涉及mRNA翻譯增強因子的組合物和方法

2023-05-15 09:46:31

專利名稱：涉及mRNA翻譯增強因子的組合物和方法
涉及mRNA翻譯增強因子的組合物和方法優先權文件的引用根據35U.S.C. § 119(e)，本申請要求2007年12月11日遞交的美國臨時專利申請 系列號61/007，440的優先權。前述申請的申請日在此作為本申請的優先權日，上述臨時專 利申請公開的內容在此通過引證全部併入本文。
背景技術：
在真核生物中，翻譯過程開始於40S核糖體亞基招募之後，可以通過m7G封端結構 發生，或者通過封端獨立機制發生，其中所述m7G封端結構是一種在mRNA的5』末端發現的 修飾的核苷酸。通過封端獨立機制發生的翻譯過程被定義為翻譯過程的內部啟動，可以通 過多種不同的機制來調節。通過其它機制完成招募之後，40S核糖體亞基移動到一種啟動密 碼子處，在這裡，加入60S核糖體亞基，開始肽合成。包含位於mRNA5』和3』末端非編碼片 段的序列因子能夠影響翻譯啟動的作用。能夠增強封端依賴性mRNA翻譯作用效果的序列 因子被命名為翻譯增強因子(TEE)。一些翻譯增強因子(TEE)通過特定的機制增強翻譯啟動作用，所述機制包括與 RNA的組成部分，包括40S核糖體亞基、18S核糖體RNA (rRNA)的鹼基配對。一些翻譯增強 因子(TEE)還可以起到和核糖體招募為點的作用，能夠促進翻譯的內啟動；但是，絕大多數 內部核糖體進入位點(IRESe)不能起到翻譯增強因子(TEE)的作用。

發明內容
在本領域內存在對更多的翻譯增強因子(TEE)的需要，在生物技術和基因療法 中，翻譯增強因子(TEE)能夠用於調節蛋白質表達。這裡公開的內容滿足了這一需要和其 它需要。在一個方面，這裡提供了分離的或合成的聚核苷酸序列，這種聚核苷酸序列可以 作用翻譯增強因子(TEE)並且包括至少一個mRNA翻譯增強因子(TEE)。所述聚核苷酸序列 中存在的翻譯增強因子(TEE)由 RNSGAGMGRMR (SEQ ID NO 1)或者 MSCSGCNGM WA (SEQ ID NO 2)、或者其基本上相同的序列組成。同樣，在這些聚核苷酸序列中可以包括每種翻譯增 強因子(TEE)的一個以上拷貝(例如2個、5個、10個、25個、50個或者更多的拷貝)。在一個實施方案中，翻譯增強因子(TEE)由R1N1S1GAGM1GR2M2R2R3R4(SEQ ID NO 3) 或者R具S2CS3GCN2GM4WR6 (SEQ ID NO :4)、或者其基本上相同的序列組成。在這些序列中，R1 是缺失，如果存在的話，是A或者G 是缺失，如果存在的話，是A、C或者G，優選是A、C、 或者G ^是缺失，如果存在的話是C或者G，優選是C或者G諷是A或者C ;R2是缺失，如 果存在的話，是A或者G，優選是A或者G，並且，R1和R2可以是相同的或者不同的；M2是缺 失，如果存在的話，是A或者C，優選是A或者C ；R3是缺失，如果存在的話，是A或者G，優選 是缺失；R4是缺失，如果存在的話，是C，優選是缺失；並且，R5是缺失，如果存在的話，是A， 優選是缺失;M3是缺失，如果存在的話，是C或者A，優選是C或者A ;S2是缺失，如果存在的 話，是C或者G，優選是C或者G ;S3是G或者C ;N2是G、C或者T ;M4是A或者C ；W是缺失，
4如果存在的話是A或者T ；R6是缺失，如果存在的話是A。在另一個實施方案中，翻譯增強因子(TEE)由R1N1S1GAGM1GR2M2R2R3R4組成。在這個 序列中，禮、R3和R4是缺失A1是A、C或者6成是(或者6諷是六或者(；&是六或者G 並且，M2是A或者C。在另一個實施方案中，翻譯增強因子(TEE)由R具S2CS3GCN2GM4WR6組 成。在這個序列中，R5和R6是缺失；M3是缺失，如果存在的話是A或者C ;S2是C或者G ；S3 是C或者G並且S2和S3可以是相同的或者不同的；N2是G、C或者T ;M2是A或者C ；W是缺 失，如果存在的話是A。在一些實施方案中，聚核苷酸序列包括一種翻譯增強因子(TEE)，這種翻譯增強因 子(TEE)具有的序列與SEQ ID NO :5-35所示序列有至少90%的一致性。在一些實施方 案中，聚核苷酸序列包括一種翻譯增強因子(TEE)，這種翻譯增強因子(TEE)具有的序列與 SEQ ID NO :5-35所示序列中的一種一致。在一些聚核苷酸序列中，至少存在兩個拷貝的翻譯增強因子(TEE)。在一些聚核苷 酸序列中，存在超過2個拷貝的翻譯增強因子。在一些或者其它實施方案中，所述聚核苷酸 序列包括至少5個拷貝的翻譯增強因子(TEE)、至少10個拷貝的翻譯增強因子(TEE)、至少 25個拷貝的翻譯增強因子(TEE)。在一個相關方面，這裡提供了用於在真核細胞中重組表達多肽的克隆或者表達載 體。