菊芋果聚糖的提取與檢測方法

2023-05-23 13:01:11

專利名稱：菊芋果聚糖的提取與檢測方法
技術領域：
本發明屬於分析檢測領域，涉及一種菊芋果聚糖的提取與檢測方法。
背景技術：
植物果聚糖主要是由多個果糖基通過糖苷鍵連接而成的一類水溶性的碳水化合物的總稱。雖然15%的被子植物中均能發現果聚糖，但植物體中果聚糖的總量一般較低，只有在菊芋(Helianthus tuberosus,也稱為鬼子姜，洋姜)的塊莖；菊苣(Cichoriumintybus)、牛蒡(Arctium Iappal)和雞腳草(Dactylis glomeratus)的根；百合(Liliumbrownii)和洋蔥(Allium cepa)的球莖；黑麥草(Lolium perenne)、大麥 (Hordeumvulgare)和小麥(Triticum aestivum)^葉等少數幾種植物的組織中含量相對較高(VanLaere and Van Den Ende, 2002;Ritsema and Smeekens, 2003a)。從菊芋塊莖中提取的菊粉(Inulin)是果聚糖的一種，基本由果糖基通過β (2-1)鍵連接，末端存在一個葡萄糖基。菊芋中的菊粉的聚合度在3 50之間，其聚合度就是果糖基的數目(Van Der Meer et al.，1998)。菊芋的菊粉就是不同聚合度的果聚糖混合而成的。菊粉最大可以佔到菊芋塊莖鮮重的20%或者乾重的90% (Van den Ende et al.，2004)。果聚糖是一類非常有益於人類健康的可溶性碳水化合物。由於人體不含分解果聚糖的酶，因此人類本身不能消化吸收果聚糖，而是通過果聚糖進入結腸後，成為腸道菌群的營養物質，選擇性地促進腸道中雙歧桿菌和乳酸菌的生長而進行消化吸收。同時這些益生細菌的生長又可減少與人體腫瘤發生有關物質的產生。此外，短鏈的果聚糖作為一種低熱量的甜味成分，可作為糖類或脂類替代物被用在酸奶和冰激凌等中，也可用於糖尿病患者的特殊食品中(李興軍，2010)。由於菊芋尤其是塊莖中的果聚糖含量較高，經濟價值高，但成分複雜，不同聚合度的果聚糖混合在一起，不同成分的果聚糖的功能不同，因此分離並檢測這些果聚糖成分就顯得尤為重要。由於傳統分光光度計或者薄層層析的方法只能檢測植物水溶性總糖或者極少數幾個糖類，在檢測植物多種糖分中用的不多。目前檢測植物中多種糖類的方法基本是用高效液相色譜法(HPLC)。HPLC具體方法中又可以分為兩類一類是普通的HPLC法，通過採用示差檢測器(RID)或者蒸發光檢測器(ELSD)來檢測，例如採用RID檢測器檢測低聚糖中的果糖以及三糖四糖(蔣世瓊，1996)，檢測菊芋中高聚合度果聚糖(聚合度高於6)(孫雪梅等，2011)等，採用ELSD檢測器檢測菸草中單糖或二糖(孫雨安，2004 ;程勇，2010);—類是相對特殊的色譜-離子色譜法(HPAEC)，主要採用脈衝安培檢測器(PAD)等，例如檢測菸草中的葡萄糖等小分子單糖(徐禕然等，2010)，檢測大豆中的單糖和蔗糖和蜜二糖等二糖或者三糖等(李仁勇等，2009)，PAD檢測器理論上可檢測皮克級的糖類。雖然離子色譜檢測植物糖類的檢測下限理論上比普通HPLC低，但由於離子色譜儀器體系中流動相為強酸強鹼，儀器價格普遍較貴，基本是傳統HPLC價格的2倍倍。平時使用中對流動相水的要求極高，日常使用維持成本也較高。此外PAD檢測器的多功能性不強，糖類的檢測會在電極表面上對某些分子產生氧化或還原。由於傳統HPLC使用範圍和對象比離子色譜大的多，有機的非極性、極性及離子化合物都可以，而離子色譜目前主要用於無機離子的分析，及少量有機離子化合物的分析。因此，作為分析儀器使用中應用最為廣泛的HPLC，如何利用普通HPLC建立一個高效分離並檢測植物果聚糖的方法就顯得尤其重要。 在傳統HPLC中，雖然RID檢測器也可以用於檢測糖類物質，但RID檢測器是基於連續測定色譜柱流出物折射率的變化，僅適用於紫外(UV)吸收很弱的糖類的測定；同時RID對溫度極其敏感使得基線很不穩定，與梯度洗脫不相容，且檢測靈敏度很低。因此，RID用於檢測糖類物質存在相當的限制。雖然以前的研究也有利用HPLC-ELSD法測定植物中的糖類物質，但存在一定的缺陷，具體體現在(一)部分研究使用普通的矽膠基氨基柱，該柱耐用性不強(因水分可引起氨基固定相的自身水解)，柱子的壽命不長。同時樣品提取中，簡單的進行加熱和離心，非糖類物質對於檢測有幹擾；(二)以前的研究對小分子的單糖二糖或糖醇等分析檢測較多，對於寡聚糖和多聚合度的糖的研究較少。菊芋組織中葡萄糖，果糖，蔗糖，以及寡果聚糖含量較高，其它糖分很少或者幾乎沒有；(三)對於果聚糖含量較高的植物例如菊芋等檢測較少，對菸草大豆等植物檢測較多。

