改進的dna聚合酶活性測定和允許檢測活微生物的方法

2023-05-23 09:02:26

改進的dna聚合酶活性測定和允許檢測活微生物的方法
【專利摘要】公開了一種執行用於檢測包含活性DNA聚合酶的樣本基質內的微生物體的存在性或者數量的診斷測定的方法。該方法利用DNA聚合酶延伸活性的測量結果，其中所述測定包括步驟：利用選擇的適當底物孵育樣本基質中的DNA聚合酶，以及經由使用選擇的適當核酸探針執行PCR循環和檢測，從而檢測樣本基質中的內源性DNA聚合酶延伸活性，作為所述微生物體的存在性或者數量的指示。
【專利說明】改進的DNA聚合酶活性測定和允許檢測活微生物的方法
[0001] 相關申請的交叉引用
[0002] 本申請是非臨時申請，其需要通過引用在此合併2012年1月5日提交的美國臨時 申請No. 61/583, 568並且要求該臨時申請的優先權。
[0003] 發明背景
[0004] 本節中且在整個本公開中使用的參考編號引用本文的"參考文獻" 一節中闡述的 文獻。
[0005] DNA聚合物活性對於基因複製和跨所有生物域的生物體傳播是必不可少的 (1-3)。自從其初始表徵（4)以來，體外駕馭DNA聚合酶活性的能力已經變成分子生物學研 究領域的基本工具（5)。超越其在研究中確立的重要性，DNA聚合酶活性的體外測量潛在地 在製藥和臨床設置中提供了眾多的有用應用。例如，由於細菌DNA聚合酶正積極地作為用 於開發新的抗微生物劑的靶出，7)，因而能夠測量DNA聚合酶活性的快速且靈敏的測定是 所希望的。再者，DNA聚合酶活性的損失或增益密切地涉及人類疾病。例如，DNA聚合酶活 性與基因畸變之間出現的聯繫將酶指定為用於抗癌治療的靶（8,9)。DNA聚合酶活性的不 足也與線粒體病相聯繫（10)。此外，DNA聚合酶活性的測量具有用作一種快速且靈敏的診 斷工具的可能性，該診斷工具能夠在其中期望無菌的給定環境或者生物基質中檢測攜帶活 性DNA聚合酶的幾乎任何生物體。
[0006] 用來體外測量DNA聚合酶活性的最常見方法取決於放射性標記的核苷酸的摻入 (11)。然而由於與放射性同位素關聯的內在的風險和限制的原因，這樣的DNA聚合酶測定 的常規使用是不合需要的。因此，在過去數十年，開發了許多非放射性體外聚合酶測定。一 些依賴於由PicoGreen?到雙鏈DNA的結合（13,14)或者DNA單鏈結合蛋白質（12)的DNA 聚合酶介導的釋放而生成的螢光的測量結果。其他方法依賴於螢光標記的核苷酸的微板耦 合和檢測（15)。近來，開發了基於分子信標（16)和基於電化學（17)的DNA聚合酶測定。 儘管成功地避免了放射性的使用，但是上面的測定受到這樣因素的限制，這些因素例如差 的靈敏度、小的線性動態測量範圍或者使用純化的聚合酶。
[0007] 相關領域技術人員將會清楚明白的是，依照本文描述的本發明測量DNA聚合酶延 伸活性代表一種具有非常廣泛的應用的有用工具，這些應用例如但不限於體外篩選候選聚 合酶抑制劑，或者在各種各樣的樣本類型內檢測任何微生物（microbe)(攜帶活性DNA聚合 酶）的存在性。這是相對於現有技術的重大改進，因為如果預期用於這些目的，那麼摻入 放射性標記的核苷酸的傳統聚合酶測定的常規使用是沒有吸引力的。因此，在最近幾十年 開發了許多非放射性DNA聚合酶延伸測定。儘管成功地避免了放射性的使用，但是當前的 基於螢光的DNA聚合酶測定也遭受各種不同的缺陷。例如，經由若干現有的非放射性測定 檢測DNA聚合酶活性取決於PicoGreen?到新生成的雙鏈DNA的結合（13,14)。如果預期 根據新近裂解的生物體分析DNA聚合酶活性，那麼基於PicoGreen?的測定很可能將經由 PicoGreen?到基因組DNA的結合而受到背景螢光的阻礙。也開發了基於微板的DNA聚合 酶測定。出於許多原因，可以預期基於微板的測定的靈敏度降低，這些原因包括依賴於產品 或底物到微板的中間結合和/或被DNA聚合酶改性的dNTP的低效摻入。近來，描述了經由 分子信標對於DNA聚合酶活性的實時測量（16)。儘管改進了靈敏度，但是分子信標螢光的 直接測量可能也潛在地受到暴露於粗（crude)細胞裂解物的妨礙。


【發明內容】