這種載體包括一種真核啟動子，這種真核啟動子與一種聚核苷酸序列可操作的相連，所 述聚核苷酸序列包括至少一個這裡公開的mRNA翻譯增強因子(TEE)。載體中存在的翻譯增 強因子(TEE)由 RNSGAGMGRMR(SEQ ID NO 1)或者 MSCSGCNGM WA(SEQ ID NO :2)、或者其基 本上相同的序列組成。在一個實施方案中，載體中存在的翻譯增強因子(TEE)由 R1N1S1GAGM1GR2M2R2R3R4 (SEQ ID NO 3)或者 R5M3S2CS3GCN2GM4WR6 (SEQ ID NO :4)、或者其基本 上相同的序列組成。在這些序列中，R1是缺失，如果存在的話，是A或者G ^是缺失，如果 存在的話，是A、C或者G，優選是A、C、或者G 是缺失，如果存在的話是C或者G，優選是 C或者G諷是A或者C ;R2是缺失，如果存在的話，是A或者G，優選是A或者G，並且，R1和 R2可以是相同的或者不同的；M2是缺失，如果存在的話，是A或者C，優選是A或者C ;R3是 缺失，如果存在的話，是A或者G，優選是缺失；R4是缺失，如果存在的話，是C，優選是缺失； 並且，R5是缺失，如果存在的話，是A，優選是缺失;M3是缺失，如果存在的話，是C或者A，優 選是C或者A ;S2是缺失，如果存在的話，是C或者G，優選是C或者G ;S3是G或者C ;N2是 G、C或者T ;M4是A或者C ;W是缺失，如果存在的話是A或者T ；R6是缺失，如果存在的話是 A0在另一個實施方案中，載體中存在的翻譯增強因子(TEE)由R1N1S1GAGM1GR2M2R2R3R4 組成。在這個序列中，R1A3和R4是缺失A1是A、C或者G ^是C或者G 是A或者C ;R2 是A或者G並且，M2是A或者C。在另一個實施方案中，載體中存在的翻譯增強因子(TEE) 由R具S2CS3GCN2GM4WR6組成。在這個序列中，R5和R6是缺失；M3是缺失，如果存在的話是A 或者C而是C或者G而是C或者G並且S2和S3可以是相同的或者不同的；N2是G、C或者 T ;M2是A或者C ；W是缺失，如果存在的話是A。在一些載體中，這種翻譯增強因子(TEE)具有的序列與SEQID NO :5_35所示序列 基本一致。在一些載體中，這種翻譯增強因子(TEE)具有的序列與SEQ ID N0:5-35所示序列中的一種一致。在一些載體中，所述mRNA翻譯增強因子位於啟動子的3』端並且能夠與編碼所關 心的多肽的第二聚核苷酸序列直接連接。這些載體中的一些進一步包括一種第二聚核苷酸 序列，這種第二聚核苷酸序列能夠編碼所關心的多肽，這種所關心的多肽與mRNA翻譯增強 因子可操作的相連。在一些載體中，mRNA翻譯增強因子位於第二聚核苷酸序列的5』前導 序列中。這裡進一步提供了 DNA疫苗，這種DNA疫苗包括一種載體，能夠表達這裡描述的所 關心的抗原。這裡進一步提供了一種宿主細胞(即，真核宿主細胞，例如CHO細胞)，這種宿 主細胞被載體轉染。在進一步的方面，這裡提供了重組製備所關心的多肽的方法。這些方法包括，構建 一種表達載體，這種表達載體包括一種真核啟動子和至少一個拷貝(例如，1、2、3、4、5、10、 25、50或更多拷貝)的mRNA翻譯增強因子，每個都與編碼所關心多肽的聚核苷酸可操作的 相連。隨後，將所得表達載體轉染進入真核宿主細胞(例如，CHO細胞中)，並且培養用表 達載體轉染的宿主細胞。在一個實施方案中，在載體中存在的mRNA翻譯增強因子(TEE)由 RNSGAGMGRMR(SEQ ID NO 1)或者 MSCSGCNGM WA(SEQ ID NO :2)、或者其基本上相同的序列 組成。在一個實施方案中，載體中存在的翻譯增強因子(TEE)由 R1N1S1GAGM1GR2M2R2R3R4 (SEQ ID NO 3)或者 R5M3S2CS3GCN2GM4WR6 (SEQ ID NO :4)、或者其基本 上相同的序列組成。在這些序列中，R1是缺失，如果存在的話，是A或者G ^是缺失，如果 存在的話，是A、C或者G，優選是A、C、或者G 是缺失，如果存在的話是C或者G，優選是 C或者G諷是A或者C ;R2是缺失，如果存在的話，是A或者G，優選是A或者G，並且，R1和 R2可以是相同的或者不同的；M2是缺失，如果存在的話，是A或者C，優選是A或者C ;R3是 缺失，如果存在的話，是A或者G，優選是缺失；R4是缺失，如果存在的話，是C，優選是缺失； 並且，R5是缺失，如果存在的話，是A，優選是缺失;M3是缺失，如果存在的話，是C或者A，優 選是C或者A ;S2是缺失，如果存在的話，是C或者G，優選是C或者G ;S3是G或者C ;N2是 G、C或者T ;M4是A或者C ;W是缺失，如果存在的話是A或者T ；R6是缺失，如果存在的話是 A0在另一個實施方案中，載體中存在的翻譯增強因子(TEE)由R1N1S1GAGM1GR2M2R2R3R4 組成。