確度、對儀器設備要求低、試劑保存時間長、自動化程度高、無放射性同位素汙染的等優點，可在飼料及動物源性產品檢測中發揮重要作用。


圖1為喹乙醇酶聯免疫檢測試劑盒結構圖。其中1為試劑盒盒體，2為包被了喹乙醇抗原或抗喹乙醇特異性抗體的酶標板，3為系列標準溶液，4為顯色劑A，5為顯色劑B，6為抗體溶液，7為酶標二抗溶液，8為酶標二抗稀釋液，9為濃縮洗滌液，10為濃縮樣品稀釋液，11為試劑瓶架。
圖2為喹乙醇抑制曲線。
提供下述實施例是為了更好地進一步理解本發明，而決不對本發明的內容和保護範圍構成任何限制。
實施例2實施例1 免疫原的合成及免疫血清的製備1.1試劑與儀器喹乙醇(湖北中牧安達藥業有限公司生產)，固體光氣(BTC)(購自北京耀北生物技術有限公司)，吡啶(Pyridine，AR.WM＝79.10，含量＞99.5％，天津市科密歐化學試劑開發中心)，N，N-二甲基甲醯胺(Dimethylformamide，DMF，美國新澤西州ACROSORGANICS公司生產，購自百靈威化學試劑公司)，正三丁胺(Tributylamine，美國新澤西州ACROSORGANICS公司生產，購自百靈威化學試劑公司)，牛血清白蛋白(BSA)，二氯甲烷(北京世紀紅星化工有限責任公司生產)
雙光束紫外可見分光光度儀(TU-1909，北京普析通用儀器有限公司)，層析裝置(3057型可攜式記錄儀，重慶川儀四廠；SBS系列數控計滴器，恆流泵，自動部分收集器，層析柱，上海滬西分析儀器廠)，磁力攪拌器(上海東榮豐科學儀器有限公司)，臺式離心機(Minispin最大轉速13400rpm最大離心力12100rcf，2ml×12)，1.2喹乙醇人工抗原的合成稱取26.3mg喹乙醇溶於3ml的吡啶和N，N-二甲基甲醯胺(DMF)混合(1∶1)溶液中，稱取固體光氣(BTC)9.9mg溶於1ml二氯甲烷中。
將上述喹乙醇和固體光氣兩溶液混合。具體方法為在冰浴條件下先將少許BTC溶液滴加入喹乙醇溶液中，反應幾分鐘後將剩餘的BTC溶液全部加入，轉入室溫攪拌反應1小時，得到混合溶液A。
稱取50mg載體蛋白BSA或KLH分別溶於0.1mol/L pH8.4的5ml硼酸鈉緩衝液中，向其中加入1ml DMF得到載體蛋白溶液B。
將溶液A逐滴加於載體蛋白溶液B中，緩慢滴加，半小時內加完，室溫下反應4小時。
然後，將偶聯物過SephadexG-25M凝膠層析純化，用0.01M pH7.4 PBS三倍柱床體積平衡，調節流速至3ml/min，樣品濃縮至5ml加入到平衡好的層析柱中層析提純偶聯物，洗脫液用pH7.4 0.01M PBS。
通過紫外線掃描鑑定偶聯物。具體操作為將喹乙醇溶於PBS(0.01M pH7.4)，濃度為15μg/ml；BSA溶於PBS(0.01M pH7.4)，濃度為1.03mg/ml；將純化後的偶聯物同樣用PBS(0.01M pH7.4)作適當稀釋，使其濃度與BSA濃度接近。將這三種溶液在200nm-400nm之間進行紫外掃描，得出各物質的紫外掃描波譜，如圖1-3所示。從圖1-3中可以看出喹乙醇與載體蛋白BSA偶聯成功。
免疫及特異性抗體的製備將上述喹乙醇-BSA偶聯物用生理鹽水稀釋成1mg/ml溶液備用。
選取6隻體重2～2.5Kg健康雄性紐西蘭大白兔。將偶聯物與等量弗氏完全佐劑通過注射器對抽法混合成油包水的乳濁液，按1mg/Kg體重的量進行首次免疫，採取背部皮下多點注射。每隔兩周加強免疫一次，用弗氏不完全佐劑代替弗氏完全佐劑，劑量及方法同首次免疫。從第三次免疫開始，每次免疫後10天，耳緣靜脈取血1ml，進行抗體效價檢測，當抗體效價不再升高時，不加佐劑進行最後一次(第7次)免疫，大腿肌肉注射，7天後頸動脈放血，室溫凝固2h後4℃過夜，8000r/min離心10分鐘，除去血塊，血清部分用50％飽和硫酸銨溶液沉澱，離心去上清液，沉澱用磷酸鹽緩衝液重懸，再用33％飽和硫酸銨溶液沉澱兩次，沉澱物用儘可能少的磷酸緩衝液溶解，經透析後用SephadexG-25M層析，即得多克隆抗體。