[0008] 本發明改進了如上面所描述的【背景技術】的技術，並且提供了一種快速、高度靈敏 和定量的測定，其能夠從純化的酶或者直接從包括粗製微生物裂解物的微生物裂解物測量 DNA聚合酶延伸活性。如本文所描述的發明提供了一種朝著給定樣本基質內潛在地任何包 含活性DNA聚合酶的微生物體（microorganism)的靈敏檢測的顯著且意外的進步。本發明 涉及用於酶模板生成和擴增（ETGA)的方法。因此，本文描述了基於耦合到定量PCR讀出器 的DNA聚合酶延伸活性的測量的新穎ETGA方法的第一表徵。對於本文的公開內容的其餘 部分，由本發明提供的這種類型的診斷測定稱為DPE-PCR。本發明的DPE-PCR測定可以用來 測量低水平的純化酶並且能夠直接從微生物細胞裂解物檢測內源性DNA聚合酶延伸活性。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0009] 圖1為依照本發明的優選DPE-PCR診斷測定的示意性概覽，並且其中：（步驟A) 利用由預先退火的寡核苷酸（Oligo)-l和01ig〇-2組成的底物孵育DNA聚合酶。（步驟B) 在37°C下的20分鐘孵育期間，DNA聚合酶僅僅延伸Oligo-Ι的3'端。（步驟C)隨後將 3 μ L的反應混合物置於包含尿嘧啶DNA糖苷酶（UDG)的熱啟動qPCR反應中。在激活Tag 之前，M)G降解Oligo-2內的脫氧尿苷，只留下Oligo-1衍生的聚合酶介導的延伸的單鏈產 物。（步驟D)在激活Taq之後，經由結合到Oligo-Ι延伸產物的引物起始擴增。（步驟E) 經由Tagman探針的PCR循環和檢測。
[0010] 圖2為使用依照本發明一個優選實施例的DPE-PCR的純化DNA聚合酶的靈敏檢測 的示意性表示，並且其中：(A)在每次反應2xl(T 5個單位（U)處開始以10倍增量向下至每次 反應2xl(TnU重複測定商業來源的DNA聚合酶I。對於每個聚合酶加樣水平和無加樣對照 (NIC)示出了代表性DPE-PCR曲線。（Β)根據取自兩個獨立實驗的每個聚合酶加樣水平η = 4個數據點構造曲線圖，並且執行線性回歸分析。（C)包含2xl(TU的DNA聚合酶I的重複 三次的反應，與NIC相比較測定Klenow、Klenow(Exo-)和大腸桿菌DNA連接酶。對於每種 測定的酶和NIC給出代表性DPE-PCR曲線。（D)在包含dNTP混合物的反應物中將DPE-PCR 信號與dCTP或ddCTP比較，代表用於在DNA底物中摻入dCTP或ddCTP的可用位點的示意 圖鄰近DPE-PCR曲線給出。
[0011] 圖3為將珠裂解耦聯到依照本發明一個優選實施例的DPE-PCR的示意性概覽。
[0012] 圖4為依照本發明的DPE-PCR的執行如何經由測量粗裂解物中的DNA聚合酶延 伸活性而允許革蘭氏陰性和革蘭氏陽性細菌的靈敏和定量檢測的圖形表示，並且其中：(A) 將數量減少的大腸桿菌cfu插入珠裂解耦聯的DPE-PCR中。無加樣對照（NIC)也被包括以 便監視試劑背景水平。所有cfu示蹤（spike)和NIC重複進行三次。在下面對於每個細菌 加樣水平示出代表性DPE-PCR曲線。在獲得置於每個反應中的實際cfu的更高估計的努力 中執行菌落計數平板培養（plating)和gsPCR，並且在補充圖3中給出。（B)給出大腸桿菌 DNA聚合酶活性和線性回歸分析的曲線圖。圖形使用從範圍為lxlO5 - lxlOkfu的細菌示 蹤物的三次重複反應獲得的平均Ct值生成。（C和D)完全如上面針對在獲得置於每次反應 中的實際Cfu的更高估計的努力中執行的大腸桿菌計數平板培養和gsPCR所描述的，對於 金黃色葡萄球菌執行cfu滴定實驗。
[0013] 圖5示出了由依照本發明另一個優選實施例的DPE-PCR檢測細菌的圖形表示， 並且其中：㈧將5yL的大腸桿菌懸浮液添加到由包含50μΜ dCTP或者50μΜ ddCTP 的dNTP混合物組成的珠裂解耦聯的DNA聚合酶測定。給出了表示大腸桿菌衍生的DNA 聚合酶活性的DPE-PCR曲線。如通過平板培養所確定的近似cfu加樣在qPCR曲線圖的 左上區域中給出。（B)將5yL的大腸桿菌懸浮液添加到包含由具有50μΜ dCTP或者 50 μ M ddCTP的dNTP混合物組成的50 μ L反應緩衝液的珠裂解管。在裂解之前，將1 μ L dCTP[2. 5mM0. 25mM0. 025mM0. 0025mM]添加到包含選擇的ddCTP的反應中。並行地運行單獨 包含dCTP或者單獨包含ddCTP的反應，作為"非終止"和"終止"比較器。給出表示大腸杆 菌衍生的DNA聚合酶活性的所得到的DPE-PCR曲線。如通過平板培養所確定的近似cfu加 樣在qPCR曲線圖的左下區域中給出。（C)也在用於圖2B中給出的DNA聚合酶檢測的相同 裂解物上執行特定於大腸杆據基因的PCR。示出了細菌DNA聚合酶檢測的依賴於dCTP的拯 救與基因組DNA的gsPCR的關係的線性曲線圖。曲線圖使用來自所指示的條件下的三次重 復反應的平均qPCR Ct值生成。（D-F)完全如上面對於大腸桿菌所描述的對於金黃色葡萄 球菌執行ddCTP終止和dCTP拯救實驗。