發明內容
本發明的目的是針對現有技術的上述缺陷，提供一種菊芋果聚糖的提取與檢測方法。本發明的目的可通過如下技術方案實現菊芋果聚糖的提取與檢測方法，包含以下步驟(I)菊芋組織可溶性總糖的提取與純化a菊芋組織鮮樣於烘箱中7(T80°C下恆溫烘4(T55h，b組織樣品研磨後，與去離子水按1:2飛的質量體積比混勻，放進100°C的水浴鍋中15 25分鐘，反覆抽提Γ5次，收集三次提取的所有溶液以去除蛋白，c將b中所得的溶液過濾，濾液800(Tl2000g離心20 30分鐘，收集上清，d上步獲得的濾液過固相萃提柱GracePureTM SPE C 18-Max,e濾液過O. 45 μ m水相濾膜過濾，作為下一步HPLC的樣品；(2)菊芋果聚糖的檢測上一步製備的樣品通過HPLC檢測，檢測條件如下色譜柱Prevail Carbohydrate ES Coloumn-ff250*46mm 5um ；檢測器蒸發光檢測器ELSD，Alltech 3300 ；進樣量為IOul ；流速為lml/min,每次樣品的運行時間為55min,流動相B相水，C相乙腈；洗脫方式梯度洗脫，洗脫程序如表I所示表I
權利要求
1.菊芋果聚糖的提取與檢測方法，其特徵在於包含以下步驟 (1)菊芋組織可溶性總糖的提取與純化 a菊芋組織鮮樣於烘箱中7(T80°C下恆溫烘4(T55h， b組織樣品研磨後，與去離子水按1:2飛的質量體積比混勻，放進100°C的水浴鍋中15^25分鐘，反覆抽提3飛次，收集三次提取的所有溶液以去除蛋白， c將b中所得的溶液過濾，濾液800(Tl2000g離心20 30分鐘，收集上清， d上步獲得的濾液過固相萃提柱GracePure SPE C18-Max, e濾液過O. 45 μ m水相濾膜過濾，作為下一步HPLC的樣品； (2)菊芋果聚糖的檢測上一步製備的樣品通過HPLC檢測，檢測條件如下 色譜柱Prevail Carbohydrate ES Coloumn-ff250*46mm 5um ； 檢測器蒸發光檢測器ELSD，Alltech 3300 ； 進樣量10ul ； 流速lml/min,每次樣品的運行時間為55min, 流動相B相水，C相乙腈； 洗脫方式梯度洗脫，洗脫程序如表I所示 表I
2.根據權利要求I所述的提取與檢測方法，其特徵在於所述的菊芋組織可溶性總糖的提取與純化包含 a菊芋組織鮮樣於烘箱中80°C下恆溫烘48h， b組織樣品研磨後，與去離子水按1:3的質量體積比混勻，放進100°C的水浴鍋中20分鐘，反覆抽提3次，收集三次提取的所有溶液以去除蛋白， c將b中所得的溶液過濾，濾液IOOOOg離心20分鐘，收集上清， d上步獲得的濾液過固相萃提柱GracePure SPE C18-Max, e濾液過O. 45 μ m水相濾膜過濾，作為下一步HPLC的樣品。
全文摘要
本發明屬於分析檢測領域，涉及一種菊芋果聚糖的提取與檢測方法。發明者在菊芋植物樣品提取中，採用GRACE公司的GracePureTM SPE C18-Max柱進行樣品過濾，該柱可以去除水溶液中的極性物質，幾乎對糖分無吸附，可有效的降低檢測的背景。採用普通HPLC儀器，但選用對糖份分離非常好的GRACE公司PREVAIL Carbohydrate ES專用糖柱，該糖柱為聚苯乙烯一二乙烯基苯鍵合的氨基糖柱，不存在困擾其他氨基柱的問題，沒有化學降解現象，且在室溫及梯度洗脫的情況下亦很穩定；糖分檢測採用ELSD檢測器，首次建立了一整套菊芋植物樣品果聚糖的提取和檢測流程。
文檔編號G01N30/06GK102944622SQ201210457010
公開日2013年2月27日 申請日期2012年11月14日 優先權日2012年11月14日
發明者梁明祥, 李輝, 康健 申請人:南京農業大學