利妥昔和中藥的新用途的製作方法

2023-05-23 15:35:21 1

專利名稱：利妥昔和中藥的新用途的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種藥物用途，具體地說，是關於利妥昔和中藥的新用途。
背景技術：
淋巴瘤是原發於淋巴結或淋巴組織的惡性腫瘤。臨床以無痛性，進行性淋巴結腫大為主要表現。本病可發生於任何年齡，但發病年齡高峰在3廣40歲，其中非霍奇金淋巴瘤高峰略往前移。男女之比為:2 3:1。近年來，人-鼠嵌合性抗⑶20單克隆抗體利妥昔(Rituximab，Rituxan，美羅華)已成功應用於臨床，通過抗體介導的針對細胞特異表面標記的免疫治療，具有低毒，低骨髓抑制和較高特異性的特點，為B細胞淋巴瘤的治療開闢了新途徑。然而患者的治療費用昂貴，部分患者在治療早期或疾病復發時發生耐藥。因此，研究利妥昔和其他藥物聯合應用的可行性對於提高療效、降低費用具有重要意義。

發明內容
本發明的目的是針對現有技術中的不足，提供一種含有利妥昔和苦參的組合藥物在製備治療B細胞淋巴瘤的藥物組合物中的用途。為實現上述目的，本發明採取的技術方案是:一種含有利妥昔和苦參的組合藥物在製備治療B細胞淋巴瘤的藥物組合物中的用途，所述的組合藥物由西藥和中藥藥物組成，所述的西藥是利妥昔，所述的中藥藥物是由下列重量份的原料藥製成:苦參5-15份、玄參5-10份、丹皮10-20份。所述的中藥藥物是由下列重量份的原料藥製成:苦參8-12份、玄參6-9份、丹皮12-18 份。所述的中藥藥物是由下列重量份的原料藥製成:苦參10份、玄參7份、丹皮15份。所述的利妥昔和中藥藥物比例為1-100 μ g/ml:1_30μ g/ml。所述的利妥昔和中藥藥物比例為20 μ g/ml:20 μ g/ml。本發明優點在於:通過使用本發明的組合藥物，發揮組合藥物的協同作用，可以協同抑制B淋巴瘤細胞生長增殖，協同誘導B淋巴瘤細胞凋亡。藥物組合在提高療效的同時下可大幅降低費用，降低副作用。使用本發明的組合藥物可以克服現有技術中單獨使用一種藥物引起耐藥的缺點。


