利用平面波導管定量測定酶活性的製作方法

2023-05-23 09:07:56 1

專利名稱：利用平面波導管定量測定酶活性的製作方法
技術領域：
本發明涉及定量酶活性的方法。
附圖簡述

圖1.採用螢光標記的平面波導管技術圖示。
圖2.用於利用螢光酶底物的「水解切斷模式」中的平面波導管技術圖示。
圖3.用於利用螢光酶底物的「反應轉化模式」中的平面波導管技術圖示。
圖4.用於利用螢光標記的「偶聯模式」的平面波導管技術圖示。
圖5.用於利用螢光酶底物的「空間排阻模式」的平面波導管技術圖示。
圖6.用於利用螢光酶底物的「細胞分離模式」的平面波導管技術圖示。
發明詳述本發明提供了採用平面波導管技術以靈敏而且定量地測定酶活性的酶活性傳感器。本發明的酶活性傳感器具有許多優點，包括小規模的操作，速度，靈敏度，特異性，並易於生產。該傳感器可用於任何需要測定酶活性的環境下，並且能夠在複雜的流體系統中檢測酶活性而不用純化樣品。如果需要，可以並行地進行多個酶測定。
平面波導管本發明的酶活性傳感器含有平面波導管，其包括用於一種或多種酶的一種或多種底物。平面波導管典型地包含一層具有高折射率的材料(例如Ta2O5或者TiO2)薄膜，沉積於低折射率的透明支持物上(例如玻璃或聚合物)。製造平面波導管層的方法在本領域是公知的，並且可以使用任何已知的方法。參見，例如美國專利5959292；美國專利6078705；美國專利5846842；Rowe-Taitt等，Biosensors Bioelectronics 14，785-94，2000。
在平面波導管上酶底物的固定將被測試酶的底物固定在平面波導管上。固定蛋白質的方法在本領域是公知的，並且可以用任何一種這類方法來將酶底物固定在檢測區域上。參見，例如，Scouten等，Trends in Biotechnology 13，178-85，1995；Shriver-Lake等，Biosensors and Bioelectronics 12，1101-06，1997；Rowe-Taitt等，2000。所選擇的方法在一定程度上依賴於該特定酶底物的性質，並且是本領域的技術人員所公知的。典型地，底物通過共價鍵直接固定在平面波導管層上或者經化學修飾平面波導管表面，例如經過矽烷化或施加聚合物層之後再固定。如果需要的話，可以將一層薄的間隔層(例如SiO2)直接加到平面波導管層上，以用作促粘合層從而有助於在該波導管上酶底物的固定。
在另一些的實施方案中，平面波導管層塗覆有抗生物素蛋白，酶底物可以偶聯於對抗生物素蛋白有很強親和力的生物素部分。參見Rowe-Taitt等，2000。在另一些實施方案中，波導管塗覆有由聚異丁烯醯肼構成的水凝膠膜，其中聚異丁烯醯肼經處理生成游離的馬來醯亞胺基；將一些酶底物氧化生成反應性硫醇基，之後與馬來醯亞胺基反應。還有另一些實施方案中，矽烷化的波導管表面塗覆有由乙二胺基衍生的聚乙二醇。這些基團也能與氧化的酶底物反應。
非共價的相互作用也可用於將底物固定在平面波導管上。這種相互作用包括，但不限於，疏水吸附、範德華作用、氫鍵合、和靜電力。
如果使用塗層，其優選加到平面波導管上能獲得可再生的，恆定的層厚度。典型的可用於塗覆平面波導管的方法的實例包括噴塗、刮刀塗布、旋塗，或者浸漬塗布。可以通過任何適當的方法對塗覆進行質量控制，包括顯微鏡法、幹涉測量法、橢圓測量法以及接觸角測量法。
不同的酶底物可固定在平面波導管上的不同且互斥的區域。底物優選設置成空間可尋址陣列。例如，波導管表面上可具有多個板孔或通道以便可以對對照和樣品溶液的可檢測標記進行同時比較。任選地，可以在波導管周圍邊緣的大部分塗覆反射塗層以防止光線從邊緣洩漏，這樣能增強漸逝場的亮度。還可以製備空間可尋址陣列作為區域或點用以檢測單個流體樣品內的多種酶活性。
