預防和/或治療免疫相關疾病的抗活化態t細胞抗體疫苗的製作方法

2023-05-24 02:07:06

專利名稱：：預防和/或治療免疫相關疾病的抗活化態t細胞抗體疫苗的製作方法
技術領域：
：本發明涉及一種預防和/或治療免疫相關疾病的抗活化態T細胞抗體疫苗。
背景技術：
：免疫系統通過多條渠道的正、負反饋調節將免疫應答控制在適當強度之內。這其中包括抗原、神經系統和內分泌系統的調節，但受到關注最多的而且也是至關重要的是調節性T細胞的調節。這種多渠道調節作用的有效整合確保實現免疫系統的自穩平衡。T細胞是適應性免疫應答的核心，也是免疫調節的主要靶點。許多免疫性疾病源自T細胞活化或者調控的異常。這些疾病包括自身免疫疾病、過敏性疾病等。自身免疫病是一類多發的嚴重危害人體健康的疾病，已經發現的人類自身免疫病共有80餘種。在許多自身免疫病的形成過程中，T細胞都扮演重要角色，以T細胞為靶點的免疫治療是現代免疫治療的重要發展方向。常見自身免疫病發生和治療以及相應動物模型的建立都與T細胞在體內對免疫調節的影響密切相關。系統性紅斑狼瘡(Systemicl叩userythematosus,SLE)是典型的抗體介導的自身免疫病。東方人和黑人育齡婦女發病率最高，約為O.1%。在我國，這一疾病近年來呈明顯的上升趨勢，幾乎已經成為育齡婦女的常見病。SLE的主要特點是多克隆淋巴細胞的非特異性活化。患者在活動期的主要臨床表現為關節疼痛，發燒，面部紅斑，血尿、蛋白尿，白細胞貧血，血沉加快，高丙種球蛋白血症等。DNA、核蛋白、紅細胞、白細胞、血小板等均成為自身免疫反應的靶抗原。血液中含有大量的核蛋白、DNA以及其它自身抗原(如紅細胞表面抗原等)的抗體以及抗原-抗體複合物。免疫病理以抗DNA抗體在皮下、關節和腎小球基底膜等處沉積造成炎症反應為主。也有學說認為抗DNA抗體能夠與腎小球基底膜等處的膠原蛋白發生交叉反應。對於紅斑狼瘡的發病來說，自身抗體的產生是導致疾病發生的主要原因，而在自身抗體產生的過程中，除了B細胞以外，T細胞同樣發揮著重要的作用。紅斑狼瘡T細胞存在著非常複雜的嚴重缺陷，其中包括T細胞共刺激分子異常、T細胞信號傳導異常、T細胞凋亡異常、細胞因子產生異常以及自身反應性T細胞的產生。每種異常對於T細胞的活化、功能發揮以及消亡都起著非常重要的作用，同時也嚴重地影響了自身抗體的產生。為研究紅斑狼瘡的發病機制所建立的BXSB小鼠動物模型中，成年雄性動物80%發病，雌性動物則較少發病，其自身免疫現象與人SLE十分相似。發病動物血清中有高水平的抗核抗體和抗雙鏈DNA抗體並伴有自身免疫性貧血現象，晚期出現腎小球腎炎。類風溼性關節炎(rheumatoidarthritis,RA)是以另一種常見的自身免疫性病，該病以慢性進行性關節滑膜以及關節軟骨壞損為特徵，影響了全世界人口的1%。發病年齡一般在40-50歲，女性的發病率是男性的3-4倍；絕大多數病人的血液中都有高水平的RF因子(針對自體IgG的IgM抗體)。患病早期，關節腫脹、疼痛並伴有功能障礙。關節滑膜炎症使其變得肥厚、皺褶，並有淋巴細胞浸潤，關節軟骨遭到破壞。重症者晚期的慢性進4行性炎症導致關節軟骨壞損和關節畸形。用完全佛氏佐劑(CFA)皮下免疫LEWS大鼠可誘導全身關節的炎症性病變。其特徵與人的RA非常類似，包括關節滑膜的中性粒細胞和單核細胞浸潤，關節軟骨的損傷造成關節變形以至完全失去功能。用病鼠的Th細胞過繼轉移可以造成受體鼠引發同樣的病變，而血清過繼轉移則無此作用，這也是T細胞調節作用影響自身免疫病進程的又一個證明。治療自身免疫病的最佳方案當然是幫助機體恢復應有的自身免疫耐受狀態，但晚期自身免疫病多涉及多個自身抗原，而且誘導免疫耐受的方法尚不成熟，這一目標目前尚難以實現。現行治療方案主要著眼於控制患者的炎症反應，比較常用的有非特異性阿司匹林類藥物(NSAIDs)和糖皮質激素。去除血清中的自身抗體或者免疫複合物、置換血漿也有一定的短期療效。細胞毒性抗癌藥或者淋巴器官放射線照射(清除自身免疫性T和B淋巴細胞)對某些晚期重症自身免疫病患者有一定療效。用環孢素A能夠較特異地抑制T細胞，用抗T和B細胞單克隆抗體有可能達到抑制T和B細胞活性的目的，但是這類治療有時會造成繼發性免疫缺陷。自身免疫病是免疫應答失調而對自身抗原產生過度反應以至導致造成機體損傷的現象，超敏反應是宿主對外來或者自身抗原的過度免疫應答而引起炎症反應的現象。在本質上兩者的發病機制是一致的。超敏反應分為四型，I型超敏反應是個別宿主對某些環境抗原(變應原)發生正性反應的結果，通常由IgE和肥大細胞介導，以黏膜下肥大細胞的迅速激發為主要特徵。II型和III型超敏反應由IgM和/或IgG介導，前者導致細胞及結締組織的損傷，而後者以免疫複合物沉積為主。雖然這些超敏反應的免疫損傷是由抗體介導的，但超敏狀態的形成和維持卻依賴於Th細胞。與依賴於抗體介導的超敏反應不同，IV型超敏反應由T淋巴細胞介導，由於此型超敏反應在抗原攻擊後48小時才出現反應，又稱為遲髮型超敏反應。其核心是CD4和/或CD8陽性效應T細胞在識別靶抗原後所造成的以淋巴細胞浸潤為主要病理特徵的炎症損傷，這類疾病至少有下列幾種表現形式接觸性皮炎、結核菌素反應、肉芽腫。慢性自身免疫性肝炎的本質也是IV型超敏反應。目前的觀點認為，正常機體內本身就存在微弱的調節性的抗T細胞免疫應答，T細胞免疫只是大增強了已有的免疫應答的水平。其中調節性T細胞的作用已得到較為全面的論述，但有關T細胞疫苗(TCV)誘導調節性體液免疫應答的研究較少。國內外研究均證明，TCV誘導了抗T細胞的體液免疫反應。TCV免疫動物後，可明顯抑制T細胞增生，阻止自身免疫疾病或誘導同種移植物的存活期延長；在動物血清中檢測到抗TCV抗體(IgG)存在。體外實驗證明，TCV免疫後血清對同一克隆T細胞具有強烈的抑制作用。吸收實驗結果表明，這些抗體具有TCV特異性，能差異性識別活化T細胞和正常淋巴細胞。用針對人II型膠原的特異性T細胞系給DBA/IJ小鼠接種，能誘發小鼠對關節炎的抵抗力，並發現在小鼠血清中還存在一種抗獨特型抗體，能與針對人II型膠原的自身抗體起反應。在Lewis大鼠中，T細胞疫苗也誘導出了幾種同基因型T細胞起反應的自身抗體。T細胞疫苗免疫後，體內自然存在的體液網絡的反應得到加強。研究還表明，Lewis大鼠從EAE疾病恢復的過程也與抗T細胞抗體的產生有關。在體外，患實驗性變態反應性腦脊髓膜炎(EAE)後和疫苗注射後的血清都可強烈抑制同基因T細胞克隆的增殖，其抑制作用由抗體介導並呈現部分補體依賴性；在體內，兩種血清均可改善EAE的症狀。從Epstein-BarrVirus(EBV)轉染TCV免疫多發性硬化症(MS)病人的B細胞克隆得到抗T細胞抗體。關於TCV免疫後抗體的作用研究較少，但目前研究己證明活化T細胞免疫後宿主可產生抗細胞表面活化分子抗體，用針對人II型膠原的特異性T細胞系給BDA/IJ小鼠接種，能誘發小鼠對關節炎的抵抗力，並發現在小鼠血清中還存在一種抗獨特型抗體，能與針對人II型膠原的自身抗體起反應。在Lewis大鼠中，T細胞疫苗也誘導出了與幾種同基因型T細胞蛋白起反應的自身抗體。T細胞免疫後，體內自然存在的體液網絡的反應得到加強。研究還表明，Lewis大鼠從EAE疾病恢復的過程也與抗T細胞抗體的產生有關。在體外，患EAE後和疫苗注射後的血清都可強烈抑制同基因T細胞克隆的增殖。這一抑制作用由抗體介導並呈現部分補依賴性，在體內，兩種血清均可改善EAE的症狀。確定這些抗活化態T細胞抗體所識別的靶蛋白並對其功能加以研究，有助於加深對TCV的免疫調節機制的認識。免疫蛋白組學的出現，使系統分析TCV誘發的體液免疫應答成為可能。Westernblotting是鑑定免疫原性蛋白的經典方法，而通常所用的Westemblotting和免疫共沉澱技術很難確認靶分子的本質；但二者結合產生一門新的技術一免疫蛋白組學，應用此項技術能夠鑑定出所有的免疫原性蛋白，訖今為止已成功應用於微生物苗的篩選及鑑定腫瘤抗原等，這種技術特別適用於複雜生物樣品的分析。
