小麥高分子量谷蛋白亞基的酸性毛細管電泳鑑定方法

2023-05-23 20:16:31

專利名稱：小麥高分子量谷蛋白亞基的酸性毛細管電泳鑑定方法
技術領域：
本發明涉及小麥高分子量谷蛋白亞基的鑑定方法，特別是涉及通過酸性毛細管電泳(A-CE)技術對小麥高分子量谷蛋白亞基進行鑑定的方法。
背景技術：
小麥種子貯藏蛋白主要由醇溶蛋白和谷蛋白組成，它們在組成上具有高度的異質性和複雜性。醇溶蛋白分子量約在30000-80000道爾頓之間，在酸性凝膠電泳條件下，一個品種可分離出15-30個組分，根據其相對遷移率可分為α、β、γ和ω四種醇溶蛋白，它們分別佔其總量的25％、30％、30％和15％。麥谷蛋白包括高分子量谷蛋白亞基(HMW-GS)和低分子量谷蛋白亞基(LMW-GS)兩種，它們分別佔胚乳總蛋白含量的10％和30％左右。
大量研究證明，小麥貯藏蛋白，特別是高分子量谷蛋白亞基的組成和含量對品質具有十分重要的作用。麵粉可以加工成各種麵包、麵條、餅乾、糕點、饅頭等多種專用食品，其特殊的制面特性主要是由貯藏蛋白的二硫鍵多聚體結構決定的，其中谷蛋白主要決定麵團的彈性，而醇溶蛋白則決定麵團的延展性。目前已清楚HMW-GS由第1部分同源群染色體上的Glu-A1、Glu-B1、Glu-D1位點編碼。每個位點均有二個緊密連鎖基因，分別控制分子量較大的x型亞基和分子量較小的y型亞基(用SDS-PAGE方法測得的分子量為90-150KD)。由於部分基因處於沉默和不表達狀態，多數普通小麥品種在SDS-PAGE圖譜上僅能檢測到3-5個高分子量谷蛋白亞基，其中2個由Glu-D1控制，1個或2個由Glu-B1控制，1個或0個由Glu-A1控制。在各個位點上均存在廣泛的等位基因變異，目前已在麵包小麥中鑑定和命名了20多個HMW-GS等位基因。不同的亞基及其等位基因對小麥品質的作用各異，在已經檢測到的高分子量谷蛋白亞基中，1Dx5+1Dy10(4)、1Bx17+1By18(3)、1Bx7+1By8(3)與1Bx13+1By16(3)、1Ax1(3)、1Ax2*(3)等亞基對或亞基與小麥優質品質有關(括號內為品質評分)，而1Dx2+1Dy12為劣質亞基對，亞基對1Dx4+1Dy12對品質有重要作用，其品質評分僅次於1Dx5+1Dy10。在我國推廣品種中1Dx5+1Dy10、1Bx17+1By18等優質亞基對的頻率很低，這可能是造成品質差的重要原因之一。當前在小麥品質育種工作中的重點是對HMW-GS組成的改良，特別是要提高優質高分子量谷蛋白亞基或亞基對的頻率。
近年來，儘管通過基因工程和分子標記輔助選擇手段改良小麥品質已顯示出很大的應用前景，但這些方法往往費用昂貴、分析成本高、費工費時，而且針對優質貯藏蛋白基因的基因工程和分子標記輔助選擇方法離實際應用還有一定距離，目前還難以滿足品質育種工作的要求。因此急需研發新的更為可靠的優質基因標記輔助選擇技術。目前常規育種方法與標記輔助選擇技術相結合是小麥品質改良的主要手段，其中雜交早期世代優質貯藏蛋白亞基快速、微量、準確的鑑定是提高育種效率的關鍵。

發明內容
本發明的目的是提供一種利用酸性毛細管電泳技術快速鑑定小麥高分子量谷蛋白亞基的方法，主要任務是解決針對小麥種子中貯藏的高分子量谷蛋白亞基的鑑定給出酸性毛細管電泳的緩衝液的類型和添加成分、電泳條件參數和毛細管衝洗程序，該方法能在小麥雜交早期世代對小麥種子優質貯藏蛋白亞基作出快速、準確的鑑定與篩選。