圖1顯示流式細胞儀檢測SU-DHL-4凋亡對照組的效果圖。圖2顯示單用西藥SU-DHL-4凋亡的效果圖。圖3顯示單用中藥藥物SU-DH L-4凋亡的效果圖。圖4顯示合用藥物SU-DHL-4凋亡的效果圖。圖5顯示流式細胞儀檢測Daudi凋亡對照組的效果圖。
圖6顯示單用西藥Daudi凋亡的效果圖。圖7顯示單用中藥藥物Daudi凋亡的效果圖。圖8顯示合用藥物Daudi凋亡的效果圖。
具體實施例方式下面對本發明提供的具體實施方式
作詳細說明。實施例1 中藥藥物製備(一)
取中藥苦參100g、玄參70g、丹皮150g置煎煮容器內，加入750 g的冷水浸泡lh，煮沸30 min，過濾(2次)。藥渣加入450 g水繼續煎煮，煮沸20 min，過濾(2次)。合併兩次濾液，於水浴上濃縮成相當於原生藥材5 μ g/ml的藥液，冷卻裝入滅菌藥瓶，置4°C冰箱備用。實施例2 中藥藥物製備(二)
取中藥苦參100g、玄參70g、丹皮150g置煎煮容器內，加入750 g的冷水浸泡lh，煮沸30 min，過濾(1次)。藥渣加入450 g水繼續煎煮，煮沸20 min，過濾(2次)。合併兩次濾液，於水浴上濃 縮成相當於原生藥材I μ g/ml的藥液，冷卻裝入滅菌藥瓶，置4°C冰箱備用。實施例3 中藥藥物製備(三)
取中藥苦參100g、玄參70g、丹皮150g置煎煮容器內，加入750 g的冷水浸泡lh，煮沸30 min，過濾(2次)。藥渣加入450 g水繼續煎煮，煮沸20 min，過濾(3次)。合併兩次濾液，於水浴上濃縮成相當於原生藥材10 μ g/ml的藥液，冷卻裝入滅菌藥瓶，置4°C冰箱備用。實施例4 中藥藥物製備(四)
取中藥苦參100g、玄參70g、丹皮150g置煎煮容器內，加入750 g的冷水浸泡lh，煮沸30 min，過濾(3次)。藥渣加入450 g水繼續煎煮，煮沸20 min，過濾(4次)。合併兩次濾液，於水浴上濃縮成相當於原生藥材20 μ g/ml的藥液，冷卻裝入滅菌藥瓶，置4°C冰箱備用。實施例5 中藥藥物製備(五)
取中藥苦參100g、玄參70g、丹皮150g置煎煮容器內，加入750 g的冷水浸泡lh，煮沸30 min，過濾(2次)。藥渣加入450 g水繼續煎煮，煮沸20 min，過濾(2次)。合併兩次濾液，於水浴上濃縮成相當於原生藥材30 μ g/ml的藥液，冷卻裝入滅菌藥瓶，置4°C冰箱備用。實施例6 中藥藥物製備(六)
取中藥苦參50g、玄參100g、丹皮IOOg置煎煮容器內，加入750 g的冷水浸泡lh，煮沸30 min，過濾(3次)。藥渣加入450 g水繼續煎煮，煮沸20 min，過濾(4次)。合併兩次濾液，於水浴上濃縮成相當於原生藥材20 μ g/ml的藥液，冷卻裝入滅菌藥瓶，置4°C冰箱備用。實施例7 中藥藥物製備(七)
取中藥苦參150g、玄參50g、丹皮200g置煎煮容器內，加入750 g的冷水浸泡lh，煮沸30 min，過濾(3次)。藥渣加入450 g水繼續煎煮，煮沸20 min，過濾(4次)。合併兩次濾液，於水浴上濃縮成相當於原生藥材20 μ g/ml的藥液，冷卻裝入滅菌藥瓶，置4°C冰箱備用。實施例8 中藥藥物製備(八)
取中藥苦參80g、玄參60g、丹皮180g置煎煮容器內，加入750 g的冷水浸泡lh，煮沸30min，過濾(3次)。藥渣加入450 g水繼續煎煮，煮沸20 min，過濾(4次)。合併兩次濾液，於水浴上濃縮成相當於原生藥材20 μ g/ml的藥液，冷卻裝入滅菌藥瓶，置4°C冰箱備用。實施例9 中藥藥物製備(九)
取中藥苦參120g、玄參60g、丹皮120g置煎煮容器內，加入750 g的冷水浸泡lh，煮沸30 min，過濾(3次)。藥渣加入450 g水繼續煎煮，煮沸20 min，過濾(4次)。合併兩次濾液，於水浴上濃縮成相當於原生藥材20 μ g/ml的藥液，冷卻裝入滅菌藥瓶，置4°C冰箱備用。實施例10 中藥藥物製備(十)
取中藥苦參150g、玄參100g、丹皮200g置煎煮容器內，加入750 g的冷水浸泡lh，煮沸30 min，過濾(3次)。藥渣加入450 g水繼續煎煮，煮沸20 min，過濾(4次)。合併兩次濾液，於水浴上濃縮成相當於原生藥材20 μ g/ml的藥液，冷卻裝入滅菌藥瓶，置4°C冰箱備用。實施例11`
藥效實驗
(一)試劑
利妥昔，苦參、玄參、丹皮，
(二)細胞培養
本研究應用了以下兩種細胞株:採用⑶20陽性B淋巴瘤細胞系SU-DHL-4和Daudi細胞，細胞在5%C02-95%空氣，飽和溼度以及37°C的條件下，培養於RPM1-1640培養液中(Gibco/BRL)，並加入10%胎牛血清。在每次實驗中，細胞接種密度為3X IO5/ml。細胞的存活率採用臺盼蘭拒染實驗檢測。細胞形態學觀察採用瑞氏染色法。(三)MTT實驗
在96孔板中，用利妥昔終濃度選用0、1、20、50、75和100 μ g/ml，中藥藥物(苦參、玄參和丹皮)組終濃度選用O、1、5、10、20和30 μ g/ml處理細胞。O劑量組用1640培養液代替。72小時後，向每孔中加入0.1 mg MTT，在37°C下孵育4小時後，在分光光度計570nm處測量標本吸光度值。(四)流式細胞儀檢測annexin-V和線粒體跨膜電位:
細胞凋亡用ApoAlert Annexin V-FITC Apoptosis kit (BD)進行分析。在檢測線粒體跨膜電位中，細胞用PBS洗後，在37°C下與10 μ g/ml Rhl23孵育30分鐘，然後再用50μ g/ml PI染色。螢光強度用流式細胞儀進行測量。(五)免疫印跡分析:
用 200 ml Laemmli 裂解緩衝液(0.5 M Tris-HCl, pH 6.8，2mM EDTA, 10% glycerol,2% SDS and 5% mercaptoethanol)裂解 5xl06 細胞。蛋白裂解物(20 μ g)用於 10% 聚丙烯醯胺凝膠電泳，再轉移至硝酸纖維素膜上。硝酸纖維素膜在溶於TBS/0.05% Tween 20的5%脫脂牛奶中封閉，之後與一抗在室溫孵育2小時，與辣根過氧化物酶標記的二抗孵育I小時。免疫複合物用辣根過氧化物酶化學發光檢測試劑盒檢測。(六)核蛋白分離:
每IX IO7細胞與裂解緩衝液(10 mM HEPES, IOmMKCl, 1.5 mM MgCl2, 0.5 mM DTT,pH 7.9)洗後，重懸於提取緩衝液(20 mM HEPES, pH 7.9，420 mM NaCl, 0.5 mM DTT, 0.2mM EDTA and 25%甘油)中，冰上孵育20分鐘。12000Xg離心10分鐘後，上清即為核蛋白。(七)統計分析:
實驗結果用三次獨立實驗的平均值和標準差表示，用t檢驗來比較差異。P值小於0.05則認為具有統計學差異。所有的統計採用SAS8.2軟體。(A)結果:
採用SU-DHL-4，Daudi細胞進行培養，通過分析觀察利妥昔、中藥藥物組單獨及聯合應用對細胞生長增殖的影響。利妥昔(20 μ g/ml)聯合中藥藥物(20 μ g/ml)應用48小時可顯著抑制SU-DHL-4，Daudi細胞的增殖。用流式細胞儀檢測單用及合用藥後細胞的凋亡(Annexin V和PI雙染法)。SU-DHL-4 (細胞株I)經利妥昔(20 μ g/ml )、中藥藥物(20 μ g/ml)及利妥昔(20 μ g/ml)聯合中藥藥物(20 μ g/ml)處理的48小時後，Annexin V陽性細胞分別為:對照組3.4% (見圖1);利妥昔組17.3% (見圖2);中藥藥物組7.3% (見圖3);利妥昔與中藥藥物合用組50.7% (見圖4)。在Daudi (細胞株2):對照組3.0% (見圖5);利妥昔組4.2% (見圖6);中藥藥物組6.4% (見圖7);利妥昔與中藥藥物合用組39.7% (見圖8)。