發明內容本發明的目的是提供一種預防和/或治療免疫相關疾病的疫苗。本發明所提供的預防和/或治療免疫相關疾病的疫苗，它的活性成分是由活化態T細胞和/或下述蛋白質或多肽中的至少一種作為免疫原得到的多克隆抗體或單克隆抗體本發明所提供的預防和/或治療免疫相關疾病的疫苗，它的活性成分是下述a)和/或b)的多克隆抗體或單克隆抗體；所述a)為抗活化態T細胞的多克隆抗體或單克隆抗體；所述b)為抗下述l)-7)中的蛋白質或多肽中的至少一種的多克隆抗體或單克隆抗體1)胺基酸序列是自GenBankAccessionNumberAAH03453的氨基末端的第21位-253位胺基酸殘基的calreticulin多肽；2)是將由自GenBankAccessionNumberAAH03453的氨基末端的第1至416位胺基酸殘基組成的calreticulin蛋白自氨基末端的第416位胺基酸殘基開始，向氨基末端連續缺失0至163中任意整數個胺基酸殘基得到的164個多肽或蛋白質之一；3)是將由自GenBankAccessionNumberAAH03453的氨基末端的第1至416位胺基酸殘基組成的calreticulin蛋白自氨基末端的第1位胺基酸殘基開始，向羧基末端連續缺失1至20中任意整數個胺基酸殘基得到的20個多肽或蛋白質之一；4)胺基酸序列是自GenBankAccessionNumberP27773的氨基末端的第27位-250位胺基酸殘基的ERp57多肽；5)是將由自GenBankAccessionNumberP27773的氨基末端的第1至505位胺基酸殘基組成的ERp57蛋白自氨基末端的第505位胺基酸殘基開始，向氨基末端連續缺失0至255中任意整數個胺基酸殘基得到的256個多肽或蛋白質之一；6)是將由自GenBankAccessionNumberP27773的氨基末端的第1至505位胺基酸殘基組成的ERp57蛋白自氨基末端的第1位胺基酸殘基開始，向羧基末端連續缺失1至26中任意整數個胺基酸殘基得到的26個多肽或蛋白質之一；7)胺基酸序列是自GenBankAccessionNumberP20152氨基末端的第1位_466位胺基酸殘基的vimentin蛋白。上述a)和/或b)的多克隆抗體或單克隆抗體均可按照現有的方法製備，其中的單克隆抗體可用培養雜交瘤細胞的方法獲得。本發明預防和/或治療免疫相關疾病的疫苗的作用機理是這些抗體可抑制T細胞活化，這些抗體對T細胞有抑制作用，實驗表明這種作用可能是通過抗體識別靶分子，影響T細胞表面免疫突觸等微觀結構形成，從而幹擾相應下遊信號轉導來實現的。主動免疫該疫苗，其活性成分可以激活免疫調節系統，發揮預防和/或治療免疫相關疾病的作用。實驗證明抗胺基酸序列是自GenBankAccessionNumberAAH03453的氨基末端的第21位-253位胺基酸殘基的calreticulin多肽(名稱為calreticulin—1)的抗體、抗胺基酸序列是自GenBankAccessionNumberP27773的氨基末端的第27位_250位胺基酸殘基的ERp57多肽(名稱為ERp57-l)的抗體和抗vimentin全長蛋白的抗體以及抗活化態T細胞的抗體都可抑制T細胞活化。用這四種抗體中的任一種或其任意組合免疫機體，可抑制遲髮型超敏反應，可預防和/或治療I型糖尿病、系統性紅斑狼瘡、多發性硬化症、慢性B型肝炎、類風溼關節炎、實驗性腦脊髓炎(experimentalautoimmuneenc印halitis，EAE)和超敏反應性疾病等免疫相關疾病。因為上述2)的164個多肽或蛋白質免疫動物後，都會產生針對胺基酸序列是自GenBankAccessionNumberAAH03453的氨基末端的第21位-253位胺基酸殘基的calreticulin多肽的抗體;上述3)的20個多肽或蛋白質免疫動物後，都會產生針對胺基酸序列是自GenBankAccessionNumberAAH03453的氨基末端的第21位-253位胺基酸殘基的calreticulin多肽的抗體；上述5)的256個多肽或蛋白質免疫動物後，都會產生針對胺基酸序列是自GenBankAccessionNumberP27773的氨基末端的第27位_250位胺基酸殘基的ERp57多肽的抗體；上述6)的26個多肽或蛋白質免疫動物後，都會產生針對胺基酸序列是自GenBankAccessionNumberP27773的氨基末端的第27位_250位胺基酸殘基的ERp57多肽的抗體；所以上述2)、3)、5)、6)的蛋白質或多肽作為免疫原得到的抗體可預防和/或治療上述免疫相關疾病。所述活化態T細胞是用特異抗原或有絲分裂原或抗原呈遞細胞(APC)活化T細胞獲得的。現有的能使靜止的T淋巴細胞轉化成T淋巴母細胞的有絲分裂原均可用於活化T細胞，如刀豆蛋白A(ConA)、植物凝集素(PHA)等。為了提高免疫效果，該疫苗中還可含有常規的免疫佐劑，如鋁佐劑(Al(OH)3)、蜂膠、殼聚糖。本發明的疫苗可通過注射、噴射、滴鼻、滴眼、滲透、吸收、物理或化學介導的方法導入機體如肌肉、皮內、皮下、靜脈、黏膜組織；或是被其他物質混合或包裹後導入機體。本發明以活化T細胞作為疫苗誘導BALB/c小鼠產生抗活化態T細胞抗體。結合二維電泳、Westemblot及蛋白質組學，找到抗活化態T細胞特異性識別的靶分子，用流式細胞術、ELISA、Westernblot對上述抗體、蛋白進行鑑定。用細胞ELISA證實抗活化態T細胞抗體靶分子在活化態T細胞表面的表達。並通過抗T細胞抗體過繼轉移，觀察其對小鼠遲發性超敏反應的影響。實驗結果表明通過T細胞免疫可以在小鼠體內誘導相應的抗T細胞抗體。抗活化態T細胞血清識別的活化態T細胞靶分子是鈣網蛋白(calreticulin),ERp57,波形蛋白(vimentin)等。以上述分子的重組蛋白作為抗原免疫小鼠，可以誘導產生高水平的特異性抗體。體內實驗中，過繼抗活化態T細胞抗體的小鼠遲發性超敏反應受到抑制，應用這一方法可通過對免疫調節功能的影響實現預防/治療超敏反應或自身免疫性疾病。圖1為人外周血中的CD4+CD25+T細胞的流式細胞數分析結果圖2為活化的0VA-T細胞的流式細胞術純度鑑定結果圖3為活化態0VA-T細胞免疫小鼠血清的ELISA測定結果圖4A為流式細胞術分析活化態0VA-T細胞與活化態0VA-T細胞免疫小鼠血清以及靜息態OVA-T細胞免疫小鼠血清結合情況的結果圖4B為流式細胞術分析靜息態0VA-T細胞與活化態OVA-T細胞免疫小鼠血清以及靜息態OVA-T細胞免疫小鼠血清結合情況的結果圖4C為流式細胞術分析用ConA活化的小鼠脾細胞與活化態0VA-T細胞免疫小鼠血清以及靜息態OVA-T細胞免疫小鼠血清結合情況的結果圖4D為流式細胞術分析用抗CD3抗體活化的小鼠脾細胞與活化態OVA-T細胞免疫小鼠血清以及靜息態OVA-T細胞免疫小鼠血清結合情況的結果圖5A為活化態OVA-T細胞與活化態OVA-T細胞免疫小鼠血清結合情況的雷射共聚焦顯微鏡照片圖5B為活化態OVA-T細胞與靜息態OVA-T細胞免疫小鼠血清結合情況的雷射共聚焦顯微鏡照片圖5C為靜息態OVA-T細胞與活化態OVA-T細胞免疫小鼠血清結合情況的雷射共聚焦顯微鏡照片圖5D為靜息態OVA-T細胞與靜息態OVA-T細胞免疫小鼠血清結合情況的雷射共聚焦顯微鏡照片圖6為Westernblot檢測免疫小鼠血清識別耙的抗