可檢測標記在下面描述的一些實施方案中，酶底物含有可檢測的標記。在另一些實施方案中，酶活性改變了底物從而包含可檢測的標記。用於本發明的可檢測標記典型的是光反應標記，例如螢光標記、磷光標記、和紫外線吸收標記。螢光標記尤其適用，因為場對螢光團的激發不需要大量的流體透過幅射，從而限制了背景信號，提高了靈敏度。在多肽和其它酶底物上連接可檢測標記的方法在本領域是公知的。
合適的標記包括羅丹明、螢光素衍生物、香豆素衍生物、聯苯乙烯聯苯類，芪衍生物，酞菁染料、naphthalocyanines、聚吡啶基-釕配合物如三(2，2』-二吡啶基)-氯化釕、三(1，10-菲咯啉)氯化釕、三(4，7-二苯基-1，10-菲咯啉)氯化釕以及聚吡啶基-吩嗪-釕複合物，鉑-卟啉配合物如八乙基-鉑-卟啉，長壽命銪和鋱配合物或花青染料。吸收和發射波長在600-900nm的範圍內的染料尤其適合用於分析血液或血清。
尤其適用的可檢測標記是染料，例如含有官能團的螢光素衍生物，通過該官能團其可以共價連接到底物上，例如異硫氰酸螢光素。同樣十分適用的還有功能性螢光染料，可購自Biological Detection Systerms Inc.，例如單和雙功能的CY5.5TM染料，Clinical Chemistry 40，1819-22，1994。如果需要的話，用於不同酶的底物可以含有不同的可檢測標記。
酶活性傳感器的實例本發明的酶活性傳感器可用在一些不同的「模式」中。根據所使用的模式，酶底物可以包含或不包含上述的可檢測標記。同時根據所使用的模式，酶活性檢測可以涉及檢測可檢測標記的量的減少或者增加。
例如，含有經可檢測地標記後的底物的酶活性傳感器可用於「水解切斷模式」。在這種模式下，酶將底物從平面波導管表面切下，所減弱的信號就反映出酶的活性。參見圖2。
另一些酶底物含有被酶修飾成可檢測標記或者是不再能檢測到的標記的部分(「反應轉化模式」)。如果酶修飾該部分使它產生可檢測標記，則增強的信號反映出酶活性。另一方面，如果酶修飾該部分使它不再能檢測到，則減弱的信號反映出酶活性。參見圖3。
而在另一些實施方案中，酶將可檢測標記偶聯到酶底物上(「偶聯模式」)。參見圖4。在這些實施方案中增強的信號反映出酶活性。
在一些實施方案中，通過在空間上分離不同的酶底物，例如通過空間位置、離子、或疏水作用的機制(「空間排阻模式」)，可以用底物連接或間隔結構來增強對目標酶活性的選擇性。參見圖5。這些機制尤其適用於本發明的酶活性傳感器，因為空間定位可檢測分子的標記部分的能力使得可以控制檢測過程的靈敏度，因為漸逝場的亮度與到平面波導管傳感器表面的距離成指數式衰減。Shriver-Lake等，1997。
例如，使用不同長度的間隔物可以平衡多重測試中不同位點的螢光信號。類似地，由於酶反應的位點也能通過相同的因子來控制，因此在存在多種潛在反應分子的情況下，可以實現對一些特定反應的增強或消除。
任何上述實施方案都可用於原位細胞培養中，以檢測細胞分泌酶的培養基(「細胞分離模式」)。參見圖6。在這種情況下，通過大孔聚合物層，例如親水性聚合物(例如多羥基化甲基丙烯酸酯或者多糖)，酶活性傳感器可從細胞群，或單個細胞中分離出來。細胞分離模式允許在生理學條件下，不需細胞與底物或可能的反應產物接觸，而檢測由活細胞分泌的酶。許多酶活性檢測系統是不與活細胞相容的。因而該實施方案是對現有技術的改進，因為該反應體系能夠用於檢測那些有毒的或者對細胞存在不利影響的酶的活性。細胞分離模式還可以在不由於輻射而潛在改變細胞的生物學性質的條件下進行測量。
