一種美拉德產物改性聚己內酯在離子液體中的合成方法與流程
2023-05-23 06:55:16 2
本發明涉及一種美拉德產物改性聚己內酯在離子液體中的合成方法，屬於聚己內酯改性技術領域。
背景技術：
聚己內酯是一種重要的醫用生物可降解材料，它被廣泛用作手術縫線、藥物緩釋材料以及醫用支架材料。但是作為醫用材料，聚己內酯存在疏水性過強的缺陷，這會導致聚己內酯與細胞培養基不易浸潤，細胞在其表面的粘附生長比較困難，久而久之會出現異物反應等生物不相容性反應，引發無菌性炎症。因此，為了提高聚己內酯的細胞相容性，有必要對其進行改性。
已有一些報導，利用幾丁質、殼聚糖、羥乙基纖維素以及澱粉等基團在脂肪酶或者其他無機金屬催化劑的催化下引入到聚己內酯末端，實現了聚己內酯的功能改性。與普通的多糖類物質相比，蛋白是動物體中普遍存在的一種大分子蛋白質，其細胞相容性更好，因此，若能將蛋白引入聚己內酯組織材料中，對提高其細胞親和性和生物相容性更有利。但是沒有人能夠採用脂肪酶催化方法合成蛋白類改性的聚己內酯，這是因為蛋白本身缺乏足夠的脂肪酶催化位點，因此採用酶法催化無法直接實現其官能化改性，如果採用金屬離子催化，則由於其高溫條件限制，蛋白在催化過程中會發生變性，失去改性意義。
美拉德產物是還原糖末端羰基和蛋白質上的氨基在簡單加熱條件下形成的一種蛋白質-糖共價複合物。由於在蛋白質分子中引入了糖鏈，所以經過美拉德反應後，蛋白質的性質，如：溶解性、乳化性、起泡性、熱穩定性等，都較改性之前有了很大改善。目前針對美拉德反應的研究主要應用於食品領域，這是因為美拉德反應主要發生在食品的加工過程中，美拉德反應對食品香味、色澤、蛋白的溶解/乳化及食品的保鮮均有重要影響。此外，最新研究顯示美拉德產物還具有特殊的抗氧化性能以及抗菌性能，因此將美拉德產物用作抗氧化劑以及其他添加劑的研究也逐漸得到重視，最近有研究顯示身體內的美拉德反應對人體健康也有重要影響，但是將其應用於聚己內酯改性目前尚未有人研究。
在美拉德產物合成方面，現有方法主要分為溼法和幹法，其中溼法只適合於糖和蛋白均溶於水的情況，其反應速度較慢，往往需要幾十個小時以上；幹法主要採用粉末狀物質混合後進行加熱，該法反應非常迅速，反應過程劇烈，基本無法有效控制，產物性能較差。最近，有研究者公開了一種殼聚糖-木聚糖美拉德反應產物及其製備方法和應用(CN103304682A)在該發明中，研究者利用了離子液體作為溶劑來進行美拉德反應，但是這種方法仍然是屬於溼法的範疇，只能對於溶解於氯代1-丁基-3-甲基咪唑離子液體中的物質有用，而且該離子液體對蛋白類物質的溶解程度有限，所以這種應用是受限的。
在現有的聚己內酯改性方法中，利用生物合成技術將天然高分子與聚己內酯進行酶催化接枝共聚是比較有吸引力的一種綠色改性方法。在此過程中，酶必須在無水環境中進行催化，但是傳統的非水相體系多以有毒溶劑為主，對酶活以及穩定性都有負面影響，很大程度上限制了該方法的應用。近年來，隨著離子液體這一新型綠色溶劑的發展，該問題有望得到解決。很多研究顯示，離子液體是脂肪酶催化合成的理想介質。大部分脂肪酶在離子液體中的穩定性和選擇性都有增加，產物的轉化率也相當有吸引力。
現有的離子液體中聚己內酯的改性研究主要集中於利用離子液體的強溶解能力對澱粉、纖維素或者殼聚糖等天然產物進行溶解後，得到均相接枝物，然後再利用傳統的無機金屬離子催化劑做引發劑來實現己內酯的開環聚合，最終實現聚己內酯末端官能化改性。例如：劉繼延以1-丁基-3-甲基咪唑溴離子液體作為澱粉和己內酯的共溶劑，在異辛酸亞錫的催化下合成了生物可降解的澱粉/聚己內酯接枝共聚物，但是該產物分子量較低，因此可以溶於水。黃清採用室溫離子液體氯代1-丁基-3-甲基咪唑作為魔芋葡甘聚糖的溶劑，以辛酸亞錫作為催化劑成功在魔芋葡甘聚糖表面接枝了聚己內酯長鏈；Zhaodong Wang在1-乙基-3-甲基咪唑醋酸鹽離子液體中採用異辛酸亞錫催化合成了殼聚糖/聚己內酯接枝共聚物。這些研究在本質上仍然是傳統的無機金屬催化開環聚合，離子液體在其中僅扮演了溶劑的角色。
技術實現要素：