實施例2 免疫檢測方法的建立2.1 ELISA方法確定最佳包被濃度將1000μg/ml、100μg/ml、10μg/ml、5μg/ml、1μg/ml、0.25μg/ml系列濃度的卵清蛋白(OVA)-喹乙醇偶聯物按每孔100μl包被酶標板，4℃包被24h，洗滌5次，拍幹，按每孔200μl封閉液4℃下封閉12h，洗滌3次，拍幹。加入1∶500稀釋的抗血清100μl，室溫作用2h，洗滌三次，立即加入100μl酶標羊抗兔抗體，室溫作用30min，洗滌三次，加100μl底物液，室溫避光作用15min，50μl終止液終止反應，酶標儀檢測A值(450nm)。同時設置空白對照孔(不加抗血清，只加其稀釋液)和平行重複孔，取OD值為1.0左右時的包被濃度為最佳濃度。試驗數據列於表3。
表1 不同包被濃度的OD值

由表3的數據中可以確定，最佳包被濃度為1μg/ml。
2.2間接ELISA檢測抗體效價以1μg/ml濃度包被酶標板，從400倍開始倍比稀釋抗血清，按2.1的ELISA步驟操作。以兩倍於陰性血清OD值的抗血清OD值對應的抗血清稀釋度為抗血清效價。抗血清效價檢測結果見表4。
表2 抗血清效價檢測結果

從表4的數據可以確定本發明製備的抗血清的效價在6000以上。
2.3間接競爭ELISA檢測抗體特異性ELISA操作方法同2.1。不同的是每孔加入50μl不同濃度的游離喹乙醇與卵清蛋白(OVA)-喹乙醇偶聯物競爭抗體，隨後加入抗血清，得出不同的OD值。根據2.1的結果，所用抗血清最佳濃度為1∶500。喹乙醇系列濃度和試驗孔的排列順序見表3，同時設置平行重複孔和空白對照孔。以0抑制孔的OD值為最大值B0，其它抑制濃度孔OD值為B，B/B0＝50％時對應的喹乙醇濃度為此抗體的IC50值。抗體的特異性檢測結果的數據列於表3。然後，用所得數據繪製出喹乙醇抑制曲線(圖2)。
表3 抗血清特異性檢測結果

由表3中數據可知，喹乙醇抗血清IC50值在5ng/ml左右，表明本發明製備的抗血清是具有良好的特異性的抗喹乙醇多克隆抗體。
實施例3 檢測喹乙醇的酶聯免疫試劑盒的組建組建檢測喹乙醇的酶聯免疫試劑盒，使其包含下述組分(1)包被喹乙醇抗原的酶標板；(2)蛋白濃度為1mg/L的抗喹乙醇多克隆抗體；(3)用辣根過氧化物酶標記的羊抗兔抗抗體；(4)喹乙醇標準品溶液6瓶，濃度分別為0μg/L、0.5μg/L、1.5μg/L、4.5μg/L、13.5μg/L、40.5μg/L；(5)底物顯色液A液為過氧化脲，底物顯色液B液為四甲基聯苯胺；(6)洗滌液為含0.05％吐溫20的磷酸鹽緩衝液；(7)濃縮樣品稀釋液為0.1％吐溫-20的磷酸鹽緩衝液；(8)終止液為2mol/L的鹽酸溶液。
實施例3 檢測喹乙醇的酶聯免疫試劑盒的組建組建檢測喹乙醇的酶聯免疫試劑盒，使其包含下述組分(1)包被羊抗兔抗抗體的酶標板；(2)蛋白濃度為5mg/L的抗喹乙醇多克隆抗體；(3)用辣根過氧化物酶標記的喹乙醇；(4)喹乙醇標準品溶液6瓶，濃度分別為0μg/L、0.5μg/L、1.5μg/L、4.5μg/L、13.5μg/L、40.5μg/L；(5)底物顯色液A液為過氧化脲，底物顯色液B液為鄰苯二胺；
[6)洗滌液為0.5％吐溫-20磷酸鹽緩衝液；(7)濃縮樣品稀釋液為0.1％吐溫-20的磷酸鹽緩衝液；(8)終止液為2mol/L的鹽酸溶液。
實施例4 樣品中莢克多巴胺殘留的檢測1、樣品前處理準確稱取5g飼料於40ml離心管中。加入20ml樣品稀釋液(0.01％吐溫-20的磷酸鹽緩衝液)，加熱至60℃，充分振蕩10分鐘，4000rpm離心10min，取上清5ml。
2、用試劑盒進行檢測向喹乙醇-OVA偶聯物包被的酶標板微孔中加系列標準品或樣品溶液50μl，再加入抗體工作液(1mg/L的抗喹乙醇多克隆抗體)50μl，室溫反應1小時。倒出孔中液體，每孔加入250μl經10倍稀釋了的洗滌液，30秒後倒出孔中液體，如此重複操作共洗板3次，用吸水紙拍幹。每孔加入酶標記抗抗體100μl，避光室溫孵育30min。底物顯色液A液(過氧化脲)50μl，再加B液(四甲基聯苯胺)50μl，輕輕振蕩混勻，室溫避光顯色15min，每孔加入終止液(2mol/L鹽酸)50μl，輕輕振蕩混勻，用酶標儀測定每孔吸光度值(OD值)。
