一種具有偶氮還原能力的新菌種及其應用的製作方法

2023-05-23 09:19:31

一種具有偶氮還原能力的新菌種及其應用的製作方法
【專利摘要】本發明公開了一株Sinibacillussoli?CGMCC?No.1.12538及其在偶氮染料金橙I還原脫色中的應用。本發明從熱帶雨林的土壤中分離純化得到一株Sinibacillussoli菌株GD05，其具有在厭氧條件下利用電子供體對偶氮染料金橙I進行還原脫色的作用，且脫色率可達到83%，是一種有效的處理偶氮染料廢水的生物體系，在水環境修複方面具有廣泛的應用前景。
【專利說明】一種具有偶氮還原能力的新菌種及其應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及一株新菌種及其在環境工程中的應用，具體涉及一株兼性厭氧菌GD05的分離鑑定，及其在偶氮染料還原脫色中的應用，屬於微生物系統分類和環境生物【技術領域】。
【背景技術】
[0002]偶氮染料廣泛應用於印染、食品、化妝品等行業，據估計，每年偶氮染料的產量為世界染料總產量的70%左右，是工業中染料用量最大的一類。廢水中殘存的染料組分即使濃度很低，排入水體也會影響光對水的透過性和水生生物的生長，破壞水體生態平衡。印染和染料廢水色度大；有機物濃度高，組分複雜；難生物降解物質多；含有大量的無機鹽、硫化物等，屬於難處理的工業廢水。多數染料為有毒難降解有機物，化學穩定性強，具有致癌、致畸、致突變的「三致」作用。目前處理染料廢水的工藝主要利用物理/化學方法，如吸附、沉澱、化學氧化、光降解和膜過濾等。這些方法對染料廢水的處理能力有限，能耗大、成本高，且容易造成二次汙染。因此，開發一種更為有效的處理偶氮染料廢水的生物體系引起人們的廣泛興趣。
[0003]近年來發展起來的微生物法處理印染廢水不僅能有效的進行偶氮染料脫色處理而且成本低，受到廣泛的關注。儘管好氧/厭氧條件下細菌對偶氮染料的還原脫色已有一定研究，然而，生物處理過程中大多數菌株的廣譜性較差，環境適應性能力較弱，脫色速度不能滿足實際廢水處理的要求。
[0004]芽孢桿菌科是一類產芽孢的革蘭氏陽性細菌，好氧或兼性厭氧生活，主要分布於土壤、植物體表面及水體中。由於芽孢桿菌科的細菌對熱、紫外線、電磁輻射和某些化學藥品等有很強抗性，因而很多特殊功能的芽孢桿菌科菌株已應用於工業、農業、醫學、軍事和科學研究等領域。此外，大量研究表明，芽孢桿菌科的細菌是多種環境中的偶氮染料脫色優勢細菌，因此，加強芽孢桿菌科新菌種的分離和保藏、發掘新的潛在的偶氮染料脫色菌種不僅對於微生物分類、鑑定工作具有積極意義，而且對於資源利用、水循環和生態修復有著重要意義。