原圖7為活化態0VA-T細胞的總蛋白的雙向電泳圖譜圖8為ATV-S血清與活化態OVA-T細胞蛋白的Westernblot結果圖9為RTV-S血清與活化態0VA-T細胞蛋白的Westernblot結果圖10為用ESI-MS/MS鑑定出的CRT蛋白的部分肽段胺基酸序列ll為ATV-S血清對重組calreticulin—l、Vimentin和ERp57-l的識別圖12為細胞ELISA檢測活化態T細胞表面Calreticulin、Vimentin和ERp57的表達結果圖13A為用ERp57-l通過ELISA檢測正常人血清中抗ERp57-l抗體的結果圖13B為用ERp57-l通過ELISA檢測慢性B型肝炎患者血清中抗ERp57-l抗體的結果圖14A為用calreticulin—l通過ELISA檢測正常人血清中抗calreticulin—l抗體的結果圖14B為用calreticulin—l通過ELISA檢測慢性B型肝炎患者血清中抗calreticulin一l抗體的結果圖15A為用Vimentin通過ELISA檢測正常人血清中抗Vimentin抗體的結果圖15B為用Vimentin通過ELISA檢測慢性B型肝炎患者血清中抗Vimentin抗體的結果圖16A為用ERp57_1通過ELISA檢測RA或SLE患者血清中抗ERp57-1抗體的結果圖16B為用calreticulin—l通過ELISA檢測RA或SLE患者血清中抗calreticulin—l抗體的結果圖16C為用Vimentin通過ELISA檢測RA或SLE患者血清中抗Vimentin抗體的結果圖17A為用calreticulin—l通過ELISA檢測BXSB小鼠血清中抗calreticulin—l抗體的結果圖17B為用ERp57-l通過ELISA檢測BXSB小鼠血清中抗ERp57-l抗體的結果圖17C為用Vimentin通過ELISA檢測BXSB小鼠血清中抗Vimentin抗體的結果圖18為ATV-S血清對T細胞的抑制作用圖19為anti-Erp57、anti-CRT或anti-Vimentin抑制T細胞增殖結果圖20A為0VA免疫小鼠產生的抗OVA抗體的水平圖20B為calreticulin—l單獨免疫或calreticulin—l、ERp57-l和Vimentin混合免疫小鼠產生的抗calreticulin—l抗體的水平圖20C為ERp57-l單獨免疫或calreticulin—l、ERp57-l和Vimentin混合免疫小鼠產生的抗ERp57-l抗體的水平圖20D為Vimentin單獨免疫或calreticulin—l、ERp57-l和Vimentin混合免疫小鼠產生的抗Vimentin抗體的水平圖21為calreticulin—l、ERp57-l和Vimentin免疫造成BALB/c小鼠的免疫抑制圖22為過繼轉移抗T細胞抗血清抑制遲髮型超敏反應圖23為抗T細胞抗血清過繼轉移對大鼠關節炎的預防作用具體實施方式現代免疫學理論認為，免疫調節主要是由具有調節功能的T細胞及其所分泌的細胞因子來完成的。本發明的發明人在研究T細胞疫苗(TCV)的免疫原性過程中發現，體內存在著能夠特異識別活化態T細胞的抗體，而且這些針對活化態T細胞的自身抗體具有重要的免疫調節功能。通過TCV可以有效地誘導(激發)調節性抗T細胞抗體的應答，起到幹預免疫應答過程的效果。首先建立了針對小鼠卵清蛋白特異的T細胞系，活化後作為疫苗免疫BALB/c小鼠，誘導針對活化態T細胞的體液免疫應答，並在不同的時間點取血，製備抗血清。通過細胞ELISA、流式細胞儀、雷射掃描共聚焦顯微術及SDS-PAGE、Westernblot等方法證實被免疫動物血清中含有抗活化態T細胞抗體，並能在體外實驗中抑制T細胞的增殖，其識別靶抗原主要集中在45-93KD範圍。接著運用二維電泳分離活化態T細胞蛋白，作Westernblot分析，標出抗活化態T細胞血清所識別的蛋白位置，與經考馬斯亮染色2-D膠比對，將膠上對應的點取下，胰酶消化，質譜分析並經資料庫搜索，確定了抗活化態T細胞抗體所識別的靶蛋白為calreticulin(CRT)、ERp57和vimentin，分析TCV誘導的體液免疫反應，確定抗活化態T細胞抗體所識別的靶蛋白是什麼，並如何與之相互作用調控T細胞活化。用重組表達的CRT、vimentin和ERp57作為抗原，經Westernblot檢測證明了以上結果的正確性。體外細胞增殖抑制實驗表明CRT、ER'p57、vimentin的特異性抗體可以抑制T細胞的活化。用重組CRT、ERp57和vimentin免疫小鼠不僅誘導出了相應的抗體產生，而且觀察到了被免疫小鼠免疫功能的顯著改變。本發明研究結果顯示，針對活化態T細胞的自身抗體構成免疫調節的重要組成部分，發揮重要的免疫調節作用。通過TCV或者用重組蛋白進行主動免疫可以激活這一調節系統，發揮預防和/或治療^l疫相關疾病的作用。下述實施例中的實驗方法，如無特別說明，均為常規方法。下述實施例中所用的實驗材料OVA為來源於BALB/c小鼠的卵清蛋白(III級，購自Sigma)。實施例1、本發明的預防和/或治療免疫相關疾病的疫苗的作用機理一、抗活化態T細胞抗體所識別的靶蛋白為calreticulin(CRT)、ERp57和vimentin在研究TCV誘導的免疫調節機制的過程中，人們對TCV誘導的調節性T細胞應答有了較為深入的了解，但對TCV誘導的特異性體液應答(即抗體)知之甚少。在本發明中，用來源於BALB/c小鼠的卵清蛋白(OVA)特異性T細胞系作為疫苗免疫同品系小鼠，發現TCV能夠誘導針對活化態T細胞的體液免疫應答。這一結果揭示了抗T細胞調節性抗體的存在，為今後對調節性抗T細胞抗體(regulatoryanti_T-cellAbs)的研究奠定了基礎，也為通過這一途徑治療免疫相關疾病提出了新的策略和方法。1、OVA特異性T細胞系的建立用來源於BALB/c小鼠的卵清蛋白皮下免疫BALB/c小鼠，取引流淋巴結細胞，在體外用0VA反覆刺激，建立了H-2d限制的0VA特異性T細胞系(OVA-T)。所獲得的抗原特異性T細胞經活化後可作為TCV用來免疫小鼠，進行TCV誘導免疫應答的研究。具體方法如下濃度為2mg/mL的來源於BALB/c小鼠的卵清蛋白(OVA，III級，購自Sigma)溶液與完全弗氏佐劑(CFA，購自(Sigma))按l:l的體積比充分混合後，免疫6-8周雌性BALB/c(H_2d)小鼠，100ug0VA/每隻，於小鼠尾根部皮下免疫，免疫7-IO天后殺鼠，取腹股溝和主動脈旁淋巴結，不鏽鋼篩網上研磨，並用PBS洗二次，然後計數並重懸於完全RMP11640培養基(Hyclone)中，得到淋巴細胞懸液。每孔2X106個淋巴細胞置於24孔板(每孔2ml)，並加入0VA，終濃度至100ug/ml，37。C，5%C02培養，進行第一輪刺激。培養7-IO天后，進行第二輪刺激，第二輪刺激7-IO天后，再進行第三輪刺激，依此類推，進行新一輪的刺激，並測定細胞對OVA的特異性反應。第一輪刺激不加飼養細胞，以後每輪刺激時，每孔加3X106個經2000radY射線照射後的同系小鼠脾細胞作為作為飼養細胞，同時加入OVA(100yg/ml)及rlL2(北京瑞得合通藥業有限公司)(20U/ml)，刺激抗原特異性T細胞活化增殖。按照如下方法測定每輪OVA刺激細胞對OVA的特異性反應將新一輪刺激前的T細胞，加入96孔平底培養板，2.5X104個/孔，同時加入4X105個經2000radY射線照射後的同系小鼠脾細胞作為詞養細胞及OVA(100yg/ml)，以不加抗原作為陰性對照，37°C,5%C02培養72小時，終止培養前8小時摻入H3-TdR，0.2iiCi/孔；用96孔道收集器將細胞收集到玻璃纖維濾紙，WALLACP2counter測定放射活性結果表明第38輪0VA刺激的淋巴細胞對0VA的特異性最佳。