[0014] 圖6為其中DPE-PCR為響應於熱處理的大腸桿菌生存能力的指示物的本發明另一 個實施例的圖形說明，並且其中：(A)在25°〇、45°〇、651：、851：和1051：下孵育20(^1^等份 試樣的大腸桿菌懸浮液（?2000cfu/μ L) 20分鐘。在加熱之後，將每個細菌儲備液（stock) 冷卻到室溫，並且將5 μ L轉移至珠裂解耦聯的DPE-PCR測定。給出表示每個所指示的溫 度處理之後的大腸桿菌衍生的DNA聚合酶活性的DPE-PCR曲線。（B)曲線圖根據大腸桿菌 懸浮液的所指示的溫度處理之後三次重複的DPE-PCR反應和（來自相同裂解物的）基因組 DNA的gsPCR而生成。也對於每個處理的大腸桿菌懸浮液重複三次執行並行的平板培養。 曲線圖下面給出了代表性cfu監視平板，其揭示了在每個溫度下處理之後的細菌生存能力 狀態。（C)響應於不同溫度處理，將DPE-PCR與基因組DNA的gsPCR比較。使用所指示的方 程計算" qPCR信號的成倍減小"，並且將獲得的值用於生成比較條形圖。
[0015] 圖7為其中DPE-PCR為響應於熱處理的金黃色葡萄球菌生存能力的指示物的本 發明另一個實施例的圖形說明，並且其中：仏）在251：、451：、651：、851：和1051：下孵育 200 μ L等份試樣的金黃色葡萄球菌懸浮液（?2000cfu/ μ L) 20分鐘。在加熱之後，將每 個細菌儲備液冷卻到室溫，並且將5 μ L轉移至珠裂解耦聯的DPE-PCR測定。給出表示每個 所指示的溫度處理之後的金黃色葡萄球菌衍生的DNA聚合酶活性的DPE-PCR曲線。（B)曲 線圖根據金黃色葡萄球菌懸浮液的所指示的溫度處理之後三次重複的DPE-PCR反應和（來 自相同裂解物的）基因組DNA的gsPCR而生成。也對於每個處理的金黃色葡萄球菌懸浮液 重複三次執行並行的平板培養。曲線圖下面給出了代表性cfu監視平板，其揭示了在每個 溫度下處理之後的細菌生存能力狀態。（C)響應於不同溫度處理，將DPE-PCR與基因組DNA 的gsPCR比較。使用所指示的方程計算"qPCR信號的成倍減小"，並且將獲得的值用於生成 比較條形圖。
[0016] 圖8闡明了如本文所引用的表1，其中闡明了這樣的結果，這些結果示出依照本發 明教導的17個附加的臨床相關微生物種類的靈敏和線性的檢測。

【具體實施方式】
[0017] 在過去五十年，DNA聚合酶活性的體外測量已經變成一種必不可少的分子生物學 工具。用來體外測量DNA聚合酶活性的傳統方法由於使用放射性核苷酸的原因而不合需 要。已經開發了基於螢光的DNA聚合酶測定；然而，它們也遭受各種不同的限制。本文公 開了一種快速、高度靈敏和定量的測定，其能夠從純化的酶或者直接從微生物裂解物測量 DNA聚合酶延伸活性。當利用純化的DNA聚合酶測試時，發現該測定在展示卓越的線性（R2 = 0.992)的同時檢測少至2XKTnU的酶50個分子）。當耦聯到珠磨機裂解時，該測定 也能夠檢測下至至少10個菌落形成單位的加樣革蘭氏陽性或者革蘭氏陰性細菌的內源性 DNA聚合酶延伸活性，同時維持R2 = 0.999。此外，本文給出的實驗證據表明，如測定信號 與細菌菌落形成之間的可復現強烈一致性所展示的，DNA聚合酶延伸活性是細菌生存能力 的一種指示物。總之，本文描述的發明的新穎技術代表一種朝著給定樣本基質內潛在地任 何包含活性DNA聚合酶的微生物體的靈敏檢測的顯著進步。
[0018] 為了進一步說明本發明的前述概念和優點，提供以下實例說明本發明，但是這些 實例絕不應當被視為限制了本發明。
[0019] 實例
[0020] 材料和方法：
[0021] DNA底物製備