同時我們應用Berenbaum建立的等效應線圖法分析利妥昔與中藥藥物的聯合應用是協同、相加或拮抗。
權利要求
1.一種含有利妥昔和苦參的組合藥物在製備治療B細胞淋巴瘤的藥物組合物中的用途，所述的組合藥物由西藥和中藥藥物組成，其特徵在於，所述的西藥是利妥昔，所述的中藥藥物是由下列重量份的原料藥製成:苦參5-15份、玄參5-10份、丹皮10-20份。
2.根據權利要求1所述的用途，其特徵在於，所述的中藥藥物是由下列重量份的原料藥製成:苦參8-12份、玄參6-9份、丹皮12-18份。
3.根據權利要求1所述的用途，其特徵在於，所述的中藥藥物是由下列重量份的原料藥製成:苦參10份、玄參7份、丹皮15份。
4.根據權利要求1所述的用途，其特徵在於，所述的利妥昔和中藥藥物比例為1-100 μ g/ml: 1-30 μ g/ml0
5.根據權利要求1所述的用途，其特徵在於，所述的利妥昔和中藥藥物比例為20μ g/ml :20μ g/ml。
全文摘要
本發明涉及一種含有利妥昔和苦參的組合藥物在製備治療B細胞淋巴瘤的藥物組合物中的用途，所述的組合藥物由西藥和中藥藥物組成，所述的西藥是利妥昔，所述的中藥藥物是由下列重量份的原料藥製成苦參5-15份、玄參5-10份、丹皮10-20份。本發明優點在於通過使用本發明的組合藥物，發揮組合藥物的協同作用，可以協同抑制B淋巴瘤細胞生長增殖，協同誘導B淋巴瘤細胞凋亡。藥物組合在提高療效的同時下可大幅降低費用，降低副作用。使用本發明的組合藥物可以克服現有技術中單獨使用一種藥物引起耐藥的缺點。
文檔編號A61K36/808GK103191426SQ201310124219
公開日2013年7月10日 申請日期2013年4月11日 優先權日2013年4月11日
發明者夏飛 申請人:太倉市勝舟生物技術有限公司