為保證用於免疫的T細胞的質量，結合淋巴細胞分層液分層及磁珠分選的辦法，得到高純度的T細胞，具體方法如下第3-8輪0VA刺激的淋巴細胞在刺激三天後，收集細胞於15mlEP管內，2000rpm，離心3rain;棄上清，加5mlPBS，平鋪於5ml小鼠淋巴細胞分層液上，2000rpm，室溫，20min，吸取白色雲霧層狹窄帶，PBS洗二次，末次離心後，棄上清，加入含有10X小牛血清的RPMI1640(Hyclone)，重懸細胞。取一滴細胞懸液與一滴0.2%臺盼蘭染液混合，於血球計數板上，計數四個大方格內的細胞總數。死的細胞可被染成蘭色，活細胞不著色。計數200個淋巴細胞，計算出活細胞百分率。4個大方格內細胞總數4,M^h^、細胞濃度(細胞數/ml)二-^-X10X10(稀釋倍數)活細胞百分率《:SSxioo%結果表明活細胞百分率在95%以上。對得到的T細胞用PE-抗CD25抗體(美國BD公司)，抗CD3抗體進行檢測，結果表明其中活細胞接近99%(圖2)，獲得了H-2d限制的0VA特異性T細胞系(OVA-T)。高純度的T細胞確保了小鼠內的免疫反應是由T細胞所誘導產生，保證了所構建的2-D圖譜中沒有來自其他細胞蛋白的汙染。2、TCV誘導抗活化態T細胞抗體的動力學在上述步驟l的OVA特異性T細胞系過程中，由加入飼養細胞及抗原刺激開始第三天後T細胞作為活化態OVA-T細胞，之後半量換液，並半量補充IL-2維持至第5-7天作為靜息態OVA-T細胞。將雌性、6-8周齡的BALB/c小鼠隨機分成三組，試驗組、對照組和正常組，每組IO只。實驗組用活化態OVA-T細胞尾根部皮下免疫(2X106個細胞/每隻，該2《106個細胞用200ylPBS重懸)，對照組用同等數量的靜息態OVA-T細胞免疫。正常組小鼠不進行免疫。每兩周加強免疫一次，共加強免疫5次，分別於第一次免疫後2、4、6、8、IO周取血，收集血清，通過T細胞-ELISA方法檢測其中抗T細胞抗體的滴度。具體方法如下收集活化態OVA-T細胞，調細胞濃度為2Xl5個/ml，100ul/孔，即2X104/孔，加入96孔酶標板中，離心，1500rpm，2min,棄上清；1:200稀釋待檢血清及對照血清，100u1/孔加於酶標板中，每個稀釋度做三個重複孔，4°C60min每孔加200tilPBS-T(含O.5%吐溫的磷酸鹽緩衝液(0.5MpH7.2)),震蕩後，靜置30s,離心，1500rpm,2min，棄上清控幹。洗滌後每孔加入1:3000稀釋的酶標兔抗小鼠IgG-HRP(北京中杉)100u1，4°C，60min。洗滌後，各孔加入OPD顯色液100u1，混勻，室溫反應5-10min。50ul/孔1MH2S04，終止反應，492nra酶標儀讀數。結果如圖3所示，實驗組(活化態OVA-T細胞免疫)在初次免疫2周後開始產生抗活化態T細胞IgG抗體，加強免疫後該抗體滴度進一步增高，至第6周達到平臺，具有典型的再次應答的特徵。靜息態T細胞免疫組小鼠的血清與活化態T細胞以及靜息態T細胞均沒有明顯的結合。圖3中，ATV-S為活化態OVA-T細胞免疫小鼠血清，RTV-S為靜息態OVA-T細胞免疫小鼠血清，NMS為正常鼠血清。在下面的描述中，將用活化態OVA-T細胞免疫雌性、6-8周齡的BALB/c小鼠獲得的抗血清簡稱為ATV-S，靜息態OVA-T細胞免疫雌性、6-8周齡的BALB/c小鼠獲得的抗血清簡稱為RTV-S。3、流式和免疫螢光法分析抗T細胞抗體與T細胞的結合為了進一步確認TCV誘導抗體與T細胞的特異性結合，用間接免疫螢光法結合流式細胞記數儀(FACS)對抗血清與T細胞的結合情況做了進一步的分析。取小鼠脾細胞終濃度2W06個/mL，加入ConA終濃度5ug/ral或抗CD3抗體5yg/ml，37°C，5%C02,培養48小時，得到ConA活化的小鼠脾細胞、抗CD3抗體活化的小鼠脾細胞。用PBS將活化態OVA-T細胞、靜息態OVA-T細胞、ConA活化小鼠脾細胞和抗CD3抗體活化小鼠脾細胞的細胞濃度調整為lX10e個/ml;分別取lml細胞懸液加入15mlEP管中，1500rpm，5min;加入l:20(PBS稀釋)一抗(ATV-S或RTV-S)，4°C30rain;用洗滌液洗滌2次，每次加洗滌液2ml左右，1500rpm，5min;棄上清，加入50"1工作濃度的FITC標記一抗(ATV-S或RTV-S)，4°C，30min;用洗滌液洗滌2次，每次加液2ml左右1500rpm，5min;加適量固定液，FCM檢測或製片後螢光顯微鏡下觀察(標本在試管中可保存(57天)。雙標記檢測細胞表型時，加入FITC標記抗體的同時加入針對另一靶抗原的PE標記的抗體。FCM結果如圖4A-4D所示，ATV-S與活化態T細胞的結合明顯地強於RTV-S。雷射共聚焦顯微鏡觀察結果(圖5A-5B)與FACS分析一致，ATV-S與活化態OVA-T細胞的樣品中可看見綠色螢光，而RTV-S與活化態OVA-T細胞的樣品中看不見綠色螢光；ATV-S與靜息態OVA-T細胞的樣品中看不見綠色螢光，RTV-S與靜息態OVA-T細胞的樣品中也看不見綠色螢光。為了排除TCV免疫血清只能識別0VA-T細胞的可能性，用ConA及抗CD3抗體活化的小鼠脾細胞作為靶細胞重複上述實驗，得到了同樣的結果，說明0VA-T誘導產生的抗體並非只針對OVA-T細胞，而是具有廣泛的代表性。4、抗活化態T細胞抗體識別靶點的鑑定T細胞的活化伴隨著表面分子的變化，例如，開始出現CD25、CD26、CD30、CD69、CD70、胰島素受體和轉鐵蛋白受體等新的分子，CD2、CD27及CD44等分子的表達也會明顯升高。這些分子是否會成為抗T細胞抗體的靶分子？抗T細胞抗體是否會通過這些分子來調節T細胞的功能？對這些問題的答案有重要的理論和應用意義。在下面的實驗中，通過WesternBlot、免疫共沉澱和免疫蛋白質組學等方法對抗T細胞抗體所識別的靶抗原進行鑑定和分析。(1)Westernblot鑑定ATV-S血清識別的耙抗原首先用Westernblot法檢測ATV-S和RTV-S血清識別T細胞抗原的情況，具體方法如下取5X1(f個上述活化態0VA-T細胞，PBS洗三遍，去上清，加入lml蛋白提取液,超聲破碎細胞，2麗/5s/次，共3次，15000g離心，30分鐘，收集上清即為總蛋白。上述活化態OVA-T細胞的總蛋白，進行凝膠濃度T為12X、交聯度C為X的SDS-PAGE,分別以正常雌性、6-8周齡的BALB/c小鼠血清、活化態OVA-T細胞免疫雌性、6-8周齡的BALB/c小鼠獲得的抗血清(ATV-S)，靜息態OVA-T細胞免疫雌性、6-8周齡的BALB/c小鼠獲得的抗血清(RTV-S)和OVA免疫雌性、6-8周齡的BALB/c小鼠獲得的抗血清(OVA-S)為一抗，進行Westernblot。結果表明ATV-S與活化態T細胞的分子量為45-93kD的蛋白有明顯的結合，而RTV-S血清則基本無反應(圖6)。圖6中，M為蛋白質分子量標準，l為正常雌性、6-8周齡的BALB/c小鼠血清，2為RTV-S，3為ATV-S，4為0VA-S。(2)鑑定抗T細胞抗體所識別的靶分子上述的Westernblot結果並不能確認抗血清所識別的靶分子。為實現這一目的，有必要通過免疫蛋白質組學的手段加以分析。其主要流程是先用二維電泳將T細胞蛋白進行分離，隨後通過Westerblot來鑑定抗血清所能夠特異識別的蛋白質斑點，再配以質譜測序，鑑定出抗體所識別的靶分子。提取上述活化態OVA-T細胞的總蛋白，進行雙向電泳。