結果分析計算百分吸光度值並繪製標準曲線，相對應每一個樣品中喹乙醇的濃度可以從標準曲線上讀出，也可以用回歸方程法計算出在樣本中喹乙醇的含量。利用專業電腦軟體更便於大量的樣本的快速分析。根據酶標板上的樣本顏色的深淺與系列濃度標準溶液顏色的比較，可以判斷出樣本中喹乙醇的濃度範圍。
實驗例1 試劑盒精密度試驗本實驗例為標準可重複性試驗。具體操作為從每批實施例2或3中的方法製備的酶標板中，各抽取10個孔，測定4.5μg/L的標準溶液的吸光度值(OD)，重複3次，計算變異係數CV％。
結果表明變異係數範圍在4.8-7.6％之間，符合了變異係數小於20％的規定，說明本試劑盒標準品精密度達到了要求。
實驗例2 試劑盒的回收率試驗取兩個濃度的喹乙醇標樣，對樣品進行添加回收試驗，每個濃度做4個平行，分別計算回收率。結果表明飼料中的添加回收率為60％-85％。
實驗例3 試劑盒保存期試驗試劑盒保存條件為2-8℃，經過6個月的測定，試劑盒的最大吸光度值(零添加)、50％抑制濃度、喹乙醇添加實際測定值均在正常範圍之內。考慮在運輸和使用過程中，會有非正常保存條件出現，將試劑盒在37℃保存條件下放置6天，進行加速老化實驗，結果表明該試劑盒各項指標完全符合要求。考慮到試劑盒冷凍情況發生，將試劑盒放入-20℃冰箱冷凍5天，測定結果也表明試劑盒各項指標完全正常。從以上結果可得出試劑盒可以在2-8℃保存6個月以上。
權利要求
1.一種檢測喹乙醇的酶聯免疫試劑盒，其中包括喹乙醇特異性抗體、喹乙醇-載體蛋白偶聯物和酶標二抗。
2.根據權利要求1所述的酶聯免疫試劑盒，其特徵在於所述試劑盒還包括包被了喹乙醇抗原或抗喹乙醇特異性抗體的酶標板、喹乙醇標準溶液、底物顯色劑、洗滌液、終止液和濃縮樣品稀釋液。
3.根據權利要求1或2所述的酶聯免疫試劑盒，其特徵在於所述喹乙醇特異性抗體為多克隆抗體。
4.根據權利要求1或2所述的酶聯免疫試劑盒，其特徵在於所述的載體蛋白為牛血清白蛋白、卵清蛋白或鑰孔銅蘭蛋白(KLH)。
5.根據權利要求1或2所述的酶聯免疫試劑盒，其特徵在於所述的酶標二抗的酶為辣根過氧化物酶。
6.根據權利要求1或2所述的酶聯免疫試劑盒，其特徵在於所述的酶標二抗為羊抗兔IgG抗體。
7.根據權利要求2所述的酶聯免疫試劑盒，其特徵在於所述的洗滌液為含有0.05％-0.5％吐溫-20磷酸鹽緩衝液。
8.根據權利要求2所述的酶聯免疫試劑盒，其特徵在於所述的顯色劑由顯色劑A和顯色劑B組成，顯色劑A為過氧化氫或過氧化脲，顯色劑B為鄰苯二胺或四甲基聯苯胺。
9.根據權利要求2所述的酶聯免疫試劑盒，其特徵在於所述的濃縮樣品稀釋液為含0.1％吐溫-20的磷酸鹽緩衝液。
10.一種檢測樣品中喹乙醇含量的方法，包括步驟(1)樣品前處理；(2)用權利要求1-9任一所述的試劑盒進行檢測，向包被有喹乙醇抗原的酶標板孔中加入標準品或樣品溶液，再加入抗喹乙醇多克隆抗體，孵育後洗滌拍幹，加入酶標記二抗，孵育後洗滌拍幹，顯色、終上，用酶標儀測定吸光度值；(3)分析檢測結果。
全文摘要
本發明公開了一種檢測喹乙醇的酶聯免疫試劑盒。本發明所提供的喹乙醇的酶聯免疫試劑盒包括喹乙醇特異性抗體、喹乙醇與載體蛋白的偶聯物、和酶標二抗。本發明的檢測喹乙醇的酶聯免疫試劑盒靈敏、快速、準確，主要用於大批樣品的篩查；盒中的主要試劑均以工作液的形式提供，使用方便，具有高特異性、高靈敏性、高精確性、高準確性等特點，可快速檢測飼料及畜產品中殘留的喹乙醇。
文檔編號G01N33/544GK1888903SQ200610103899
公開日2007年1月3日 申請日期2006年8月8日 優先權日2006年8月8日
發明者楊曙明, 於洪俠 申請人:中國農業科學院農業質量標準與檢測技術研究所