酶活性傳感器的應用這裡所公開的酶傳感器可用於任何需要對酶活性進行定性或定量測定的裝置中。可以檢測任何類型的酶的活性，包括但不限於，蛋白水解酶(例如，氨基肽酶，天冬氨醯蛋白酶，絲氨酸蛋白酶，金屬蛋白酶，半胱氨醯蛋白酶，胃蛋白酶，胰蛋白酶，凝血酶，溶菌酶，因子VIIIC)，糖苷酶，酯酶，水解酶，核酸酶，合成酶，異構酶，聚合酶，激酶，磷酸酶，還原酶，包括氧化還原酶，轉移酶，連接酶，限制酶，醯胺酶，ATP酶，糖酶，脂肪酶，纖維素酶，脫氫酶，和氧化酶。這些酶的底物在本領域是公知的並可在許多供應商處購得。
本發明的酶活性傳感器尤其適於用作診斷工具，因為其可以原位地、高度多重性地實時研究複雜的生物酶系統。尤其是，這些傳感器可以實時監控酶活性，甚至於在混濁流體中，例如未經樣品製備的血清或血液。因此該傳感器在看護環境下很容易被用作快速診斷工具。
在臨床設備中，與平面波導管相接觸的流體是生物來源的，包括但不限於，血液、血漿、尿、腦脊液、唾液、支氣管灌洗液、房水、腹水、血管外肺積水、濾泡液、迷路液、內淋巴、外淋巴、淋巴、乳糜(chyle)、鼻灌洗液，以及滑液。這些流體還可以是其中培養了來自於患者的細胞的培養基。
臨床中關注的酶包括，例如，澱粉酶和脂肪酶(胰腺疾病)；肌酐激酶、乳酸脫氫酶、α-羥丁酸脫氫酶、血清穀草轉氨酶、和肌酸磷酸激酶(心臟病發作、肌肉疾病和中風)；氨基丙氨酸轉移酶、血清穀草轉氨酶、血清谷丙轉氨酶、和乳酸脫氫酶(肝病)；鹼性磷酸酶(肝或腎病)；血管緊張素轉化酶(活動的結節病、非典型分支桿菌、原發性膽汁性肝硬化、高雪氏症、或麻風病)；因子VIIIC(血友病)；腎素(腎血管性高血壓)；半乳糖-1-磷酸鹽尿苷醯轉移酶(半乳糖血症)；葡糖腦苷脂酶(高雪氏症)；以及生物素化酶(生物素化酶缺乏症)。
本發明的酶活性傳感器還可用於商業或研究設備中，用以監測大或小規模酶純化過程中的酶活性。其可用於監測發酵培養基中的酶活性。其可用於檢測公眾健康危害，例如用於檢測診斷致病細菌、病毒和真菌的酶。本發明的酶活性傳感器還可用於對可降低特定酶活性的治療劑的高通量篩選測定中。
可檢測標記的生成和檢測本發明的酶活性傳感器可以取非常少的液體層樣品用於可檢測的標記，其中採用了由平面波導管內雷射束反射產生的漸逝場。該漸逝場延伸入液體中大約100nm，強度呈指數式衰減；因此，不能檢測到該場外部的可檢測標記。參見圖1。
將含有被測定酶的流體設置成與所述平面波導管接觸。接觸可以是靜態的，也可以使流體通過平面波導管的上方。將偏振光，最常見的是來自於雷射光源如小型二極體雷射器的偏振光，通過全反射引導到波導層的界面上。通過光的內部反射在波導管邊界處的不同折射率材料之間的界面處產生漸逝的波或場。漸逝場的強度依賴于波導層本身的厚度以及波導層和周圍介質的折射率之比。在薄波導管的情況下，即其層厚度等於或小於被傳導的波長時，可以區分出被傳導光的離散模式。
在平面波導管的光學上更薄的介質中，但僅僅是在直接鄰近於被傳導光波的地方，漸逝場激發發光。用於檢測該漸逝激發的發光的方法和設備是本領域公知的，並且描述於例如，美國專利4582809，美國專利5081012，WO 90/06503，和Biosensors Bioelectronics 6(1991)，595-607中。可採用光電二極體、光電電池、光電倍增管、CCD照相機和檢測器陣列，例如CCD電池。所發出的光可以用光學元件例如鏡、稜鏡、透鏡、菲涅耳透鏡、以及梯度指數透鏡來成像。已知的元件例如濾光片、稜鏡、單色濾光片、雙色鏡，以及衍射光柵可用於選擇適當的發射波長。