其中，第一向等電聚焦電泳採用的是pH3-10，分離範圍7cm的IPG膠條，上樣量lmg/膠條；第二向SDS-PAGE電泳使用的是凝膠濃度T為12X、交聯度C為2.9X的SDS-PAGE，每次三塊膠，其中一塊用於考馬斯亮蘭染色，另二塊作用於轉膜，作Westernblotting檢測。該活化態OVA-T細胞的總蛋白的雙向電泳圖譜如圖7所示，圖7中，1為Calreticulin，5為Vimentin，7為ERp57。用ATV-S及RTV-S血清與轉至NC膜上的活化態OVA-T細胞蛋白反應，作Westernblot檢測確定其中的免疫原性蛋白，作blot之前膜先用麗春紅染色，標出具有特徵性的點(如邊界、染色較深的點)當坐標，以輔助定位。由於本法是用2-Dblot與膠比對，與傳統的兩塊2-D膠比對不同，且膜上的點較少、清昕，所以並未用專門的匹配軟體。而是用考馬斯亮蘭染色的2-D膠作母板，將麗春紅染色及2-Dblot結果在圖形處理軟體Photoshop上疊加，同時參考1-Dblot結果(靶蛋白分子量大小)，確定2-Dblot有反應的點在膠上的定位，並標以數字。圖8和圖9代表了四次獨立實驗的結果。將圖8和圖9中所鑑定的特異性蛋白斑點從膠上取下，進行電噴霧電離串聯質譜(ESI-MS/MS)分析，所有測定均在正離子方式下進行，霧化氣體為氮氣，碰撞氣體為氬氣，源溫8(TC，錐孔電壓50V，T0F加速電壓為0.2kV，MCP檢測器電壓為2.7kV，當進行LC-ESI-MS/MS自動分析時，毛細管電壓為3000V。測定結果儀器以peaklist文件形式給出，通過Mascot軟體(http:〃www.matrixscience.com)檢索NCBI資料庫鑑定蛋白質點，並得到部分肽片段序列。結果列於表l。圖10為用ESI-MS/MS鑑定出的CRT蛋白的部分肽段胺基酸序列圖。為保證結果的可靠性，對Calreticulin、Vimentin和ERp57蛋白點進行了MALDI-T0F-MS肽指紋圖分析。MALDI-TOF-MS分析採用反射模式，正離子譜測定，離子源加速電壓20KV，飛行管長2.5m，反射電壓比1.12，N2雷射波長337nm，脈衝寬度3ns，離子延遲提取100ns，真空度4X10—7Torr，質譜信號單次掃描累加50次，使用胰蛋白酶自降解峰m/z842.50和m/z2211.10作為內校正，獲得肽質量指紋圖譜(PMF)。Mascot軟體檢索NCBI資料庫鑑定蛋白質。表lATV-S識別耙蛋白tableseeoriginaldocumentpage13由表l中的結果來看，抗T細胞抗體所識別的靶分子並不包括已知的"T細胞活化分子"，如CD2、CD27、CD44、CD25、CD26、CD30、CD69、CD70、胰島素受體和轉鐵蛋白受體等。Calreticulin、Vimentin和ERp57並非T細胞特異蛋白，它們的表達譜廣泛。這一發現揭示了T細胞活化與調節的新的規律。(3)質譜結果的進一步確認為確認上述質譜分析結果的可靠性，表達了胺基酸序列是自GenBankAccessionNumberAAH03453的氨基末端的第21位-253位胺基酸殘基CRTN端片段(名稱為calreticulin—1)，胺基酸序列是自GenBankAccessionNumberP27773的氨基末端的第27位-250位胺基酸殘基的ERp57片段(名稱為ERp57-1)及全長的Vimentin重組蛋白(自GenBankAccessionNumberP20152的氨基末端的第1位_466位胺基酸殘基)。獲取calreticulin、ERp57、vimentin蛋白質序列和mRNA序列，再使用DNAstar或VectorNTIAdvance等生物學軟體進行引物設計，並對其引物參數進行評估，加上酶切位點和保護鹼基，合成上遊引物和下遊引物。其中，用於擴增calreticulin—l的引物為5，_cgcggatccatetatttcaaagagcagttcttg-3'和5，-cccaagcttftsccagtcetcaggcttcttageate-3，，用於擴增ERp57-1的弓l物為5，-cgcggatccgtgttggaactgacggacgaaaacttc-3，禾卩5'_ccca觀cttatettccgtcatatgaggacagag_3，，用於擴增Vimentin的弓l物為5，-cgcggatccatgtctaccaggtctgtgtectegtcttect-3'禾n5'_cccaagcttttattcaaggtcategtgatgctgagaagtc-3，(上述引物中帶下劃線的鹼基為酶切位點,斜體字為附加的終止密碼子)。從蛋白表達較高的C57小鼠T細胞系EL4細胞中提取總RNA，分別利用上述引物進行RT-PCR獲取目的片段，將目的片段的PCR產物與分別與pGEM-T載體連接，測序結果表明calreticulin—l的PCR產物具有自GenBankAccessionNumberBC003453.1的5'末端的第97位-795位核苷酸序列，ERp57-l的PCR產物具有自GenBankAccessionNumber陋—007952.2的5'末端的第216位-887位核苷酸序列，全長的Vimentin的PCR產物具有自GenBankAccessionNumberNM—011701.3的5'末端的第481位-1881位核苷酸序列，將calreticulin—l的PCR產物、ERp57-l的PCR產物和全長的Vimentin的PCR產物分別插入pET28a載體的BamHI和HindIII位點間，得到重組表達載體pET28a-calreticulin-l、pET28a-ERp57-l和pET28a-Vimentin。pET28a-calreticulin-1、pET28a-ERp57-l和pET28a-Vimentin分別轉化BL21(DE3)大腸桿菌，挑單克隆，IPIG誘導表達；Ni-NTA柱陽離子親和層析純化，PD10S印hadexG25脫鹽柱脫鹽；測定濃度，純度鑑定，分裝並於-8(TC保存備用。經過上述過程，獲得90%以上純度的重組蛋白，其濃度經測定最高可達5rag/mL，產量每升菌可達10-20mg。表達的蛋白經N末端胺基酸序列測定，證實它們分別為重組表達calreticulin—1(自GenBankAccessionNumberAAH03453的氨基末端的第21位-253位胺基酸殘基)、全長的Vimentin重組蛋白(自GenBankAccessionNumberP20152的氨基末端的第1位_466位胺基酸殘基)和ERp57-l(自GenBankAccessionNumberP27773的氨基末端的第27位-250位胺基酸殘基)。將重組表達的calreticulin—1、全長的Vimentin重組蛋白禾口ERp57-l經SDS-PAGE電泳後轉到NC膜上，以ATV-S抗血清為第一抗體進行WesternBlotting,結果在預期的分子量位置上出現了特異的條帶(圖ll)，ATV-S抗血清與重組表達的calreticulin—l在30kD得到雜交條帶，ATV-S抗血清與全長的Vimentin重組蛋白在57kD得到雜交條帶，ATV-S抗血清與ERp57-l在27kD得到雜交條帶；RTV-S血清與calreticulin—1、全長的Vimentin重組蛋白和ERp57-l均無雜交條帶。圖11中，泳道2、6、9為Vimentin,3、5、8為calreticulin—l重組蛋白，1、4、7為無關對照蛋白。這一結果證明了ATV-S血清中確實含有calreticulin—1、Vimentin特異性抗體。