在這個序列中，R1A3和R4是缺失A1是A、C或者G ^是C或者G 是A或者C ;R2 是A或者G並且，M2是A或者C。在另一個實施方案中，載體中存在的翻譯增強因子(TEE) 由R具S2CS3GCN2GM4WR6組成。在這個序列中，R5和R6是缺失；M3是缺失，如果存在的話是A 或者C而是C或者G而是C或者G並且S2和S3可以是相同的或者不同的；N2是G、C或者 T ;M2是A或者C ；W是缺失，如果存在的話是A。這種翻譯增強因子(TEE)具有的序列與SEQ ID NO :5_35所示序列基本一致。在 一些載體中，這種翻譯增強因子(TEE)具有的序列與SEQ ID N0:5-35所示序列中的一種一 致。這些方法中的一些還可以進一步包括從宿主細胞或者從被培養宿主細胞周圍的培養基 中純化表達的重組多肽。使用這裡描述的方法可以生產多種所關心的多肽。例如，這裡所 描述的方法適用於許多在臨床上十分重要的治療劑蛋白質。通過參考本發明說明書的其它部分和權利要求書，可以實現對本發明特點和優勢
的進一步理解。


圖1是一種示意圖，代表了翻譯增強正反饋載體以及不同的啟動子(PI)和轉錄增 強子(P2)、轉錄因子(TF)基因和所關心的蛋白。圖2是一種示意圖，代表了圖1所示的翻譯增強正反饋載體與一種第三蛋白阻礙 宿主蛋白質合成。圖3顯示了與大小吻合的參照構建物活性相比，5到25拷貝的各種翻譯增強因子 在CHO細胞中翻譯增強作用的翻譯增強活性。圖4顯示了從不同的翻譯增強因子(TEE)中衍生的一致性模體。圖5顯示了相對於大小吻合的參照構建物活性，根據模體序列1 (SEQ ID NO :1)或 者模體序列2 (SEQ ID NO 2)的合成序列的翻譯增強活性。
具體實施例方式1.概述在這裡公開的是一種新型的mRNA翻譯增強因子(TEE)。具體的說，如隨後實施例 中詳細描述的，這裡識別的是一些短核苷酸序列，這種短核苷酸序列能夠增強哺乳動物宿 主細胞(例如，CHO和BHK細胞系)中的翻譯作用。這裡公開的是來自這種短核苷酸序列 的一致性模體或者翻譯增強因子。在一個實施方案中，模體1是RNSGAGMGRMR(SEQ ID NO: 1)，模體2是MSCSGCNGMWA(SEQ ID NO :2)。據顯示，在這些序列中，R代表A或者G ;M代表 A或者C ;S代表G或者C ;W代表A或者U(T)；並且N代表A、G、C或者U(T)。在其他的實施方案中，模體1是R1N1S1GAGM1GR2M2R2R3R4 (SEQ ID NO :3)。在這一序 列中，R1是缺失，如果存在的話，是A或者G 是缺失，如果存在的話，是A、C或者G，優選 是A、C、或者G 是缺失，如果存在的話是C或者G，優選是C或者G ^是A或者C ;R2是缺 失，如果存在的話，是A或者G，優選是A或者G，並且，R1和R2可以是相同的或者不同的；M2 是缺失，如果存在的話，是A或者C，優選是A或者C ；R3是缺失，如果存在的話，是A或者G， 優選是缺失；R4是缺失，如果存在的話，是C，優選是缺失。在另一個實施方案中，模體1是 R1N1S1GAGM1GR2M2R2R3R4 (SEQ ID NO :3)，其中禮、R3> R4 是缺失，N1 是 A、C 或者 G J1 是 C 或者 G諷是A或者C ;R2是A或者G並且M2是A或者C。在另一個實施方案中，模體2是R具S2CS3GCN2GM4WR6 (SEQ ID NO 4)。在此序列中， R5是缺失，如果存在的話，是A，優選是缺失；M3是缺失，如果存在的話，是C或者A，優選是C 或者A ;S2是缺失，如果存在的話，是C或者G，優選是C或者G ;S3是G或者C ;N2是G、C或 者T ;M4是A或者C ;W是缺失，如果存在的話是A或者T ；R6是缺失，如果存在的話是A。在 另一個實施方案中，模體2是R具S2CS3GCN2GM4WR6 (SEQID NO :4)。在此序列中，R5和R6是缺 失；M3是缺失，如果存在的話是A或者C ;S2是C或者G ；S3是C或者G並且S2和S3可以是 相同的或者不同的；N2是G、C或者T ;M2是A或者C ；W是缺失，如果存在的話是A。此外，這裡公開了根據一致性模體合成的其他一些具體序列(例如，SEQ ID NOs 5-35)。這些合成的序列不表示在用於識別模體序列的序列中。這些合成的序列顯示增強 的翻譯活性。包含一個或者多個這些序列拷貝的聚核苷酸序列能夠提高翻譯作用25倍。這裡公開了翻譯增強子，這種翻譯增強子是分離的或者基本上純的多聚核苷酸