[0022] DNA底物（以及下文給出的qPCR引物）的序列根據先前用來經由T4DNA連接酶 測量細菌衍生的ATP(18)的DNA寡核苷酸（Oligos)進行調適（18)。簡言之，對Oligol和 01ig〇2 (參見圖1)預先退火併且稀釋到0. 01 μ Μ的工作濃度。
[0023] 使用商業聚合酶的DNA聚合酶活性反應
[0024] 在 Tris EDTA(T.E.)pH8.0 中將 DNA Pol I(NEB cat#M0209L)、Klenow(NEB cat#M0210S)和 Klenow exo(-)(NEB cat#M0212S)稀釋至所指示的 U/yL 儲備液。開始， 將每個濃度下的2 μ L DNA聚合酶儲備液置於包含以下成分的50 μ L聚合酶測定混合物 中：50μ M dNTP，20mM Tris pH8.0，10mM 硫酸銨，10mM 氯化鉀，2mM 硫酸鎂，1% BSA，0. 1% Triton，0. 1% Tween以及0. 001 μ Μ預先退火的DNA底物。對反應物進行短暫的渦旋振蕩， 並且置於37°C下20分鐘。在20分鐘之後，將3yL的每個反應立即置於定量PCR(qPCR)反 應中。
[0025] 通過qPCR檢測
[0026] 使用以下成分製備qPCR反應主混合物：LightCycler480主混合物（Roche cat#04707494001)，333nM 的每個引物，166nM 的靶探針（FAM)，166nM 的內參探針（TxRed) 以及1. 2U的UDG (Bioline cat#BI0-20744)。作為監視PCR抑制的工具，每個qPCR反應也包 括40個拷貝的競爭性內參DNA。對於每個qPCR反應，將3 μ L的DNA聚合酶反應物添加到 27 μ L的主混合物中，並且在SmartCycler (Cepheid, Sunnyvale CA)上如下運行兩步qPCR : 初始孵育40°C 10分鐘，50°C 10分鐘並且95°C 5分鐘（以便活化Taq)，接著95°C下5s的 變性和65°C下20s的退火/延伸循環45次。循環閾值（Ct)通過SmartCycler軟體使用出 現的qPCR曲線的2階導數分析自動地生成。
[0027] 細菌菌株和培養基
[0028] 在該研究中使用了金黃色葡萄球菌（Staphylococcus arueus) (ATCC25923)和大 腸桿菌（Escherichia coli) (ATCC25922)。培養物在腦心灌注液體培養基/瓊脂（Teknova) 中/上生長。圖5中列出了用於附加的17個測試的微生物體的ATCC參考編號和生長培養 基。
[0029] 珠磨裂解之後的細菌DNA聚合酶活性的檢測
[0030] 將金黃色葡萄球菌和大腸桿菌培養物生長為1. 0±0. 2的0D6(KI(近似lxl09cfu/ mL)。對於每種生物體，將lmL的培養物沉澱，並且在T. E.中洗滌三次。用T. E.連續稀釋 細菌懸浮液，並且將5 μ L的每個儲備液添加到包含50 μ L的裂解反應緩衝液的珠裂解反應 物中。對於每種生物體，重複三次執行lxl〇5至lxl〇°cfu/反應物的滴定曲線，包括沒有懸 浮液的三次重複反應（無加樣對照）。在添加5個細菌儲備液（或者無加樣對照）之後，在 2800rpm下對裂解/反應管珠研磨6分鐘，接著在37 °C下孵育20分鐘。在20分鐘的孵育 之後，將樣本加熱到95°C 5分鐘，並且移走以便在室溫下冷卻。然後，在12k X g下旋轉樣 本30秒，並且將3 μ L的每個反應物置於qPCR中。對五微升的每個細菌儲備液平板培養以 獲得更精確的cfu加樣水平。生物體特異性的PCR也在用於DNA聚合酶檢測的相同裂解物 上執行。圖2中列出了用於金黃色葡萄球菌和大腸桿菌基因的特異性PCR的引物和探針序 列。
[0031] 雙脫氧終止法實驗
[0032] 利用ddCTP終止純化的DNA聚合酶延伸活性：
[0033] 如上面所描述的利用包含 50μ M dCTP 或者 50μ M ddCTP(Affymetrix#77332) 的dNTP混合物準備DNA聚合酶測定反應。利用2xl(T9U的DNA聚合酶I (新英格蘭生物實 驗室#M0209)對包含dNTP混合物的反應物示蹤。反應物在37°C下孵育20分鐘，並且隨後 將3 μ L的每個反應物置於qPCR中。
[0034] 經由ddCTP的微生物檢測的消除：