本發明的技術方案包括材料取樣、樣品製備、高效毛細管電泳和數據處理分析，其中材料取樣、樣品製備以及數據處理採用的是常規方法，其特徵是高效毛細管電泳時的電泳緩衝液(buffer)為100-120mm磷酸-甘氨酸緩衝液，該緩衝液pH值為2.5-2.8，添加有18-22％乙腈和0.04-0.06％羥脯氨醯甲基纖維素(HPMC)，具體電泳條件參數為毛細管內徑25或50μm毛細管長度24-28cm電壓10.0-13.5KV溫度37-40℃進樣8-12KV，6-10sec在上述的技術方案中，為了能夠連續檢測樣品和保證檢測結果的準確性，在進行高效毛細管電泳時，對毛細管進行衝洗必須按衝洗程序操作，按照衝洗目的的不同，衝洗程序具體分為以下四種情況1、對於新的毛細管在使用前要進行預處理衝洗，衝洗程序如下H2O 4-6min0.1MNaOH 9-12minH2O 4-6min1MH3PO48-12minBuffer 50-75min2、進樣前對毛細管進行衝洗，衝洗程序如下
H2O 1.5-2.5min0.1MNaOH 4-6minH2O 4-6min1MH3PO44-6minBuffer 16-24min3、當一次鑑定測定多個樣品時，兩次樣品檢測之間要進行衝洗，衝洗程序如下1MH3PO41.5-3minBuffer 1.5-2.5min4、檢測結束後對毛細管進行衝洗，衝洗程序如下1MH3PO44-6minH2O 4-6min0.1MNaOH 1.5-2.5minH2O 13-17minN29-11min通過本發明可以建立重要HMW-GS標準毛細管電泳圖譜，進而形成對優質亞基進行鑑定的一套完整的技術體系。
本發明的優點在於(1)樣品用量少微量檢測是開展雜交早期世代優質基因選擇的關鍵。本技術只需單粒種子無胚端10-15mg胚乳麵粉，並可進行5次以上重複分析。另外，所提取的蛋白質幹樣可長期保持而不影響分離效果。
(2)分離時間短利用上述電泳參數，單個樣品一般在12min分離完成，而常規SDS-PAGE方法一般需要1-2天時間。
(3)亞基電泳模式分辨度高、易於應用在酸性緩衝液條件下，多數HMW-GS表現為一個主峰和1-3個副峰(如附圖所示)。理論上A-CE技術每米理論塔板數遠遠高於高效液相色譜和SDS-PAGE方法。該技術可對目前所鑑定的優質HMW谷蛋白亞基進行快速分離和鑑定，包括一些SDS-PAGE和HPLC方法難以區分的亞基，如17+18，2和2*和近年來發現的一些遷移率很相似的新亞基，以及10和12，2和5等(RP-PLC不能有效分離)。通過與優質亞基標準圖譜以及單樣與混合樣的比較分析，能準確鑑定5+10與2+12以及14+15、13+16、17+18、7+8、1、2*等亞基。
(4)重複性好利用上述衝洗方法可以獲得較好的重複性分離。重複間峰遷移時間和峰高的相對標準偏差(RSD)分別小於1％和3％，無峰拖尾現象。
(5)分離自動化程度高毛細管電泳從進樣到結果分析自動化程度高，簡便易於操作，這是傳統SDS-PAGE方法所無法比擬的。
(6)分析成本低除了毛細管電泳儀器較貴以外，分析成本低，一般只需一些常用試劑，所有試劑均用量很少，而且不需使用丙稀醯胺等有毒藥品。因此，與傳統方法相比，A-CE技術的分析成本較低。
此外，該鑑定方法對小麥流通與加工以及品種權益保護等領域也具有重要的應用價值。


圖1小麥品種Hope(1，6+8，5+10)高分子量谷蛋白亞基(HMW-GS)的酸性毛細管電泳(A-CE)連續20次分離重複性比較圖譜。圖中顯示第1、5、10、15和20次分離的電泳圖譜。