本公開說明中所引用的所有專利、專利申請，以及參考文獻在此都特意引入全文作為參考。
權利要求
1.一種含有平面波導管的酶活性傳感器，其中包括酶的底物，其中(1)所述底物包含可檢測的標記；或者(2)所述酶的活性改變底物從而包含可檢測的標記。
2.權利要求1所述的酶活性傳感器，其中進一步包括檢測元件。
3.權利要求1所述的酶活性傳感器，其中所述底物包含可檢測的標記。
4.權利要求1所述的酶活性傳感器，其中所述酶的活性改變底物從而包含可檢測的標記。
5.權利要求1所述的酶活性傳感器，其中所述可檢測的標記為光反應標記。
6.權利要求5所述的酶活性傳感器，其中所述光反應標記選自下組螢光標記、磷光標記、和紫外線吸收標記。
7.權利要求1所述的酶活性傳感器，其中所述可檢測標記為螢光部分。
8.權利要求1所述的酶活性傳感器，其中所述底物包括間隔結構。
9.權利要求1所述的酶活性傳感器，其中所述酶選自下組醯胺酶、酯酶、氧化酶、還原酶、聚合酶、轉移酶、連接酶、限制酶和蛋白酶。
10.權利要求1所述的酶活性傳感器，其中包括多種底物。
11.權利要求10所述的酶活性傳感器，其中底物中的至少兩種是不同酶的底物。
12.權利要求11所述的酶活性傳感器，其中第一種底物含有第一種間隔結構，以及其中第二種底物含有將第一種和第二種底物在空間上隔開的第二種間隔結構。
13.權利要求10所述的酶活性傳感器，其中所述底物設置成空間可尋址陣列的形式。
14.一種檢測酶活性的方法，包括步驟(a)在允許酶與底物作用的條件下，將權利要求1所述的酶活性傳感器的平面波導管暴露於試樣；(b)照射所述平面波導管以產生漸逝場；(c)檢測所述漸逝場中可檢測標記的存在。
15.權利要求14所述的方法，其中所述底物包含可檢測的標記。
16.權利要求15所述的方法，其中所述酶的活性使所述可檢測標記從底物釋放。
17.權利要求15所述的方法，其中所述酶的活性降低了所述可檢測標記的可檢測性。
18.權利要求14所述的方法，其中所述酶的活性改變了所述底物從而包含可檢測標記。
19.權利要求18所述的方法，其中所述酶將所述可檢測標記偶聯到所述底物上。
20.權利要求14所述的方法，其中所述可檢測標記為螢光部分。
21.權利要求14所述的方法，其中所述底物進一步含有間隔結構。
22.權利要求14所述的方法，其中所述可檢測標記為光反應標記。
23.權利要求22所述的方法，其中所述光反應標記選自下組螢光標記、磷光標記、和紫外線吸收標記。
24.權利要求14所述的方法，其中所述酶活性傳感器包括多種底物。
25.權利要求23所述的方法，其中至少兩種底物是兩種不同酶的底物。
26.權利要求24所述的方法，其中第一種底物含有第一種間隔結構，以及其中第二種底物含有將第一種和第二種底物在空間上隔開的第二種間隔結構。
27.權利要求24所述的方法，其中所述底物設置成空間可尋址陣列的形式。
28.權利要求14所述的方法，其中所述試樣包括選自下組的流體血液、血漿、尿、腦脊液、唾液、支氣管灌洗液、房水、腹水、血管外肺積水、濾泡液、迷路液、內淋巴、外淋巴、淋巴、乳糜、鼻灌洗液，滑液、發酵培養基，以及細胞培養基。
29.權利要求14所述的方法，其中步驟(c)包括定量檢測。
30.權利要求14所述的方法，其中步驟(c)包括定性檢測。
全文摘要
含有平面波導管的酶活性傳感器可用於靈敏和定量地測定酶活性。這種酶活性傳感器適用於多種設備中，包括臨床、商業以及公眾健康設備。
文檔編號C12Q1/25GK1824796SQ20051011323
公開日2006年8月30日 申請日期2005年9月8日 優先權日2004年9月8日
發明者R·G·哈奇 申請人:美國拜爾公司