為了解決上述問題，本發明提出了在離子液體中直接酶法合成一種膠原蛋白改性聚己內酯的方法，通過在聚己內酯材料中引入細胞識別性較好的膠原蛋白大分子，提高聚己內酯材料的細胞親和性與功能性。由於膠原蛋白分子中缺乏適於脂肪酶催化的伯羥基位點，無法直接以其作為引發劑對己內酯進行酶法開環聚合。為此，本發明通過美拉德反應將含有伯羥基的小分子還原糖接枝到膠原蛋白上，提升蛋白上的伯羥基數目，得到適於脂肪酶催化的美拉德產物，再以此為引發劑，藉助於脂肪酶催化己內酯單體進行開環聚合反應，最終得到美拉德產物改性聚己內酯。該法避免了傳統金屬催化劑開環聚合時高溫對蛋白質的破壞及其金屬離子殘留問題，而且引入的美拉德產物是一種糖蛋白，其生物相容性更好，該產物有助於提高聚己內酯的生物相容性。本發明方法還具有高效、選擇性好、作用條件溫和以及環境友好等特點。
本發明的在離子液體中合成美拉德產物改性聚己內酯的方法，所述方法是將含有伯羥基的小分子還原糖的溶液和膠原蛋白緩衝溶液混合，冷凍乾燥得到混合物，然後將混合物分散於離子液體中，於60～150℃下反應；反應完畢後，降溫至100℃以下，加入己內酯單體和脂肪酶，在脂肪酶的催化下進行開環聚合反應，得到美拉德產物改性聚己內酯。
在本發明的一種實施方式中，所述含有伯羥基的小分子還原糖為葡萄糖、半乳糖、乳糖等中的任意一種或者多種。
在本發明的一種實施方式中，所述糖和膠原蛋白的質量比為1:1～1:3。
在本發明的一種實施方式中，所述分散是將混合物按照質量分數0.1％～5％的比例分散於離子液體中。
在本發明的一種實施方式中，所述離子液體為1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽或者1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽離子液體。
在本發明的一種實施方式中，所述的離子液體與己內酯單體之間的質量比為0.1～10。
在本發明的一種實施方式中，所述60～150℃下反應的時間為5～240分鐘。
在本發明的一種實施方式中，所述降溫是降溫至60～100℃以下。
在本發明的一種實施方式中，所述脂肪酶為南極假絲酵母脂肪酶B或者豬胰脂肪酶。
在本發明的一種實施方式中，所述脂肪酶添加量為己內酯單體質量的0.1％～10％。
在本發明的一種實施方式中，所述脂肪酶的酶活為3000U/g。
在本發明的一種實施方式中，所述開環聚合反應是在溫度為60～100℃下振蕩反應1～144小時。
在本發明的一種實施方式中，所述製備方法還包括，在開環聚合反應完畢後向反應混合物中加入二氯甲烷，使目標產物完全溶解，過濾，再向濾液中加入適當體積的-20℃～-4℃冷甲醇，於-20℃～-4℃環境中靜置一段時間，再過濾，得到粗產物；以丙酮為溶劑抽提上述粗產物，得到美拉德產物改性聚己內酯。
在本發明的一種實施方式中，本發明的方法具體是：
(1)分別配製1％質量分數的乳糖溶液和膠原蛋白磷酸鹽緩衝液(pH＝7.8)，按照體積比1:3比例混合均勻，-20℃冷凍乾燥48小時後，將該混合物按照質量分數0.1％～5％的比例分散於離子液體中，之後將離子液體溫度升至60～150℃，反應5～240分鐘；
(2)反應完畢後，將上述離子液體溫度降至60℃，分別加入ε-己內酯單體和脂肪酶，通氮氣密封后將其置於溫度為60～100℃恆溫振蕩反應器中反應1～144小時；
(3)向上述產物中加入2倍產物體積的二氯甲烷，之後用濾紙過濾掉脂肪酶，再向濾液中加入10倍濾液體積的-20℃冷甲醇，於-20℃環境中靜置24小時後過濾，得到粗產物；
(4)以丙酮為溶劑對上述粗產物抽提24小時，得到美拉德產物改性聚己內酯。
本發明的第二個目的是提供按照上述方法得到的美拉德產物改性聚己內酯。
本發明的第三個目的是提供所述美拉德產物改性聚己內酯的應用。
在本發明的一種實施方式中，所述應用是用作醫用材料。
在本發明的一種實施方式中，所述應用具體是用作手術縫線、藥物緩釋材料或者醫用支架材料。
本發明的有益效果：
(1)本發明的美拉德產物改性聚己內酯合成方法，改性過程環保無汙染，通過離子液體中的美拉德反應在膠原蛋白上引入含有伯羥基的還原糖小分子，成功實現了利用脂肪酶來催化合成美拉德產物改性聚己內酯，其反應條件溫和，無金屬離子殘留。