[0035] 如上面所描述的生長、洗滌和稀釋金黃色葡萄球菌和大腸桿菌培養物。為了展示 微生物DNA聚合酶的ddCTP依賴性的終止，將5 μ L的細菌儲備液添加到包含具有50 μ Μ dCTP或者50 μ M ddCTP的50 μ L反應緩衝液的珠裂解管中。如上面所描述的執行裂解、孵 育和qPCR。對五微升的每個細菌儲備液平板培養以便確定更精確的cfu加樣水平。基因組 DNA的基因特異性PCR也在用於DNA聚合酶檢測的相同裂解物上執行。
[0036] 微生物檢測的dCTP拯救（rescue):
[0037] 如上面所描述的生長、洗漆和稀釋金黃色葡萄球菌和大腸桿菌培養物。將五微升 的細菌儲備液添加到包含具有50 μ M ddCTP的50 μ L反應緩衝液的珠裂解管。在裂解之前， 將2. 5mM、0. 25mM、0. 025mM、0. 0025mM下的1 μ L dCTP添加到包含ddCTP的反應物中。並行 地運行單獨包含50 μ M dCTP和單獨包含ddCTP的反應，作為"非終止"和"終止"比較物。 如上面所描述的執行裂解、孵育和qPCR。對五微升的每個細菌儲備液平板培養以便確定更 精確的cfu加樣水平。基因特異性的PCR也在用於DNA聚合酶檢測的相同裂解物上執行。 [0038] 活力評估實驗
[0039] 如上面所描述的生長、洗滌和稀釋金黃色葡萄球菌和大腸桿菌培養物。在25°C、 45°C、65°C、85°C和105°C下孵育（在T.E.中）近似2000cfu/yL的二百微升的細菌儲備液 20分鐘。在加熱之後，將樣本冷卻到室溫，並且將5 μ L的每個細菌儲備液添加到包含50 μ L 反應緩衝液的珠裂解管。如上面所描述的執行裂解、孵育和qPCR。也將（在不同溫度下處 理的）五微升的每個細菌儲備液添加到lmL的T.E.中並且為了菌落計數測定對50yL進 行平板培養。基因特異性的PCR也在用於DNA聚合酶檢測的相同裂解物上執行。
[0040] 結果和討論
[0041] 在本發明的發展中，著手開發一種快速、簡單、高度靈敏和定量的測定，其能夠測 量從純化的商業來源或者新近裂解的細胞衍生的DNA聚合酶延伸活性，這將改進前面描述 的現有技術的方法並且克服其缺點。圖1示出了將DNA聚合酶延伸活性耦聯到qPCR涉及 的機制的示意性概覽。值得注意的是，在Taq活化之前通過尿嘧啶DNA糖基化酶（UDG)移 除01igo2 (參見圖1的步驟C)，從而正好在PCR循環之前防止底物的非特異性延伸。先前 已經報導了一種將T4DNA連接酶活性與PCR擴增相聯繫的微生物檢測方法（18)，其包含與 我們的DPE-PCR測定的相似性並且是ETGA方法的另一個實例。然而，在本發明的發展期 間，旨在檢測依賴於NAD的DNA連接酶活性的這種方法的一個修改版本遭受各種不同的限 制（未公布的數據），導致如本文所描述的本發明的新穎的基於DNA聚合酶的方法的開發。
[0042] 純化的DNA聚合酶延伸活性的靈敏性和線性的檢測
[0043] 使用商業上可用的DNA聚合酶I執行實驗，確定DPE-PCR測定的近似分析靈敏度。 如圖2A中所示，在大範圍的加樣酶上實現DNA聚合酶I的檢測。事實上，實現了向下少至 2 Χ1(Γη個單位（U)的酶（等效於近似50個聚合酶分子）的DNA聚合酶I延伸活性的測量。 據我們所知，在現有的DNA聚合酶測定中，該水平的DNA聚合酶延伸活性的檢測是無與倫比 的。理論上，這種靈敏度水平可以允許實現單個微生物檢測，因為大腸桿菌被報導每細胞包 含近似400個DNA聚合酶I分子（11)。在用曲線圖表示來自檢測實驗的兩個獨立極限的數 據之後，回歸分析也表明DPE-PCR循環閾值（Ct)與加樣商業DNA聚合酶I的單位數之間的 強正線性相關性（圖2B)。在執行靈敏度和線性度實驗之後，重要的是確定DPE-PCR測定信 號是否獨立於內在的核酸外切酶活性。為此目的，我們隨後將通過2xl(T 7U的DNA聚合酶I 生成的信號與缺乏5' 一 3'核酸外切酶活性的DNA聚合酶I (Klenow)以及根據缺乏所有核 酸外切酶活性的酶的另一版本（Klenow exo-)生成的信號進行比較。為了附加的特異性和 背景信號確定，並行地測試無加樣對照（NIC)和2xl(T7U的大腸桿菌DNA連接酶。