5、Calreticulin,Vimentin,Erp57在活化T細胞膜表面的表達由於calreticulin,Erp57和vimentin等均是胞內蛋白。CRT和ERp57在內質網中作為分子伴侶起作用，ERp57與CRT形成複合物參與T細胞的活化。而Vimentin是細胞骨架蛋白。這些蛋白是否真的會出現在活化態T細胞的表面？運用了高靈敏度的細胞-ELISA法確認了這些蛋白在活化態T細胞膜表面的表達。具體方法如下將細胞作為抗原(4X105個/孔)離心包被在ELISA板上，2%牛血清白蛋白37。C封閉2小時，以抗全長calreticulin抗體(Anti-CRT)(SantaCrutz)，抗全長ERp57抗體(Anti_ERp57)(SantaCrutz)，抗全長vimentin抗體(anti-vimentin)(SantaCrutz)為一抗，37。C孵育1小時，服P偶聯抗IgG作為二抗，37'C孵育1小時，加入顯色液顯色並適時終止。結果如圖12所示，與對照anti-goatIgG(圖中以goatIgG表示)相比，抗全長calreticulin抗體，抗全長ERp57抗體，抗全長vimentin抗體對活化態T細胞有較明顯的識別，表明calreticulin,Erp57和vimentin在活化態T細胞膜表面表達。綜上所述，TCV主動免疫誘導產生了針對CRT、ERp57及Vimentin的特異性IgG抗體。這些抗體與T細胞膜上相應的靶分子相互作用，通過影響自身反應性T細胞膜的流動性、膜受體的重新分布、免疫突觸的形成、細胞活化信號的傳導、穿過血管內皮細胞進入靶器官的能力等方面發揮免疫調節作用，同時還可能間接增強了調節性T細胞的功能。二、血清抗T細胞抗體滴度與T細胞相關疾病的關係如果抗T細胞抗體是免疫調節機制的重要組成部分，在發生T細胞過度活化以及T細胞相關疾病的情況下，應該能夠發現抗T細胞抗體滴度的變化。本著這一設想，本發明開發了CRT、ERp57和Vimentin特異性抗體檢測ELISA試劑盒，並用其測定了慢性B型肝炎患者、類風溼關節炎患者和SLE患者的血清抗體。1、試劑盒的組成試劑盒的組成以calreticulin—l、ERp57-l或vimentin包被的酶標板為主，還含有抗HRP標記的人或者小鼠IgG、常規ELISA檢測用的各種試劑溶液洗滌液、底物溶液和終止液。其中，calreticulin—1,ERp57-l或vimentin重組蛋白按照如下方法包被酶標板用包被液(0.05MpH9.6碳酸鹽緩衝液)將calreticulin—l,ERp57-l或vimentin重組蛋白分別稀釋成O.l-lpg/ml，每孔加入100ul，37。C溫育2h，4'C過夜，傾去包被緩衝液，用洗滌液洗滌3次，每次30秒，拍幹，然後在每孔中加入含5X脫脂牛奶的0.05M磷酸鹽緩衝液250ul，37'C溫育1-2h，傾去孔內液體，乾燥後用鋁膜真空密封保存。底物液OPD0.6mg/mL。洗滌液含0.05%吐溫的磷酸鹽緩衝液(0.05MpH7.2)。顯色液0.2MNa2HP0425.7mL，0.1M檸檬酸24.3inL，混合用超純水稀釋一倍。終止液lmol/L硫酸。檢測時，在酶標板小孔中加入50nl待測血清(用洗滌液稀釋)，覆上蓋板膜於18。C-3(TC放置lh，用洗滌液洗酶標板3次，用吸水紙拍幹，之後用洗滌液稀釋配置酶標抗體溶液(0.lmg/L)並加入酶標板小孔中，3(TC放置30min，再用洗滌液洗酶標板3次，拍幹，取100|al底物液加入酶標板小孔後混勻，避光顯色約15min，最後每孔加入終止液(lmol/L硫酸)腳l，用酶標儀測定492nm處的0D值。2、檢測慢性B型肝炎患者血清用含有ERp57-l包被的酶標板的試劑盒對44名健康獻血員以及95位HBV慢性感染者的血清中針對ERp57-l的IgG抗體進行了比較。其中，以44例健康獻血員血清的0D492nm的平均值土2SD為參考值，該參考值為0.283土0.016(平均值土2SD)，小於該參考值的血清為陰性血清，大於該參考值的血清為陽性。結果表明健康人血清中抗ERp57-l抗體均為陰性(少數為臨界)(圖13A)，而HBV患者80。/。為陽性(圖13B)。圖13B中，每一個柱為一個HBV患者血清。用含有calreticulin—l包被的酶標板、vimentin包被的酶標板的試劑盒對44名健康獻血員以及95位HBV慢性感染者的血清中針對calreticulin—l和vimentin的抗體也進行了比較。其中，以44例健康獻血員血清的0D492nm的平均值士2SD為參考值，calreticulin—l包被的酶標板檢測中，該參考值為0.279±0.019，小於該參考值的血清為陰性血清，大於該參考值的血清為陽性；viraentin包被的酶標板檢測中，該參考值為0.281±0.017，小於該參考值的血清為陰性血清，大於該參考值的血清為陽性。結果表明健康人血清中抗calreticulin—l和抗vimentin抗體陽性者約為10%，而HBV患者70%為陽性(圖14A、14B、15A和15B)。圖14B和圖15B中，每一個柱為一個HBV患者血清。3、檢測類風溼關節炎(RA)患者和系統性紅斑狼瘡(SLE)患者的血清抗體又比較了RA和SLE患者血清中針對calreticulin—l,ERp57-1和vimentin抗體的水平，每種抗原各檢測20名患者。結果如圖16A、16B和16C所示，表明RA患者中抗ERp57-l抗體、抗calreticulin—l抗體和抗vimentin抗體陽性率分別為100%、65%、45%;SLE患者中抗ERp57-1抗體、抗calreticulin—l抗體和抗vimentin抗體陽性率分別為85%、40%、80%。圖16A、16B和16C中，左側20例為SLE患者血清，右側20例為RA患者血清，N10為十位健康人混合血清。4、與自身免疫小鼠的相關性BXSB小鼠是人SLE的模型動物，雄性動物成年(4月齡)後開始發病，6月齡時80%以上發病。利用上述試劑盒按照上述方法比較了不同性別、不同年齡BXSB小鼠的抗calreticulin—1、ERp57-1禾卩vimentin血清抗體。其中，試劑盒中包被的calreticulin_1、ERp57-1和vimentin的濃度均為2yg/ml。每種抗體檢測實驗中，每種性別每種月齡的小鼠各10隻。如圖17A、17B和17C所示，2月齡小鼠血清中針對三種蛋白的自身抗體水平均偏低，而6月齡小鼠血清中針對三種蛋白的自身抗體水平均有明顯升高，而且雄性小鼠的抗ERp57-1和抗vimentin抗體水平明顯高於雌性動物，與自身免疫病的發生呈正相關。圖17A、17B和17C中，2m為2月齡小鼠，6m為6月齡小鼠，抗體的滴度1/100、1/200、1/400、1/800分別表示待測血清稀釋100倍、200倍、400倍和800倍。三、抗T細胞抗體免疫調節作用的體外和體內實驗用TCV誘導抗T細胞抗體的實驗己如前述。這些抗體是否具有免疫調節功能？通過體外(T細胞增殖抑制實驗)和體內實驗來檢測針對T細胞、CRT、ERp57、vinmentin等抗體發揮免疫調節作用的能力。1、TCV抗血清抑制T細胞活化在T細胞增殖實驗中，將RTV-S和ATV-S抗血清加入新一輪刺激的BALB/c小鼠OVA-T細胞培養液中，用3H慘入法觀察0VA-T細胞的增殖情況。具體方法如下OVA-T細胞以4X105/孔加入96孔細胞培養板，分成5組，每組3個平行孔，每組加入OVA作為抗原進行刺激，同時分別加入PBS、RTV-S、ATV-S、ATV-S+IL-2和正常小鼠lgG等於37'C培養箱培養72小時。