(2)本發明中，所選擇的兩種離子液體既可以作為美拉德反應的分散介質又可以作為脂肪酶的催化反應介質。一方面將離子液體作為加熱介質來進行幹法反應，採用這樣的方法，不僅有利於反應底物的分散及其混合，而且條件相對溫和且可控，得到的美拉德產物性能佳；另一方面：該類離子液體對脂肪酶基本無害，一些研究還顯示離子液體對脂肪酶催化聚合反應還有促進作用，因此美拉德反應後無需移除離子液體即可進行下一步的開環聚合反應。
(3)產物細胞親和性更好。採用本發明述及的美拉德產物對聚己內酯改性，可以獲得更好的細胞親和性，膠原蛋白與乳糖的美拉德反應產物，具有兩親性，採用該物質對聚己內酯改性可以提升其細胞親和性，並賦予其更多功能。
具體實施方案
潤溼性測試方法：
採用JC2000D4接觸角測量儀進行滴液法測試。將改性聚己內酯採用壓片機進行壓片，製成厚約2mm的薄片。測試時，將樣品平整的固定在儀器平臺上。在距離樣品10mm處滴下去離子水液滴，60秒後測定水滴與樣品間形成的接觸角，每個試樣測5次，取平均值。
MTT檢測即細胞毒性測定(非直接接觸)：
樣品經過24h紫外消毒殺菌後用DMEM浸泡36h，通過過濾器(孔徑大小0.22μm)除去樣品得到浸漬培養基，待用。在96孔的細胞培養板中加入100μL的NIH/3T3細胞懸浮液(5*104個/mL)，置於37℃、5％CO2、飽和溼度的培養箱中培養24h，使細胞完全貼壁後去除培養板中的培養基，加入浸漬培養基繼續培養24h，最後加入10μL的MTT(四甲基偶氮唑鹽)溶液至每孔中，放入培養箱中繼續孵育4h，通過ELISA酶標儀測定450nm處的吸光度，每個樣品測試重複5次。
細胞毒性測定結果表示為：
細胞存活百分比(％)＝A1/A0*100
其中，A1、A0分別為樣品和空白的吸光度
接枝效率:
採用稱重法進行計算，接枝效率＝[接枝物單體質量/(接枝物單體質量+均聚物質量)]*100％
以下對本發明的優選實施例進行說明，應當理解，此處所描述的優選實施例僅用於說明和解釋本發明，並不用於限定本發明。
實施例1：
(1)分別配製1％質量分數的乳糖溶液和膠原蛋白磷酸鹽緩衝液(pH＝7.8)，按照體積比1:3比例混合均勻，-20℃冷凍乾燥48小時後，將該混合物按照質量分數0.1％的比例分散於1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽離子液體中，之後將離子液體溫度升至150℃，反應5分鐘；
(2)反應完畢後，將上述離子液體溫度降至60℃，分別加入ε-己內酯單體和南極假絲酵母脂肪酶B，通氮氣密封后將其置於溫度為100℃恆溫振蕩反應器中反應1小時；
(3)向上述產物中加入2倍產物體積的二氯甲烷，之後用濾紙過濾掉脂肪酶，再向濾液中加入10倍濾液體積的-20℃冷甲醇，於-20℃環境中靜置24小時後過濾，得到粗產物；
(4)以丙酮為溶劑對上述粗產物抽提24小時，得到美拉德產物改性聚己內酯。
經上述方法得到美拉德產物改性聚己內酯，經計算其接枝效率約為70％，對其壓片後進行接觸角測試，顯示其水滴潤溼接觸角為45°，MTT法檢測表明細胞存活率95％以上。
實施例2：
(1)分別配製1％質量分數的乳糖溶液和膠原蛋白磷酸鹽緩衝液(pH＝7.8)，按照體積比1:3比例混合均勻，-20℃冷凍乾燥48小時後，將該混合物按照質量分數0.1％的比例分散於1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽離子液體中，之後將離子液體溫度升至60℃，反應240分鐘；
(2)反應完畢後，將上述離子液體溫度降至60℃，分別加入ε-己內酯單體和豬胰脂肪酶，通氮氣密封后將其置於溫度為60℃恆溫振蕩反應器中反應144小時；
(3)向上述產物中加入2倍產物體積的二氯甲烷，之後用濾紙過濾掉脂肪酶，再向濾液中加入10倍濾液體積的-20℃冷甲醇，於-20℃環境中靜置24小時後過濾，得到粗產物；
(4)以丙酮為溶劑對上述粗產物抽提24小時，得到美拉德產物改性聚己內酯。
經上述方法得到美拉德產物改性聚己內酯，經計算其接枝效率約為60％，對其壓片後進行接觸角測試，顯示其水滴潤溼接觸角為50°，MTT法檢測表明細胞存活率90％以上。