圖2小麥品種中國春、Hope和硬粒小麥品種Simeto高分子量谷蛋白亞基的酸性毛細管電泳分離圖譜。
A中國春(N，7+8，2+12)B Hope(1，6+8，5+10)C Simeto(N，7+8)圖3密穗小麥(Triticum compactum L.，2n＝6x＝42，AABBDD)Club20(N，17+18，2+12)和麵包小麥品種Kontrast(N，17+18，5+10)單樣及混合樣(1∶1)HMW-GS酸性毛細管電泳分離與鑑定圖譜。
具體實施例方式
實施例11.材料取樣用小麥品種Hope的種子作為試驗材料，隨機選取種子無胚乳端10-15mg用於谷蛋白提取和毛細管電泳。
2.樣品製備高分子量谷蛋白亞基(HMW-GS)提取方法備用試劑A.50％正丙醇
B.50％正丙醇+1％DTTC.丙酮(分析純)D.20％乙腈+0.1％三氟乙酸(TFA)操作方法(1)取單粒種子，用刀片切取無胚乳端(約10-15mg)，準確稱量後用硫酸紙和小鐵錘扎碎成細粉，放入1.5ml離心管中；(2)加入50％正丙醇1ml，45℃水浴提取10分鐘，10000rpm離心5分鐘，去掉上清液；(3)重複上述步驟三次，攙留的上清液用濾紙吸乾；(4)加入50％正丙醇+1％DTT 800μl，45℃震蕩提取30分鐘，1200rpm離心10分鐘，取上清液轉入乾淨的1.5ml新離心管中；(5)加入預冷分析純丙酮至終濃度40％，室溫靜置沉澱30分鐘，12000rpm離心15分鐘，所得沉澱即為HMW-GS；(6)按比例(w/v1mg+10μl)加入20％乙腈+0.1％w/v三氟乙酸(TFA)，充分溶解、離心後即可進行毛細管電泳分析；同時也可將沉澱放入-20℃中保存，待需要時溶解進行毛細管電泳分析。
3.高效毛細管電泳(HPCE)儀器設備Bio-Rad(Biofocus 3000)公司生產的高效毛細管電泳系統(配有軟體用於系統操作和數據處理)。彈性石英毛細管柱內徑為50μm，長度為25.5cm，外層塗有聚醯亞胺保護層，內壁均未塗層。
備用試劑毛細管電泳緩衝液100mm磷酸-甘氨酸緩衝液(該緩衝液pH值為2.50，添加有20％乙腈和0.05％羥脯氨醯甲基纖維素(HPMC))；雙蒸水。
毛細管柱衝洗液A.0.1MNaOHB.1MH3PO4C.雙蒸水D.電泳緩衝液毛細管衝洗程序a.新毛細管預處理程序H2O 5min0.1MNaOH 10minH2O 5min1MH3PO410minBuffer60minb.樣品間衝洗程序1MH3PO42minBuffer2minc.每天實驗衝洗程序進樣前衝洗H2O2min0.1MNaOH5minH2O5min1MH3PO45minBuffer 20mind.結束實驗衝洗1MH3PO45minH2O5min0.1MNaOH2minH2O15minN210min毛細管電泳條件電壓12.5KV溫度40℃進樣10KV，8sec電極由+向-。
數據處理利用Biofocus Integrator軟體進行數據處理，同時將電泳結果數據轉換成ASC碼，進行Excel處理分析。
對小麥品種Hope(1，6+8，5+10)高分子量谷蛋白亞基連續20次重複分離得到的電泳圖譜如圖1所示。
實施例21.材料取樣分別用小麥品種中國春、Hope和硬粒小麥種子作為試驗材料，隨機選取種子無胚乳端10-15mg用於谷蛋白提取和毛細管電泳。