7(例如，DNA)，包括至少一個這裡公開的mRNA翻譯增強因子(TEE)的一種或者一種以上拷 貝。當與一種編碼所關心多肽的多聚核苷酸可操作的相連時，這種多聚核苷酸可以起到翻 譯增強子的作用。示例性的翻譯增強因子(TEE)顯示在SEQ ID N0S:l-35中。請注意，盡 管這裡描述的翻譯增強因子(TEE)處於脫氧核糖核苷酸序列中，本領域技術人員應當容易 理解，翻譯增強因子(TEE)或者包括所述翻譯增強因子(TEE)的多聚核苷酸還可以包括相 應的核糖核苷酸序列。這裡還提供了克隆載體或者表達載體，所述載體包括這裡公開的翻 譯增強因子(TEE)或者翻譯增強子多聚核苷酸，以及懷有這些載體的宿主細胞。這裡進一 步提供了使用這種翻譯增強因子(TEE)、所述翻譯增強子多聚核苷酸和所述表達載體來增 強翻譯作用並產生所需多肽(例如，一種治療劑蛋白)的方法。除非另有陳述，這裡公開的方法使用傳統的分子生物學方法(包括重組技術)、微 生物學方法、細胞生物學方法、生物化學方法和免疫學方法，這些方法包括在本領域技術人 員已知的範圍內。這些技術在現有技術文獻中有很好的闡述，例如，下列參考文獻描述了示 illW^fe Sambrook et al. , Molecular Cloning :A Laboratory Manual (
驗室手冊)，Cold Spring Harbor Press (3rd ed.，2001) ；Brent et ah,Current Protocols in Molecular Biology (分子生物學現有方案)，John Wiley & Sons, Inc. (Ringbou ed.， 2003)；禾口 Freshney，Culture of Animal Cells :A Manual of Basic Technique (動物細 胞培養基礎技術手冊)，Wiley-Liss，Inc. (4th ed. ,2000).2.定義本說明書並不局限於這裡描述的具體的工藝、方案和試劑，可以存在變化。本領域 技術人員應該理解，這裡使用的術語只起到描述具體的實施方案的目的，並不打算作為對 本發明範圍的限制，本發明的範圍有所附權利要求書來描述。如這裡使用的，除非上下文另有明確定義，否則單數形式「一種(a)」 「一個(an)」 和「所述(the)」包括複數意義。因此，例如，「一種細胞」包括這種細胞的複數形式，提到 「一種蛋白」包括一種或一種以上的蛋白質以及本領域技術人員已知的等同物，以此類推。除非另有定義，否則所有這裡使用的科學技術術語具有本領域普通技術人員通 常所理解的意義。下列參考文獻向本領域普通技術人員提供了許多這裡所公開術語的 通用定義Academic Press Dictionary of Science and Technology (學術出片反社的 科學技術詞典)，Morris(EcL)，Academic Press (學術出版社)(1st ed.，1992) ； Oxford Dictionary of Biochemistry and Molecular Biology(生物化學和分子生物學牛津詞 典)，Smith et al. (Eds.), OxfordUniversity Press (牛津大學出版社)(revised ed.， 2000) ；Encyclopaedic Dictionary of Chemistry (化學百禾鬥全書詞典)，Kumar (Ed.)， Anmol Publications Pvt. Ltd. (2002) ；Dictionary of Microbiology and Molecular Biology(微生物學和分子生物學詞典)，Singleton et al. (Eds.)，John Wiley & Sons (3rd ed. ,2002) ；Dictionary of Chemistry (化學詞典)，Hunt (Ed. )，Routledge (1st ed. , 1999) ；Dictionary of Pharmaceutical Medicine (藥物醫學辭典)，Nahler (Ed.)， Springer-Verlag Telos (1994) ；Dictionary of Organic Chemistry (有機化學詞典)， Kumar and Anandand(Eds. )，Anmol Publications Pvt. Ltd. (2002) ；and A Dictionary of Biology(Oxford Paperback Reference)，Martin and Hine (Eds·)，Oxford University Press (4th ed. , 2000).這裡提供了專用於本發明公開內容的術語的進一步的介紹。