實施例3：
(1)分別配製1％質量分數的乳糖溶液和膠原蛋白磷酸鹽緩衝液(pH＝7.8)，按照體積比1:3比例混合均勻，-20℃冷凍乾燥48小時後，將該混合物按照質量分數0.1％的比例分散於1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽離子液體中，之後將離子液體溫度升至150℃，反應5分鐘；
(2)反應完畢後，將上述離子液體溫度降至60℃，分別加入ε-己內酯單體和豬胰脂肪酶，通氮氣密封后將其置於溫度為100℃恆溫振蕩反應器中反應1小時；
(3)向上述產物中加入2倍產物體積的二氯甲烷，之後用濾紙過濾掉豬胰脂肪酶，再向濾液中加入10倍濾液體積的-20℃冷甲醇，於-20℃環境中靜置24小時後過濾，得到粗產物；
(4)以丙酮為溶劑對上述粗產物抽提24小時，得到美拉德產物改性聚己內酯。
經上述方法得到美拉德產物改性聚己內酯，經計算其接枝效率約為63％，對其壓片後進行接觸角測試，顯示其水滴潤溼接觸角為50°，MTT法檢測表明細胞存活率90％以上。
實施例4：
(1)分別配製1％質量分數的乳糖溶液和膠原蛋白磷酸鹽緩衝液(pH＝7.8)，按照體積比1:3比例混合均勻，-20℃冷凍乾燥48小時後，將該混合物按照質量分數0.1％的比例分散於1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽離子液體中，之後將離子液體溫度升至60℃，反應240分鐘；
(2)反應完畢後，將上述離子液體溫度降至60℃，分別加入ε-己內酯單體和南極假絲酵母脂肪酶B，通氮氣密封后將其置於溫度為60℃恆溫振蕩反應器中反應144小時；
(3)向上述產物中加入2倍產物體積的二氯甲烷，之後用濾紙過濾掉南極假絲酵母脂肪酶B，再向濾液中加入10倍濾液體積的-20℃冷甲醇，於-20℃環境中靜置24小時後過濾，得到粗產物；
(4)以丙酮為溶劑對上述粗產物抽提24小時，得到美拉德產物改性聚己內酯。
經上述方法得到美拉德產物改性聚己內酯，經計算其接枝效率約為72％，對其壓片後進行接觸角測試，顯示其水滴潤溼接觸角為58°，MTT法檢測表明細胞存活率85％以上。
對照實施例1：
將實施例1的步驟(1)的離子液體用水溶液替代，反應得到美拉德產物，然後再將產物分散於離子液體中，其他步驟和參數與實施例1一致。結果顯示：該法得到美拉德產物顏色較淺，這說明還原糖對膠原蛋白接枝程度較低，採用該產物進一步反應得到的改性聚己內酯，經計算其接枝效率約為58％，對其壓片後進行接觸角測量，結果顯示其潤溼接觸角為70°，MTT法測定的細胞存活率為75％左右，均不及離子液體中得到美拉德產物改性聚己內酯好。以上這一結果說明在離子液體中美拉德反應比水溶液中要更高效，得到的產物的潤溼性和細胞親和性能也更好。
對照實施例2：
將實施例1的步驟(1)省略，直接將乳糖分散於1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽離子液體中，其他步驟和參數與實施例1一致。結果顯示：該法得到的乳糖改性聚己內酯，其接枝效率約為47％，壓片法測定的潤溼接觸角為60°，MTT法測定的細胞存活率為70％左右，均不及美拉德產物改性聚己內酯好。以上這一結果說明美拉德產物的潤溼性和細胞親和性能也更好。
對照實施例3：
將實施例1的步驟(1)省略，直接將膠原蛋白分散於1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽離子液體中，其他步驟和參數與實施例1一致。結果顯示：該法得到膠原蛋白改性聚己內酯產物量較少，經計算其接枝效率約為4％，壓片法測定的潤溼接觸角為74°，MTT法測定的細胞存活率為70％左右，均不及美拉德產物改性聚己內酯好。這說明在膠原蛋白分子上若不引入含有伯羥基的小分子還原糖，脂肪酶無法以膠原蛋白為底物完成對聚己內酯的催化開環聚合反應，大部分己內酯單體被催化成為聚己內酯均聚物。
雖然本發明已以較佳實施例公開如上，但其並非用以限定本發明，任何熟悉此技術的人，在不脫離本發明的精神和範圍內，都可做各種的改動與修飾，因此本發明的保護範圍應該以權利要求書所界定的為準。