培養結束前6小時每孔摻入0.2uCi3H-TdR，以e-counter液閃儀檢測力-TdR摻入值。結果如圖18所示，ATV-S血清對OVA-T的活化有顯著的抑制作用，在稀釋度為l:100時可達60%左右。如先用ProteinA/G-S印harose與血清反應去除其中的IgG，則抑制作用明顯下降，說明在其中起作用的是抗體而不是細胞因子等。如在培養體系中加入IL-2(50U)則可逆轉血清對T細胞增殖的抑制作用。圖18中，RTV-S表示抗靜息T細胞血清與細胞共孵育，PBS表示PBS免疫血清與細胞共孵育，ATV-S表示抗活化T細胞血清與細胞共孵育，IgG表示抗小鼠IgG作為對照抗體與細胞共孵育，ATV-S+IL-2表示抗活化T細胞血清與細胞共孵育的同時加入IL-2。2、CRT,Vimentin和ERp57特異性抗體的免疫抑制作用為了檢測抗全長calreticulin抗體(Anti-CRT)，抗全長Erp57抗體(anti-ERp57)和抗全長vimentin抗體(anti-vimentin)是否具有調節T細胞功能，在使用抗原刺激BALB/c小鼠T細胞增殖的同時，加入不同稀釋度的anti-ERp57(SantaCrutz)、anti-CRT(SantaCrutz)或anti-Vimentin(SantaCrutz)，後用3H摻入法檢測T細胞增殖以觀察相應抗體對T細胞活性的影響。具體方法如下OVA-T細胞以4X105/孔加入96孔細胞培養板，分成5組，每組3個平行孔，每組加入OVA作為抗原進行刺激，同時分別加入不同濃度的上述抗體和對照抗體於37'C培養箱培養72小時。培養結束前6小時每孔摻入0.2uCi3H_TdR，以e-counter液閃儀檢測^-TdR摻入值。結果顯示，這三種抗體在5ug/ml時對T細胞均有明顯的抑制作用(圖19)，抑制能力大小依次為anti-CRT，anti-ERp57,anti-vimentin。這些抗體對於CD3及ConA誘導的BALB/c小鼠脾細胞增殖亦有明顯的抑制作用。3、calreticulin—l、ERp57-1和全長vimentin的免疫原性既然用TCV可以誘導針對CRT、ERp57和vimentin的抗體，用相應分子的重組蛋白進行主動免疫是否也可以誘導特異性(自身)抗體的產生？如此誘導產生的抗體是否具有免疫調節作用？濃度為2mg/mL的來源於BALB/c小鼠的卵清蛋白(OVA，III級，購自Sigma)溶液與完全弗氏佐劑(CFA，購自(Sigma))按1:1的體積比充分混合後，免疫10隻6-8周雌性BALB/c(H-2d)小鼠，於小鼠尾根部皮下免疫，第一次免疫後第14天和第28天各加強免疫一次，每次免疫的劑量均為100ugOVA/每隻。將40隻6-8周雌性BALB/c(H_2d)小鼠均分為4組，每組10隻，第一組免疫calreticulin一lSDS-PAGE膠，第二組免疫ERp57-lSDS-PAGE膠，第三組單獨免疫全長vimentinSDS-PAGE膠，第四組免疫按等質量混合的calreticulin—lSDS-PAGE膠、ERp57-1SDS-PAGE膠和全長vimentinSDS-PAGE膠。將含有重組蛋白calreticulin-l、ERp57-1和全長vimentin的SDS-PAGE膠磨碎後分別與CFA按1:1的體積比充分混合後，尾根部皮下免疫6-8周雌性BALB/c(H-2d)小鼠，第一次免疫後第14天和第28天各加強免疫一次，第一、二、三組免疫小鼠的每次免疫的劑量均為100ygSDS-PAGE膠/每隻，第四組免疫小鼠的每次免疫的劑量均為100ygSDS-PAGE膠/每隻。分別取第一次免疫後O、7、14、21、28、35、42、49、56、110、114、118天的抗血清用上述試劑盒按照上述ELISA方法測定0D492nm。結果如圖20A、20B、20C和20D所示，表明calreticulin—1、ERp57-l和全長vimentin等三種重組蛋白或者其片段重複免疫BALB/c小鼠，成功誘導出了針對這三種蛋白的自身抗體。從三種蛋白免疫原性的比較來看，calreticulin—1最強，ERp57-l次之，vimentin最差。後者在第二次加強免疫後2周才出現較強的IgG應答。觀察至初次免疫118天後，血清抗體水平仍維持在較高的平臺期，各組動物均無任何明顯的不健康的表現或者症狀。圖20A、20B、20C和20D中，CEV表示calreticulin—1、ERp57-1和全長vimentin混合免疫小鼠血清；圖20A中，0VA表示0VA免疫小鼠血清；圖20B中，C表示calreticulin一l免疫小鼠血清；圖20C中，E表示ERp57-1免疫小鼠血清；圖20D中，V表示vimentin免疫小鼠血清。4、calreticulin—l、ERp57-l和全長vimentin主動免疫所誘導的免疫調節效應如上所述，用靶抗原進行主動免疫同樣可以誘導出針對活化態T細胞表面抗原的抗體(圖20B、20C和20D)。這些抗體的存在是否會對動物的免疫狀態產生影響？是否會在一定程度上抑制宿主的細胞免疫應答？BALB/c小鼠經calreticulin—l、ERp57-l和全長vimentin三次免疫後產生高滴度的血清抗體，然後再用外來抗原-鑰孔戚血藍素(KeyholdlimpetHemocyanin，KLH)進行皮下致敏，7天後足底皮下KLH攻擊，12-48小時後測量足底的腫脹程度以衡量其遲髮型超敏反應(細胞免疫)的情況。結果表明三種抗原的免疫均使動物的細胞免疫應答能力受到了一定的抑制，再一次證明針對這些抗原的抗體分子具有重要的免疫調節作用(圖21)。圖21中，CK表示calreticulin—l免疫小鼠再經KLH攻擊，EK表示ERp57-l免疫小鼠再經KLH攻擊，VK表示vimentin免疫小鼠再經KLH攻擊，3K表示上述三種蛋白混合免疫小鼠再經KLH攻擊，0K表示0VA免疫小鼠再經KLH攻擊，PK表示PBS免疫小鼠再經KLH攻擊，NK表示未經免疫小鼠再經KLH攻擊，PBS表示陰性對照，即未經KLH激發；縱坐標標題中"左一右"表示左右足底腫脹差異。5、抗T細胞抗體免疫調節作用的體內實驗圖21所示的實驗雖然證明了用三種蛋白進行主動免疫可以影響機體的細胞免疫狀態，但是並不能排除這是通過T細胞介導的可能性。在此基礎上完成了抗血清過繼轉移實驗。即首先將ATV-S、RTV-S以及三種蛋白免疫所獲得的抗血清過繼轉移給健康BALB/c小鼠，然後用KLH致敏並攻擊，以觀察抗T細胞抗體在體內實驗中的免疫調節功能。圖22的結果證明了這些抗體的免疫治療作用。圖22中，KC表示經KLH初次免疫後過繼抗calreticulin_1血清，KE表示經KLH初次免疫後過繼抗ERp57-l血清，KV表示經KLH初次免疫後過繼抗vimentin血清，K3表示經KLH初次免疫後過繼抗上述三種蛋白混合血清，KAT表示經KLH初次免疫後過繼抗活化T血清，KRT表示經KLH初次免疫後過繼抗靜息T血清，K0表示經KLH初次免疫後過繼抗OVA血清，KN表示經KLH初次免疫後過繼正常小鼠血清，KLH表示陽性對照，即試驗中未過繼任何血清，PBS表示陰性對照，即未經KLH激發；縱坐標標題中"左一右"表示左右足底腫脹差異。