如圖2C 中所示，當與野生型DNA聚合酶I相比較時，檢測相似水平的Klenow和Klenow exo-，這提 供了 DPE-PCR測定信號來自DNA聚合酶依賴的延伸而不是內在的核酸外切酶活性得到的證 據。除了使用無核酸外切酶的聚合酶之外，我們著手進一步證明DPE-PCR測定信號從qPCR 之前DNA底物的DNA聚合酶依賴的延伸得到。由於摻入雙脫氧核苷酸是一種用於終止DNA 聚合酶鏈延伸活性的行之有效的方法（19,20)，我們選擇在我們的反應混合物內用雙脫氧 CTP(ddCTP)代替dCTP。圖2D中所示的示意圖揭示了可以通過DNA聚合酶摻入ddCTP的底 物內的第一可能位置。如果ddCTP摻入到該位置，那麼Oligol的延伸產物長度不夠qPCR 引物1的後續檢測（圖1)。如圖2D中所示，用ddCTP代替dCTP消除了由DNA聚合酶I生 成的信號，因此證明了 DPE-PCR測定信號依賴於qPCR之前底物的DNA聚合酶延伸。低拷貝 內部擴增對照的存在證實了 qPCR不受從DNA聚合酶測定試劑遺留的少量ddCTP的存在的 抑制（補充圖1C)。另外，我們感到重要的是要注意，在不存在加樣DNA聚合酶（無加樣對 照）的情況下我們零星地觀察到微弱但是可檢測的信號。由於DPE-PCR測定的敏銳的靈敏 度的原因，我們證明了微弱背景噪聲信號可以從若干潛在來源得到，這些來源例如但不限 於反應裝配之前試劑中存在的DNA聚合酶汙染物，在實驗設置期間由操作者引入的DNA聚 合酶和/或在Taq激活（未公布的數據）之前01ig〇2的不完全降解（圖1)。值得注意的 是，這些不規則的背景噪聲源可通過制定更加嚴格的試劑製備過程和良好的無菌技術而控 制。
[0044] 通過直接從細胞裂解物測量內源性DNA聚合酶延伸活性進行微生物的靈敏度通 用檢測
[0045] 除了檢測純化的聚合酶活性之外，非常需要一種簡單的測量微生物衍生的DNA聚 合酶活性的通用方法。如果實現的話，這種方法可以允許在積極生長的培養物中篩選候選 抗微生物劑，從而允許將DNA聚合酶延伸活性與生物體增殖相比較。另外，DNA聚合酶延伸 活性的測量結果可以用來針對任何攜帶活性DNA聚合酶的微生物體的存在篩選環境或生 物樣本。為此目的，我們開發了一種將微生物裂解耦聯到本發明提供的DPE-PCR測定的簡 單方法。如圖3中所示，將已知包含或者懷疑包含微生物的液體樣本添加到珠磨裂解管，使 其分裂並且立即轉變為DPE-PCR測定。我們選擇一種革蘭氏陰性細菌（大腸桿菌）和一種 革蘭氏陽性細菌（金黃色葡萄球菌）以證明我們的測定測量粗製細胞裂解物中的微生物衍 生的DNA聚合酶延伸活性的能力。如圖4A中所示，當與珠磨裂解相聯繫時，DPE-PCR測定 能夠檢測向下至且低於每裂解管10個菌落形成單位（cfu)的大動態範圍的加樣大腸桿菌。 也執行了向下至l〇cfu的加樣細菌的大腸桿菌檢測的線性回歸分析，並且其表明如0. 999 的R2值所指示的加樣cfu與DNA聚合酶延伸活性信號之間的強正線性相關性（圖4B)。並 行地運行菌落計數平板培養和特異特定於大腸桿菌基因的qPCR(gsPCR)，證實每次反應的 cfu加樣水平以及根據完全相同的裂解物監視完整的基因組DNA的能力。來自金黃色葡萄 球菌裂解物的DNA聚合酶延伸活性被檢測到相似加樣水平（圖4C)。繪製了金黃色葡萄球 菌檢測向下至l〇cfu的加樣細菌，並且也表明加樣cfu與DNA聚合酶延伸活性信號之間的 強線性相關性（R 2 = 0. 999,圖4D)。菌落計數平板培養和gsPCR並行地執行以便證實每個 珠裂解管中存在的金黃色葡萄球菌的數量以及可直接分析的基因組DNA的存在。用於大腸 桿菌和金黃色葡萄球菌的平板培養、gsPCR和DNA聚合酶活性結果的完整表格可以見圖3和 圖4。我們隨後測試DPE-PCR測定從十七個附加的臨床相關微生物體測量DNA聚合酶活性 的能力。如表1中所示，我們能夠從包括六個革蘭氏陰性細菌、六個革蘭氏陽性細菌和五個 念珠菌屬的所有十七個附加生物體檢測DNA聚合酶活性。這十七個附加微生物的檢測以檢 測的令人印象深刻的下限表現出與加樣cfu的強正線性相關性。迄今為止且沒有失敗地， 我們進行了類似的測試，並且檢測了總共31個不同的微生物種類（數據未示出）。上線性 動態範圍仍然有待完全表徵。圖8中給出了包含用於17個附加微生物中的每一個的並行 平板培養數據和DPE-PCR結果的更多結果。總之，這些數據支持以下意見：依照本發明教導 的DPE-PCR的執行具有用作用於在正常無菌環境下靈敏地檢測任何微生物的通用"平底鍋 (pan)"測試的可能性。