【發明內容】

[0005]本發明的目的在於提供一株新菌種:Sinibacillus soli gen.nov., sp.nov.⑶05。
[0006]本發明的另一個目的在於提供上述菌株在偶氮染料還原脫色中的應用。
[0007]本發明的再一個目的在於提供一種含有兼性厭氧菌Sinibacillus soli gen.nov.，sp.nov.⑶05的偶氮染料還原脫色生物製劑。
[0008]本發明所採取的技術方案是:
申請人:將菌株保藏在位於北京市朝陽區北辰西路I號院中國科學院微生物研究所的中國普通微生物菌種保藏管理中心，保藏中心於2013年4月2日收到 申請人:提供的菌株。保藏中心給予該培養物的保藏號為CGMCC1.12538，建議的分類命名為Sinibacillus soli⑶05，已於2013年10月9日鑑定保藏的菌株是存活的。
[0009]本發明的有益效果是:
本發明的菌株Sinibacillus soli gen.nov.，sp.ηον.⑶05,在厭氧條件下可利用乙酸鈉、乳酸鈉、葡萄糖作為電子供體，對偶氮染料金橙I具有還原脫色作用，且脫色率可達到83%。本發明的菌株對染料廢水的處理能力大、能耗小、成本低，不容易造成二次汙染，不會破壞水體結構，是一種有效的處理偶氮染料廢水的生物體系，在水環境修複方面具有廣泛的應用前景。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0010]圖1為負染色菌株⑶05細胞的掃描電鏡圖，A為單個⑶05細菌圖，長有一些極性鞭毛，B為多個GD05細菌圖，有呈筆直的長杆狀，也有稍彎曲的長杆狀，即有單個細菌單獨生存，也有多個細菌首尾相連呈短鏈狀生存；
圖2基於16S rRNA基因序列相似度，採用Neighbor-joining法構建的菌株⑶05的系統發育樹；
圖3基於16S rRNA基因序列相似度，採用Minimum-evolution法構建的菌株⑶05的系統發育樹；
圖4菌株GD05極性脂肪酸的二維薄層色譜(TLC)圖，A為磷鑰酸鹽顯色檢測圖，B為鑰藍顯色檢測圖，DPG表示雙磷脂醯甘油，PG表示磷脂醯甘油，L表示未經鑑定的極性脂肪酸；圖5菌株在GD05不同電子受體下厭氧還原金橙I的情況；
圖6菌株GD05對不同初始濃度的金橙I的還原脫色能力。
【具體實施方式】
[0011]一、菌株⑶05的分離和富集
I)將IOg取自廣東省徐聞縣熱帶雨林的土壤樣品加入IOOmL0.85% (g/mL)NaCl溶液，攪拌30min後，進行梯度稀釋，塗布於TSA (pH7.2)培養基上，分別在50°C、60°C、70°C條件下進行培養。
[0012]2) 5天後，挑取單菌落，並塗布於新的TSA (pH7.2)培養基上，分別置於原來的溫度下繼續培養，進一步分離和純化菌體。
[0013]所述TSA培養基的組成是:胰蛋白腖17.0g/L，大豆蛋白腖3.0g/L，D (+)-葡萄糖 2.5g，NaC15.0g/L, Κ2ΗΡ042.5g，瓊脂粉 20g/L, pH 調節至 7.2。
[0014]3)重複步聚2)，直到獲得單克隆菌落，其中分離和富集得到的菌株⑶05在50°C和60°C下能生存。
[0015]二、菌株⑶05的形態特徵
O菌體形態特性
菌株⑶05為革蘭氏陽性菌，產球形或橢圓形端生芽孢；透射電子顯微鏡結果(圖1)顯不菌體呈直長杆狀或稍彎曲長杆狀，寬約0.3~0.4 μ m,長約1.4~2.9 μ m,有極性鞭毛用於運動，(如圖1A所示)；菌體即可以單獨存在，又可以與其他菌體首尾相連呈短鏈狀存在(如圖1B所示)。[0016]2)菌落形態特性
菌株⑶05在50°C條件下，TSA上培養48h後，菌落直徑約2mm，菌落呈圓形、稍微隆起、邊緣整齊、表面光滑。
[0017]三、菌株⑶05的分子分類地位
提取發明菌株⑶05的總DNA。以提取的DNA為模板，以通用引物27F和1492R擴增細菌的16S rRNA基因，將PCR擴增產物回收純化後進行測序，所得序列(1489bp)通? BLAST (http: //blast, ncb1.nlm.nih.gov/Blast.cgi) _ I:匕又寸工t匕又寸，結 ^
顯示，與菌株⑶05同源性相近的菌株都屬於芽孢桿菌科，分別是Ornithinibacilluscontaminans (相似性 94.9%), Ornithinibacillus bavariensis (相似性 94.5%)和Virgibacillus kekensis (相似性 93.9%)。Ornithinibacillus 屬和 Virgibacillus 屬的其他菌株及OceanobaciIIus屬的所有菌株與菌株⑶05的16SrRNA序列的相似性分別在93.9~93.6%,93.7~91.5%和93.6~91.6%範圍內。上述比對結果顯示新分離出的菌株GD05與所有芽孢桿菌科成員的相似性不超過95%。
[0018]通過 EzTaxon server2.I 網站的在線比對工具(http: //eztaxon~e.ezbiocloud.net/;Kim et al.，2012)進行序列相似性計算。將菌株⑶05及其相近菌株的16S rRNA序列通過CLUSTALX.1.8進行多序列比對分析後，米用Molecular Evolutionary GeneticsAnalysis (Mega, Version2.1)軟體作系統發育分析，分別採用Neighbor-joining和Minimum-evolution方法構建系統進化樹,進化樹用1200次重複取樣的bootstrap方法驗證。Neighbor-joining 和 Minimum-evolution 構建方法中的 bootstrap 值分別為 74% 和75%，進一步確證了這兩種新分離菌株在系統發育中的位置，兩種方法構建的進化樹均顯示了菌株GD05屬於芽孢桿菌科，且代表分類學上的新屬。
[0019]基於上述16S rRNA序列的相似性和進化樹數據，與新分離菌株⑶05親緣最近的三個屬分別為 Ornithinibacillus 屬、Virgibacillus 屬和 Oceanobacillus 屬，分別米用它們的模式種菌株 Ornithinibacillus bavariensis DSM156811"、Virgibacilluspantothenticus Dsicel^pioceanobacillus iheyensis DSM143711"作為對照，研究新分離菌株⑶05的相關特性。
[0020]四、菌株⑶05的生理生化分析
為了進一步了解菌株GD05，根據標準程序測試該菌株相關生理生化特徵。
[0021]首先,表1列舉了菌株⑶05與親緣關係最近三個屬的模式株Ornithinibacillusbavariensis DSM156811"、Virgibacillus pantothenticus DSM26T 和 Oceanobacillusiheyensis DSM14371T之間具有差異的表形特徵、 生理和生化特徵。
[0022]表1菌株⑶05與近緣屬的模式株間的差異特徵
【權利要求】
1.一種兼性厭氧菌gen.nov.，sp.nov.GD05，保藏在普通微生物菌種保藏中心，其保藏號為CGMCC 1.12538。
2.根據權利要求1所述兼性厭氧菌如&77心soligen.nov.，sp.nov.(iD05在偶氮染料還原脫色中的應用。
3.—種偶氮染料還原脫色生物製劑，其特徵在於:所述製劑中含有權利要求1所述的兼性厭氧菌 Sinibacillus soli gen.nov.，sp.nov.GD05。
【文檔編號】C12R1/01GK103667113SQ201310567428
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2013年11月14日 優先權日:2013年11月14日
【發明者】楊貴芹, 周順桂, 莊莉 申請人:廣東省生態環境與土壤研究所