實施例2、本發明疫苗的免疫預防和免疫治療作用1、對CIA的治療用CFA在Lews大鼠誘導關節炎(AIA)，三次免疫之後過繼轉移OVA免疫大鼠血清(0VA)(以0VA為免疫原，常規方法免疫Lews大鼠得到的抗血清)、vimentin免疫大鼠血清(以全長vimentin為免疫原，常規方法免疫Lews大鼠得到的抗血清)、ERp57-l免疫大鼠血清(以ERp57-l為免疫原，常規方法免疫Lews大鼠得到的抗血清)、calreticulin—l免疫大鼠血清(以calreticulin—l為免疫原，常規方法免疫Lews大鼠得到的抗血清)、RTV-S大鼠血清(除免疫動物為Lews大鼠外，其製備方法同RTV-SBALB/c小鼠血清)和ATV-S大鼠血清(除免疫動物為Lews大鼠外，其製備方法同ATV-SBALB/c小鼠血清)，隨後足底攻擊，此後15天內觀察膝關節炎的表現並打分，打分標準為正常為零分，出現紅斑為l分，同時有紅斑和關節腫大為2分，喪失功能/病情蔓延為3分，總分為四肢總和(SolubleIL-15Rec印tora-ChainAdministrationPreventsMurineCollagen-InducedArthritis:ARoleforIL-15inDevelopmentofAntigen-InducedImmunopathology.TheJournalofImmunology1998，160:5654-5660.)結果如圖23所示，calreticulin—l免疫血清、ERp57-l免疫血清、全長vimentin免疫血清和OVA免疫血清比較，calreticulin—l免疫血清、ERp57-l免疫血清、全長vimentin免疫血清具有明顯的治療作用。圖23中，A為calreticulin—l免疫血清和0VA免疫血清結果；B為ERp57-l免疫血清和0VA免疫血清結果；C為全長vimentin免疫血清和0VA免疫血清結果。2、對EAE的預防取35隻C57BL/6雌性2月齡小鼠(18-22克)，隨機分配到5個組，每組7隻。第1_4組分別靜脈注射抗血清，包括正常鼠血清(NMS)、vimentin免疫血清(以全長vimentin為免疫原，常規方法免疫C57BL/6小鼠得到的抗血清)、ERp57-l免疫血清(以ERp57-l為免疫原，常規方法免疫C57BL/6小鼠得到的抗血清)、calreticulin—l免疫血清(以calreticulin一1為免疫原，常規方法免疫C57BL/6小鼠得到的抗血清)、RTV-S血清(除免疫動物為C57BL/6小鼠外，其製備方法同RTV-SBALB/c小鼠血清)禾HATV-S血清(除免疫動物為C57BL/6小鼠外，其製備方法同ATV-SBALB/c小鼠血清)；劑量為150uL/每隻。第5組為陰性對照組，即沒有轉移血清，也沒有進行EAE的誘導。第1-4組用包括百日咳毒素處理和M0G肽/CFA免疫的方法誘導EAE。誘導後16天觀察症狀並記分。其中0分為無症狀，l分為尾部無力，2分為中度前肢或後肢無力，3分為重度前肢或後肢無力，4分為肢體麻痺、人為翻轉不能恢復，5分為重症發病或者死亡。由表2的結果可以看出，除了醒S和RTV-S沒有明顯的預防作用之外，其他4種抗T細胞抗體均有明顯的預防EAE發生的作用。表2抗血清過繼轉移治療EAEtableseeoriginaldocumentpage19權利要求1、一種預防和/或治療免疫相關疾病的疫苗，它的活性成分是下述a)和/或b)的多克隆抗體或單克隆抗體；所述a)為抗活化態T細胞的多克隆抗體或單克隆抗體；所述b)為抗下述1)-7)中的蛋白質或多肽中的至少一種的多克隆抗體或單克隆抗體1)胺基酸序列是自GenBankAccessionNumberAAH03453的氨基末端的第21位-253位胺基酸殘基的calreticulin多肽；2)是將由自GenBankAccessionNumberAAH03453的氨基末端的第1至416位胺基酸殘基組成的calreticulin蛋白自氨基末端的第416位胺基酸殘基開始，向氨基末端連續缺失0至163中任意整數個胺基酸殘基得到的164個多肽或蛋白質之一；3)是將由自GenBankAccessionNumberAAH03453的氨基末端的第1至416位胺基酸殘基組成的calreticulin蛋白自氨基末端的第1位胺基酸殘基開始，向羧基末端連續缺失1至20中任意整數個胺基酸殘基得到的20個多肽或蛋白質之一；4)胺基酸序列是自GenBankAccessionNumberP27773的氨基末端的第27位-250位胺基酸殘基的ERp57多肽；5)是將由自GenBankAccessionNumberP27773的氨基末端的第1至505位胺基酸殘基組成的ERp57蛋白自氨基末端的第505位胺基酸殘基開始，向氨基末端連續缺失0至255中任意整數個胺基酸殘基得到的256個多肽或蛋白質之一；6)是將由自GenBankAccessionNumberP27773的氨基末端的第1至505位胺基酸殘基組成的ERp57蛋白自氨基末端的第1位胺基酸殘基開始，向羧基末端連續缺失1至26中任意整數個胺基酸殘基得到的26個多肽或蛋白質之一；7)胺基酸序列是自GenBankAccessionNumberP20152氨基末端的第1位-466位胺基酸殘基的vimentin蛋白。2、根據權利要求1所述的疫苗，其特徵在於所述多克隆抗體或單克隆抗體為下述A)、B)和C)三種抗體中的至少一種A)抗胺基酸序列是自GenBankAccessionNumberP20152氨基末端的第1位-466位胺基酸殘基的vimentin蛋白的多克隆抗體或單克隆抗體；B)抗胺基酸序列是自GenBankAccessionNumberAAH03453的氨基末端的第1至416位胺基酸殘基的calreticulin蛋白的多克隆抗體或單克隆抗體；C)抗胺基酸序列是自GenBankAccessionNumberP27773的氨基末端的第1至505位胺基酸殘基的ERp57蛋白的多克隆抗體或單克隆抗體。3、根據權利要求l所述的疫苗，其特徵在於所述多克隆抗體或單克隆抗體為下述D)和E)兩種抗體中的至少一種D)抗胺基酸序列是自GenBankAccessionNumberAAH03453的氨基末端的第21位-253位胺基酸殘基的calreticulin多肽的多克隆抗體或單克隆抗體；E)抗胺基酸序列是自GenBankAccessionNumberP27773的氨基末端的第27位_250位胺基酸殘基的ERp57多肽的多克隆抗體或單克隆抗體。4、根據權利要求1所述的疫苗，其特徵在於所述活化態T淋巴細胞通過特異抗原或有絲分裂原或抗原呈遞細胞活化T淋巴細胞獲得。5、根據權利要求1或2或3或4所述的疫苗，其特徵在於所述疫苗中還含有佐劑。6、根據權利要求1或2或3或4所述的疫苗，其特徵在於所述免疫相關疾病為I型糖尿病、和/或系統性紅斑狼瘡、和/或多發性硬化症、和/或慢性B型肝炎、和/或類風溼關節炎、和/或實驗性腦脊髓炎和/或超敏反應性疾病。全文摘要本發明公開了一種預防和/或治療免疫相關疾病的抗活化態T細胞抗體疫苗。它的活性成分是抗活化態T淋巴細胞和/或下述蛋白質或多肽中的至少一種的多克隆抗體或單克隆抗體1)至少含有自GenBankAccessionNumberAAH03453的氨基末端的第21位-253位胺基酸殘基的由calreticulin蛋白缺失得到的多肽；2)至少含有自GenBankAccessionNumberP27773的氨基末端的第27位-250位胺基酸殘基的由ERp57蛋白缺失得到的多肽；3)vimentin蛋白；4)calreticulin蛋白；5)ERp57蛋白。該疫苗可用於預防和/或治療I型糖尿病、和/或系統性紅斑狼瘡、和/或多發性硬化症、和/或慢性B型肝炎、和/或類風溼關節炎、和/或實驗性腦脊髓炎和/或超敏反應性疾病等免疫相關疾病。文檔編號A61P19/00GK101401939SQ200810226189公開日2009年4月8日申請日期2008年11月17日優先權日2008年11月17日發明者仲昭巖,巖張,超洪,文許,翔邱,高曉明申請人:北京大學