這裡使用的術語「試劑」包括任何物質、分子、因子、化合物、單位或者他們的結合。 他包括但不局限於，例如，蛋白質、多肽、小有機分子、多聚糖、多聚核苷酸等等。他可以是一 種天然產物、一種合成的化合物、或者一種化學化合物，或者兩種或更多種物質的結合。除 非另有規定，術語「試劑」、「物質」和「化合物」可以互換使用。這裡使用的術語「作用子」是指一種DNA單元，能夠編碼單一多肽或者蛋白質。術 語「翻譯單元」是指一種DNA片段，在此片段中，能夠發生RNA的合成。術語「DNA疫苗」是指一種DNA，這種DNA可以被引入到一種宿主細胞或者組織中， 並且在其中通過細胞進行表達，從而產生一種信使核糖核酸(mRNA)分子，信使核糖核酸 (mRNA)分子隨後被翻譯，從而產生一種DNA編碼的疫苗抗原。術語「所關心的基因」包括一種作用子、一種開放閱讀框(ORF)或者一種密碼蛋 白質產物(所關心的蛋白質)的多聚核苷酸序列，所述蛋白質產物(所關心的蛋白質)的 生產可以通過翻譯增強因子(TEE)調節。所關心的基因的實施例包括編碼治療劑蛋白質 的基因、編碼營養蛋白質的基因和編碼工業有效蛋白質的基因。所關心的基因還可以包括 報導基因或者可選擇的標記物基因，例如，增強綠色螢光的蛋白質(EGFP)、螢光素酶基因 (Renilla 或者 Photinus)。表達作用是一種過程，通過這種過程由DNA產生蛋白質。該過程包括基因轉錄變 成mRNA和隨後的mRNA翻譯變成一種多肽。這裡使用的術語「內源性」是指一種通常發現在野生型宿主體內的基因，而這裡使 用的術語「外源性」是指通常不能在野生型宿主體內發現的基因。這裡使用的「宿主細胞」涉及一種活細胞，在這種活細胞中，異源多聚核苷酸序列 能夠被引入或者已經被引入。所述活細胞包括經過培養的細胞和活組織內部的細胞。向 細胞中引入異源多聚核苷酸序列的方法是本領域內已知的，例如，轉染方法、電穿孔方法、 磷酸鈣沉澱、微量注射法、轉化方法、病毒傳染法、和/或其他方法。通常，所述被引入細胞 中的異源多聚核苷酸序列是一種可複製的表達載體或者克隆載體。在一些實施方案中，宿 主細胞可以被設計並在其染色體或者基因組上合成一種需要的基因。本領域普通技術人 員已知的許多宿主細胞都可以被使用(例如，CHO細胞)作為宿主。例如，參見Sambrook et al.，Molecular Cloning :A Laboratory Manual (分子克隆實驗室操作指南)，Cold Spring Harbor Press (冷泉港出版社)(3r ed.，2001)；禾口Brent et al,Current Protocols in Molecular Biology (分子生物學現有方案)，John Wiley & Sons, Inc. (ringbou ed., 2003).。在一些實施方案中，所述宿主細胞是一種真核細胞。這裡使用的術語「同系物」是指一種序列，這種序列與參照序列(例如，這裡公開 的特異性mRNA翻譯增強因子)具有基本上一致的結構(例如，核苷酸序列)。通常，所述同 系物能夠維持增強所關心的基因編碼的mRNA翻譯作用的能力。通過在如上所述的參照序 列上製造突變，在表達載體上適當的位置插入突變序列並進行活性篩選同系物，所述表達 載體包括一種啟動子，所述啟動子可操作的與一種報導基因或者所關心的基因相連接。然 後，可以將表達載體引入宿主細胞，從而檢測基因編碼的蛋白質的翻譯作用。如果報導基因 的翻譯與在參照增強子序列控制的情況下報導基因的翻譯作業相同的話，突變序列就是一 種功能性的同系物。術語"誘導劑"是用來指那些從一種可誘導翻譯的調節因子來影響翻譯的一種
9化學的、生物學的或物理的試劑。作為對誘導劑的響應，從該元件的翻譯通常從頭開始或提 高表達的基本的或組成水平。誘導劑可以是，例如，細胞遭受一種應激狀態，例如，一種熱或 冷衝擊，一種毒劑例如一種重金屬離子，或一種營養，激素，生長因子，等等的缺乏；或者可 以是一種化合物，這種化合物是那些影響細胞的生長或者分化狀態的物質，例如一種激素 或者一種生長因子。慣用語"分離的或者純化的多聚核苷酸"意思是包含一個多聚核苷酸序列(例 如，DNA)，這個多聚核苷酸序列是從自然存在的有機體的基因組中立即連接的序列的兩頭 分離到的。純化的多聚核苷酸可以是一種雙鏈或者單鏈的寡聚核苷酸；結合進載體的一種 多聚核苷酸片段；一種被插入到真核的或者原核生物的基因組中的片段；或者是用作探針 的一種片段，慣用語"基本上純的，「當指一種多聚核苷酸時，意思是該分子已經與其他的 伴隨的生物組分分離開的，所以，一般地，在一個樣品中它至少有百分之85或者更大的百 分比。術語「核苷酸序列」，「核酸序列」，「核酸」，或者「多聚核苷酸序列」，指的是一種脫 氧核糖核苷酸或者核糖核苷酸聚合物，它是單鏈的或者是雙鏈的形式，並且除非另外限定， 包含那些以類似於自然地存在核苷酸的方式雜交到核酸中的已知的自然的核苷酸的類似 物。