2.樣品製備高分子量谷蛋白亞基(HMW-GS)提取方法選用的備用試劑和操作方法與實施例1相同，得到的HMW-GS沉澱可以按比例(w/v1mg+10μl)加入20％乙腈+0.1％w/v三氟乙酸(TFA)，充分溶解、離心後即可進行毛細管電泳分析；也可將沉澱放入-20℃中保存，待需要時溶解進行毛細管電泳分析。
3.高效毛細管電泳(HPCE)儀器設備Bio-Rad(Biofocus 3000)公司生產的高效毛細管電泳系統(配有軟體用於系統操作和數據處理)。彈性石英毛細管柱內徑為50μm，長度分別為28cm，外層塗有聚醯亞胺保護層，內壁均未塗層。
備用試劑毛細管電泳緩衝液110mm磷酸-甘氨酸緩衝液(該緩衝液pH值為2.60，添加有18％乙腈和0.04％羥脯氨醯甲基纖維素(HPMC))；雙蒸水。
毛細管柱衝洗液A.0.1MNaOHB.1MH3PO4C.雙蒸水D.電泳緩衝液毛細管衝洗程序
a.新毛細管預處理程序H2O 4min0.1MNaOH 9minH2O 4min1MH3PO48minBuffer50minb.樣品間衝洗程序1MH3PO41.5minBuffer1.5minc.每天實驗衝洗程序進樣前衝洗H2O 1.5min0.1MNaOH 4minH2O 4min1MH3PO44minBuffer16mind.結束實驗衝洗1MH3PO44minH2O 4min0.1MNaOH 1.5minH2O 13minN29min毛細管電泳條件電壓10KV溫度37℃進樣8KV，10sec電極由+向-。
數據處理利用Biofocus Integrator軟體進行數據處理，同時將電泳結果數據轉換成ASC碼，進行Excel處理分析。
中國春、Hope和硬粒小麥品種Simeto高分子量谷蛋白亞基的酸性毛細管電泳分離圖譜如圖2所示。
實施例31.材料取樣分別用密穗小麥Club20和麵包小麥品種Kontrast的種子作為試驗材料，隨機選取種子無胚乳端10-15mg用於谷蛋白提取和毛細管電泳。然後再用分別由密穗小麥Club20和Kontrast的種子提取的高分子量谷蛋白亞基按1∶1混合後製成的樣品作為試驗材料。
2.樣品製備高分子量谷蛋白亞基(HMW-GS)提取方法選用的備用試劑和操作方法與實施例1相同，得到的HMW-GS沉澱可以按比例(w/v1mg+10μl)加入20％乙腈+0.1％w/v三氟乙酸(TFA)，充分溶解、離心後即可進行毛細管電泳分析；也可將沉澱放入-20℃中保存，待需要時溶解進行毛細管電泳分析。
3.高效毛細管電泳(HPCE)儀器設備Bio-Rad(Biofocus 3000)公司生產的高效毛細管電泳系統(配有軟體用於系統操作和數據處理)。彈性石英毛細管柱內徑為50μm，長度分別為24cm，外層塗有聚醯亞胺保護層，內壁均未塗層。
備用試劑毛細管電泳緩衝液120mm磷酸-甘氨酸緩衝液(該緩衝液pH值為2.80，添加有22％乙腈和0.06％羥脯氨醯甲基纖維素(HPMC))；雙蒸水。
毛細管柱衝洗液A.0.1MNaOHB.1MH3PO4C.雙蒸水D.電泳緩衝液毛細管衝洗程序a.新毛細管預處理程序
H2O6min0.1MNaOH12minH2O6min1MH3PO412minBuffer 75minb.樣品間衝洗程序1MH3PO43minBuffer 2.5minc.每天實驗衝洗程序進樣前衝洗H2O2.5min0.1MNaOH6minH2O6min1MH3PO46minBuffer 24mind.結束實驗衝洗1MH3PO46minH2O6min0.1MNaOH 2.5minH2O17minN211min毛細管電泳條件電壓13.5KV溫度38℃進樣12KV，6sec電極由+向-。