[0046] 如圖2D中所示，在反應混合物中用ddCTP代替dCTP代表一種用於在我們的測定 中阻斷依賴於DNA聚合酶的延伸活性的檢測的強大工具。為了證明從細菌示蹤物得到的信 號依賴於它們的DNA聚合酶延伸活性而不是裂解物中存在的其他內源性細菌酶活性，我們 設定比較使用包含（dATP，dTTP，dGTP，dCTP)的標準DNA聚合酶反應混合物與包含（dATP， dTTP，dGTP，ddCTP)的反應混合物從大腸桿菌和金黃色葡萄球菌獲得的DPE-PCR信號的實 驗。如圖5A中所示，當與標準反應混合物比較時，ddCTP的代替阻斷了生成從大腸桿菌cfu 示蹤物得到的信號（圖5A)。隨後，通過將來自包含100 % ddCTP (50 μ Μ)的反應混合物 中裂解的細菌的DNA聚合酶延伸活性與包含用增加數量的dCTP示蹤的50 μ MddCTP的的 DNA聚合酶活性進行比較而執行dCTP拯救實驗（參見用於拯救實驗的詳細描述的材料和方 法）。圖5B展示了增加數量的dCTP具有的對於從大腸桿菌裂解物得到的可量化DNA聚合 酶延伸活性的拯救效果。除了測量微生物DNA聚合酶延伸活性之外，並行地運行gsPCR以便 驗證等效數量的大腸桿菌存在於每個測定的裂解物中。圖5C中給出了 DNA聚合酶活性與 基因組DNA的存在性的圖形比較。隨後，利用金黃色葡萄球菌重複信號終止（經由ddCTP) 和dCTP拯救實驗，並且獲得相似的結果（圖OT-F)。包含用於大腸桿菌和金黃色葡萄球菌 二者的DPE-PCR和gsPCR數據的表格可以見諸圖6和圖7。提供qPCR內參值以證明帶入 qPCR中的低水平ddCTP不是抑制性的，並且因此對DNA聚合酶活性信號的消失不負責（圖 6A和圖7A)。總之，圖5中給出的數據強烈支持以下主張：DPE-PCR專門檢測微生物DNA聚 合酶延伸活性，並且信號不從經由不同於DNA聚合酶的酶活性的底物修飾而得到。
[0047] 作為細菌生存能力的指示物的DNA聚合酶延伸活性的測量
[0048] 傳統的用於確定細菌生存能力的方法依賴於特定微生物在固體培養基上的生長 和可視化（21)。儘管細菌生長和可視化是目前的行業黃金標準，但是傳統的cfu生存能力 確定方法由於cfu形成所需的時間長度的原因而不合需要。此外，在固體培養基上或者在 液體培養物中生長的能力可能從一種微生物到另一種微生物劇烈地變化，從而可能地限制 某些需要複雜營養苛求的生物體的檢測（22)。由於傳統方法的前述限制的原因，在各種各 樣的製藥（23)、環境、食品處理和臨床測試領域存在對於微生物生存能力的快速評估的不 斷增長的需求。因此，在快速評估給定基質內的微生物生存能力狀態的努力中開發了許多 分子學方法（24)。儘管快速且靈敏，但是檢測核酸的存在性的分子學方法經常缺乏對於細 胞生存能力的精確測量的表示。例如，由於細胞死亡之後核酸的存留，內源性DNA或RNA的 擴增是細菌生存能力的差的指示物（25, 26)。我們著手確定將DNA聚合酶延伸活性用作細 菌生存能力指示物的可行性。為此目的，設計了將不同的熱處理量之後作為細菌生存能力 的指示物的基因組DNA的PCR介導的檢測與DNA聚合酶延伸活性的檢測相比較的實驗。開 始時，在增加的溫度下處理大腸桿菌懸浮液達固定時間段。在熱處理之後，隨後對於DNA聚 合酶延伸活性和基因組DNA的存在性測定細菌。也並行地對熱處理的和未熱處理的細菌儲 備液平板培養以便經由可見cfu的存在性監視細菌生存能力。圖6A表示所指示的熱處理 量之後測量的大腸桿菌DNA聚合酶延伸活性的水平。值得注意的是，在45°C與65°C之間孵 育細菌懸浮液之後觀察到大腸桿菌DNA聚合酶延伸活性的顯著下降（圖6A)。形成對照的 是，從相同裂解物獲得的gsPCR信號在所有溫度下保持相對恆定，並且在圖6B中在圖形上 與DNA聚合酶活性相比較。曲線圖下面給出的平板培養結果進一步證明增加的熱處理水平 足以防止cfu形成並且與DNA聚合酶活性的急劇損失並行；然而，死亡細胞仍然促成基因組 DNA水平非常接近其原始加樣水平，這證實gsPCR是活細胞存在性的一種差的指示物（圖 6B)。在圖6C中，條形圖進一步突出了 DPE-PCR和gsPCR監視cfu響應於致命的熱處理量 而消失的相對能力。隨後，我們想要測試DNA聚合酶延伸活性的測量結果是否也可以用來 指示革蘭氏陽性生物體的生存能力狀態。先前的大腸桿菌實驗在相同的條件下利用金黃色 葡萄球菌重複。