核苷酸序列可以是，例如，原核生物的序列，真核生物的信使核糖核酸序列，來自真核生 物的信使核糖核酸的互補DNA序列，來自真核生物的脫氧核糖核酸的基因組脫氧核糖核酸 序列(例如，哺乳動物脫氧核糖核酸)，和合成的脫氧核糖核酸或者核糖核酸序列，但並不 限於這些。術語「啟動子」意思是一種能夠指導轉錄並且是在轉錄的起始的核苷酸序列。各 種各樣的啟動子序列在本領域中是已知的。這些因子可以包含，但不局限於，TATA-盒子， CCAAT-盒子，噬菌體核糖核酸聚合酶特異的啟動子(例如，T7，SP6，和T3啟動子)，一種SPl 位點，和一種環AMP響應因子。如果該啟動子是可誘導的類型，則它的活性隨誘導劑而增 加。五個主要的引物或者未翻譯的區域(5'引物，5'引物序列或者5' UTR)是一種 特殊的的信使核糖核酸(mRNA)和編碼它的脫氧核糖核酸的片段。它起始於+1位點(轉錄 開始的位置)並且剛好在編碼區域的起始密碼子(通常是AUG)前結束。在細菌中，它可能 包含通常所說的Shine-Delgarno序列的一種核糖體結合部位(RBS)。5'引物可能是一百 或更長的核苷酸，並且3 『 UTR可能更長(直至幾千個K鹼基長)。術語「可操作地連接」或者「可操作地聯繫」指的是遺傳因子之間功能的連接，它 們以一種那些能使它們進行它們正常的功能的方式來連接。例如，當一個基因的轉錄在啟 動子的控制之下它可操作地連接到該啟動子上並且產生的轉錄產物是正確地被轉換為由 該基因正常地編碼的蛋白質。同樣地，如果它允許上調由該基因轉錄的信使核糖核酸的翻 譯，翻譯增強因子可操作地與所關心的基因相聯繫。適合於定向連接反應的核苷酸序列，例如，多酶連接子，是那些提供了位點或者將 一個多聚核苷酸序列定向連接成載體的一種表達載體的一個區域。一般地，一種定向多酶 連接子是一種核苷酸序列，它定義為兩個或更多限制性核酸內切酶識別序列，或者限制位 點。當限制分裂時，這兩個位點產生粘性末端這樣多聚核苷酸序列可以連接到表達載體上。 在一種實施方案中，當限制分裂時，這兩個限制酶切位點提供了粘性末端也就是說非互補的並且因此允許定向插入一種多聚核苷酸序列到盒子中。例如，適合於定向連接的核苷酸 序列可以包含一種核苷酸序列，它定義為多次定向克隆方法。適合於定向連接的核苷酸序 列的位置定義為多限制酶切位點，它稱為一個多克隆位點。對治療來說的術語「患者」指的是分類為哺乳動物的任何動物，例如，人和非人的 哺乳動物。非人類的動物的實例包含狗，貓，牛，馬，綿羊，豬，山羊，兔，等等。除了註解的時 候外，術語「病人」或者「患者」在這裡可互換使用。在一種實施方案中，患者是人。轉錄因子指的是那些要求開始或者調節轉錄的任何多肽。例如，這些因子包含，但 不局限於，c-Myc，c-Fos，c-Jun, CREB，cEts, GATA，GAL4, GAL4/Vpl6, c_Myb，MyoD，NF_ κ β，細 菌噬菌體-特異核糖核酸聚合酶，Hif-1，和TRE。編碼這些因子的序列的實例包含，但不局 限於，基因銀行登記號 K02276 (c-Myc)，K00650 (c-fos)，BC002981 (c-Jun)，M27691 (CREB)， X 14798(cEts)，M77810(GATA)，KO1486 (GAL4)，AY136632 (GAL4/Vpl6)，M95584 (c-Myb)， M84918 (MyoD)，2006293A (NF- κ B)，NP 853568 (SP6RNA 聚合酶)，AAB28I 1 1 (T7RNA 聚合 酶)，NP 523301 (T3RNA 聚合酶)，AF3M6CM (HIF-I)，andX63547 (TRE)。一種「基本上相同的」核苷酸或者胺基酸序列指的是一種核苷酸或者胺基酸序 列，它包含一種序列，其至少90%的序列與通過在這裡所描述的眾所周知的程序(例如， BLAST)使用標準參數來測定的對照序列相同。這些序列同一性可以是至少95%，至少 98%，和至少99%。在一些實施方案中，患者序列具有同對照序列相比大致一樣的長度，那 就是說，那就是說，由大致一樣數量的連續的胺基酸殘基(對於多肽序列)或者核苷酸殘基 (對於多聚核苷酸序列)組成。序列同一性可以很容易地用本領域技術人員所已知的各種各樣的方法來確 定。例如，BLASTN程序(對於核苷酸序列)使用預設字長(W) 11，期望值(E) 10，M = 5， N = -4，來對兩條鏈作比較。對於胺基酸序列，BLASTP程序使用預設字長(W) 3，期望值 (E) 10，和 BL0SUM62 評分矩陣(參見 Henikoff&HenikofT，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 10915(1989))。