數據處理利用Biofocus Integrator軟體進行數據處理，同時將電泳結果數據轉換成ASC碼，進行Excel處理分析。
密穗小麥Club20(N，17+18，2+12)和麵包小麥品種Kontrast(N，17+18，5+10)單樣及混合樣(1∶1)HMW-GS的酸性毛細管電泳分離與鑑定圖譜如圖3所示。
權利要求
1.一種小麥高分子量谷蛋白亞基的酸性毛細管電泳鑑定方法，包括材料取樣、樣品製備、高效毛細管電泳和數據處理分析，其中材料取樣、樣品製備以及數據處理採用的是常規方法，其特徵是高效毛細管電泳時的電泳緩衝液為100-120mm磷酸-甘氨酸緩衝液，該緩衝液pH為2.5-2.8，添加有18-22％腈和0.04-0.06％羥脯氨醯甲基纖維素，具體電泳條件參數為毛細管的內徑為25或50μm，長度為24-28cm電壓10.0-13.5KV溫度37-40℃進樣8-12KV，6-10sec。
2.根據權利要求1所述的小麥高分子量谷蛋白亞基的酸性毛細管電泳鑑定方法，其特徵在於為了能夠連續檢測樣品和保證檢測結果的準確性，在進行高效毛細管電泳時，對毛細管進行衝洗必須按衝洗程序操作，按照衝洗目的的不同，衝洗程序具體分為以下四種情況(1)對於新的毛細管在使用前要進行預處理衝洗，衝洗程序如下H2O 4-6min0.1M NaOH 9-12minH2O 4-6min1M H3PO48-12minBuffer 50-75min(2)進樣前對毛細管進行衝洗，衝洗程序如下H2O 1.5-2.5min0.1M NaOH 4-6minH2O 4-6min1M H3PO44-6minBuffer 16-24min(3)當一次鑑定測定多個樣品時，兩次樣品檢測之間要進行衝洗，衝洗程序如下1M H3PO41.5-3minBuffer 1.5-2.5min(4)檢測結束後對毛細管進行衝洗，衝洗程序如下1M H3PO44-6minH2O 4-6min0.1M NaOH 1.5-2.5minH2O 13-17minN29-11min
3.根據權利要求2所述的小麥高分子量谷蛋白亞基的酸性毛細管電泳鑑定方法，其特徵在於通過本發明能夠建立小麥HMW-GS的標準毛細管圖譜，進而形成對小麥高分子量谷蛋白亞基進行鑑定的一套完整的技術體系。
全文摘要
本發明涉及小麥高分子量谷蛋白亞基的鑑定方法，特別是涉及通過酸性毛細管電泳(A－CE)技術對小麥高分子量谷蛋白亞基進行鑑定的方法。小麥貯藏蛋白，特別是高分子量谷蛋白亞基的組成和含量對品質具有十分重要的作用。當前在小麥品質育種工作中的重點是對HMW－GS組成的改良，特別是要提高優質高分子量谷蛋白亞基或亞基對的頻率。目前常規育種方法與標記輔助選擇技術相結合是小麥品質改良的主要手段，其中雜交早期世代優質蛋白亞基快速、微量、準確的鑑定是提高育種效率的關鍵。本發明的主要任務是解決針對小麥種子中貯藏的高分子量谷蛋白亞基的鑑定給出酸性毛細管電泳的緩衝液類型和添加成分、電泳條件參數和毛細管衝洗程序。
文檔編號G01N30/38GK1570623SQ20041003725
公開日2005年1月26日 申請日期2004年4月30日 優先權日2004年4月30日
發明者晏月明, 餘建中, 姜怡, 安學麗, 胡英考 申請人:首都師範大學