[0049] 圖7A-C示出了從利用金黃色葡萄球菌重複的熱處理實驗獲得的相似結果。總的 來說，圖4、圖6、圖7和圖8的表1中所示的cfu的存在性與DNA聚合酶延伸活性之間的 強一致性證明了依照本發明執行的DPE-PCR具有用作細胞生存能力的一般指示物的可能 性，並且另外可以給出從暴露於旨在降低細胞增殖或生存能力的其他臨床或藥物相關製劑 (抑菌的和殺菌的）的微生物測量DNA聚合酶延伸活性的可能性。
[0050] 總而言之，依照本發明，開發了一種新穎、高度靈敏、定量且快速的DPE-PCR測 定。除了定量檢測極低水平的純化酶之外，我們證明了 DPE-PCR經由耦聯到珠裂解從小於 lOcfu的細菌可復現地測量DNA聚合酶延伸活性的能力。我們也通過測試一組由七個革蘭 氏陰性細菌、七個革蘭氏陽性細菌和五個念珠菌屬組成的微生物體證明了 DPE-PCR普遍地 檢測微生物的可能性。此外，DPE-PCR測定可以用來評估細菌生存能力的初步證據經由如 cfu的存在性所指示的增殖與DNA聚合酶延伸活性之間的可復現強相關性而提供。考慮本 文公開的數據，目前相信諸如如本文公開的優選DPE-PCR之類的本發明的新穎方法和技術 具有變成用於製藥學、環境、食品和臨床設置內的大範圍的測試應用的有用工具的可能性。
[0051] 貫穿本申請引用的所有參考文獻、專利和公開的專利申請的內容通過引用以仿佛 每個單獨的出版物、專利或專利申請被明確且單獨地指明通過引用而合併的相同程度合併 於此。
[0052] 前面的詳細描述僅僅為了清楚理解而給出，並且不應當據此推斷不必要的限制， 因為修改對於本領域技術人員將是明顯的。這裡沒有承認本文提供的任何信息都是現有 技術或者與當前要求保護的發明有關，或者明確地或隱含地引用的任何出版物都是現有技 術。
[0053] 除非另外限定，本文使用的所有技術和科學術語都具有本發明所屬領域的普通技 術人員通常理解的相同含義。
[0054] 儘管結合其具體實施例描述了本發明，但是應當理解的是，其能夠做出進一步修 改，並且本申請預期覆蓋總體上遵循本發明的原理以及包括這樣的落入本發明所屬領域內 的已知或習慣實踐且可以適用於之前闡述的基本特徵的與本公開內容的偏離的本發明的 任何變型、用途或者調適。
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【權利要求】
1. 一種執行用於通過測量DNA聚合酶延伸活性檢測包含活性DNA聚合酶的樣本基質內 的微生物體的存在性或者數量的診斷測定的方法，所述測定包括步驟：利用選擇的適當底 物孵育樣本基質中的DNA聚合酶，以及經由使用選擇的適當核酸探針執行PCR循環和檢測， 從而檢測樣本基質中的內源性DNA聚合酶延伸活性，作為所述微生物體的存在性或者數量 的指示。
2. 權利要求1的方法，其中DNA聚合酶延伸活性的測量結果是所述樣本基質中的細菌 生存能力的指不物。
3. 權利要求1的方法，其中樣本基質為血清。
4. 權利要求1的方法，其中樣本基質為血漿。
5. 權利要求1的方法，其中樣本基質選自由純化的酶、微生物裂解物和粗微生物裂解 物所組成的組。
6. 權利要求1的方法，其中所述測定特別地檢測微生物DNA聚合酶延伸活性，並且信號 不從經由不同於DNA聚合酶的酶活性的所述底物的修飾而得到。
7. 權利要求5的方法，其中在執行測定之前，該方法包括附加步驟：將已知包含或者懷 疑包含微生物體的微生物裂解物或者粗微生物裂解物添加到珠磨裂解管，使微生物細胞分 裂並且將分裂的細胞轉移至測定的孵育步驟。
8. 權利要求6的方法，包括另一步驟：在該方法的執行中在適當點處將阻斷劑添加到 樣本混合物以便確保測定特異地檢測微生物DNA聚合酶延伸活性，並且測定信號不從經由 不同於DNA聚合酶的酶活性的所述底物的修飾而得到。
9. 權利要求1的方法，其中樣本基質為生物樣本。
10. 權利要求1的方法，其中樣本基質為環境樣本。
【文檔編號】C12Q1/68GK104066853SQ201380004900
【公開日】2014年9月24日 申請日期:2013年1月3日 優先權日:2012年1月5日
【發明者】肖恩·馬克·奧哈拉, 丹尼爾·茲威特澤格 申請人:宙斯科學有限公司