序列同一性的百分比通過在一個比較窗口上比較兩個最佳地-定位序列來 確定，為了這兩個序列最佳的定位在這裡比較窗口中多聚核苷酸序列部分與對照序列(它 不包含增加的部分或者刪除部分)相比可能包含增加的部分或者刪除部分(也就是，缺 口)。百分比的計算由位點的數目來確定，在這些位點處存在於這兩個序列中的相同的核酸 鹼基或者胺基酸殘基來得到匹配位點的數目，將匹配位點的數目除以比較窗口中總的位點 數目並且將結果乘以100來得到序列同一性的百分比。術語「翻譯增強因子(TEE) 」指的是那些增加由信使核糖核酸產生的多肽或者蛋 白質的數量，高於由於單獨的帽子結構的翻譯水平的順式活性序列。本領域技術人員已知 的TEE的實例包含Gtx同源結構域蛋白質的5'引物中的序列(Chappell等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101 =9590-9594,2004) 另外，在這裡所公開的新的 TEE，例如，SEQ ID NO: 1-35。除非另作說明，TEE指的既是信使核糖核酸序列中的翻譯增強因子也是脫氧核糖核 酸序列中相應的編碼序列因子。「翻譯增強子多聚核苷酸」或者「翻譯增強子多聚核苷酸序列，，是包含一種或多種 這裡所示例的特異的TEE(也就是，SEQ ID N0 1-35)或者它們的變體，同源物或者功能衍 生物的多聚核苷酸。一種特異的TEE的一個或者多拷貝可以存在於該多聚核苷酸中。翻譯 增強子多聚核苷酸中的TEE可以組成一個或者多個序列片段。一個序列片段可以懷有一種或多種這裡所示例的特異的TEE，每隔TEE均已一個或者多個拷貝的形式存在。當多重序列 片段存在於一種翻譯增強子多聚核苷酸中時，他們可以是同源的或者異源的。因此一種翻 譯增強子多聚核苷酸中的多重序列片段可以懷有相同的或者不同的類型的在這裡所示例 的特異的TEE，每一個特異的TEE的拷貝份數是相同的或者不同的，並且/或者每個序列片 段內的TEE是相同的或者不同的組成。術語「治療」或者「減輕」包含化合物或者藥劑的給藥患者來防止或者延緩一種疾 病(例如，一種心臟機能障礙)的症狀，併發症，或者生化的徵候，減輕這些症狀或者阻止或 者抑制該疾病，狀態或者病症的進一步的發展。需要治療的患者包含已經遭受該疾病或者 病症以及那些有該病症傾向的或者那些將預防該病症的病人。治療可以在該疾病後顯現預防(預防或者延緩該疾病的發病，或者預防它的臨床 的或者臨床症狀不顯的症狀的顯現)或者治療的抑制或者減輕症狀。在心臟重塑和/或心 力衰竭的治療中，一種治療劑可以直接減少該疾病的病狀，或者致使該疾病對其他的治療 劑的治療更敏感。術語「載體」或者「構造」指的是多聚核苷酸序列因子以一種固定的組織類型排列 以致與這些因子可操作地連接的基因/基因產物的表達可以預見地控制。一般地，他們是 可傳染的多聚核苷酸序列(例如，質粒或者病毒)，一種外來的脫氧核糖核酸片段可以接合 到這些多聚核苷酸序列中以便將外來的脫氧核糖核酸引入到宿主細胞來加速它的複製和/ 或轉錄。克隆載體是是一種脫氧核糖核酸序列(一般為一種質粒或者噬菌體)，它能夠在 宿主細胞中自主複製，並且它具有一個或者少量的限制性核酸內切酶識別位點。一種外來 的脫氧核糖核酸片段可以在這些位點接合進該載體以便該片段的複製和克隆。該載體可以 包含一種或多種標記來用於識別轉化的細胞。例如，標記可以提供了四環素或者氨苄青黴 素抗性。表達載體類似於克隆載體但是它在轉化進入宿主後能夠誘導那些已經克隆到該 載體中的脫氧核糖核酸的表達。被克隆的脫氧核糖核酸通常受某些調節的序列例如啟動子 或者增強子的控制(也就是，可操作的聯繫到)。啟動子序列可以是結構的，可誘導的或者 可抑制的。表達載體類似於克隆載體但是它在轉化進入宿主後能夠誘導那些已經克隆到該 載體中的脫氧核糖核酸的表達。被克隆的脫氧核糖核酸通常受某些調節的序列例如啟動子 或者增強子的控制(也就是，可操作地連接到)。啟動子序列可以是結構的，可誘導的或者 可抑制的。III.翻譯增強子多聚核苷酸和重組載體在這裡提供了分離或者基本上純化的作為翻譯增強子功能的多聚核苷酸。這些 翻譯增強子多聚核苷酸包含治這裡所公開的特異的信使核糖核酸翻譯增強子因子(TEE) 或者它們的變體，同源物或者功能性的衍生物。翻譯增強子多聚核苷酸可以包含一種或多 種序列片段，這些序列片段包含一致的Motif KSEQ ID NO 1), Motif 2 (SEQ ID NO 2), Motif la (SEQ ID NO :3)，或者Motif 2a (SEQ ID NO :4)。一些翻譯增強子多聚核苷酸可以 包含一種或多種序列片段，這些序列片段包含如SEQ ID N0:5-35所示的特異的信使核糖核 酸TEE的一個。如下面的實例所證明的，那些懷有這些信使核糖核酸TEE中的一個的載體
12中所關心的多肽的表達導致蛋白質產量顯著的增加。除了如SEQ ID N0:135所示的信使核 糖核酸TEE之外，信使核糖核酸TEE也可以包含序列，這些序列基本上和這些例證序列的一 個一致並且可以保持在宿主細胞中所關心的一種可操作地連接的基因的表達增強的基本 的功能特性。翻譯增強子多聚核苷酸中的序列片段可以包含如SEQ ID NO :1_35所示的僅僅一 個特異的信使核糖核酸TEE或者幾個信使核糖核酸TEE。存在於一種序列片段中的每一個 特異的信使核糖核酸TEE，該序列片段中只能僅有該信使核糖核酸TEE的一個拷貝。替代 地，每一個信使核糖核酸TEE的多拷貝可以存在於各自的序列片段中。一般地，翻譯增強子 多聚核苷酸中不同的信使核糖核酸TEE因子可以是操作上連接的彼此靠近或者被那些長 度1到大約100核苷酸不等的間隔核苷酸序列分開。一些翻譯增強子多聚核苷酸包含僅僅 一個序列片段。其它的翻譯增強子多聚核苷酸包含大量的序列片段。在後面的實施方案中， 該序列片段可以是同源的或者異源的。因此，一些實施方案涉及一種翻譯增強子多聚核苷酸序列片段，它包含一種信使 核糖核酸TEE序列，這些信使核糖核酸TEE序列與如SEQ ID NO 1-35所示的序列的一個一 樣或者基本上一致。其它的實施方案涉及一種翻譯增強子多肽序列片段，它包含如SEQ ID NO :1_35所示的一種特異的信使核糖核酸TEE的2，3，4，5，10，25，50或更多拷貝。在一些 實施方案中，該翻譯增強子多聚核苷酸涉及一種序列片段，它包含超過一個(例如，2，3,4, 5，或更多)如SEQ ID NO :1-35所示的不同的信使核糖核酸TEE或者它們的變體或者同源 物。在這些實施方案中，每一個特異的信使核糖核酸TEE可以以一種或多種拷貝(例如，2， 3，4，5，10，25或更多拷貝)的形式存在。在其它的實施方案中，該翻譯增強子多聚核苷酸 包含超過一個上面註解的序列片段。不同的序列片段可以按照特異的信使核糖核酸的類型 和每個特異的信使核糖核酸TEE所懷有的拷貝數目來一致。替代地，多重序列片段可以在 特異的信使核糖核酸TEE的類型和/或每個特異的信使核糖核酸TEE的拷貝數目上有所不 同。在任何實施方案中，除了如SEQ ID NO :1-35所示的信使核糖核酸TEE外，這些特異的 TEE的變體或者帶有基本上一致的序列的同源物也是能使用的。在此公開的特異的信使核糖核酸TEE或者翻譯增強子多聚核苷酸可用於構造重 組克隆載體或者表達載體。這些載體對於表達所關心的多肽或者蛋白質是非常有用的，例 如，一種治療的蛋白質。他們還可以用於治療的應用例如脫氧核糖核酸疫苗或者基因治療。 重組載體可以由一種質粒，病毒或者其他的本領域技術人員已知的載體通過插入或者結合 這裡所描述的特異的信使核糖核酸TEE或者翻譯增強子多聚核苷酸的一個或者多個來構 建。這些載體的實例在下面的實施例中會討論到。一般地，該載體包含一種適合於表達一 種宿主細胞(例如，哺乳動物宿主細胞)中所關心的多肽的啟動子。在該載體中，一種包含 TEE的序列是可操作地連接到該啟動子，例如，在3'到該啟動子。序列片段包含如上所述 的一種TEE或者一種翻譯增強子多聚核苷酸。該載體另外可以懷有一種適合於編碼所關心 的多肽的多聚核苷酸序列的定向連接的核苷酸的序列。例如，一種多酶連接子可以用於克 隆該多聚核苷酸序列以便該克隆序列可操作地連接到該啟動子和包含TEE的序列並且置 於該啟動子和包含TEE的序列的控制之下。多酶連接子是那些可以有一系列的三或更多間 距小的限制性核酸內切酶識別序列的多聚核苷酸序列(參見，例如，Sambrook等，supra)。 在一些實施方案中，如實施例中所闡述的，該載體允許多聚核苷酸序列克隆進該載體某一
13位置以便TEE存在於編碼所關心的多肽的轉錄信使核糖核酸的5'引物端。除了啟動子和包含TEE的序列之外，在這裡所描述的一些重組載體進一步地包含 所關心的一種基因或者編碼所關心的一種蛋白質或者一種多肽的多聚核苷酸。所關心的基 因或者多聚核苷酸序列是可操作的連接到一種啟動子序列和TEE，這種啟動子序列和TEE 促進了宿主細胞中插入的多聚核苷酸序列的轉錄效率。真核生物的信使核糖核酸的翻譯在 AUG密碼子處開始，AUG編碼信使核糖核酸的甲硫氨酸。因此，啟動子和所關心的基因之間 的連接將不會包含任何用於甲硫氨酸的插入密碼子。這些密碼子的存在可能引起融合蛋白 質的形成(如果AUG密碼子在作為所關心的基因的相同閱讀框位置)或者縮氨酸的形成， 這樣或者終止上遊的可信的起始密碼子或者重疊該基因，但在不同的閱讀框中。在一些實 施方案中，編碼一種蛋白質的所關心的基因包含5'引物和3'未翻譯的(UTR)序列。在其 它的實施方案中，輸出轉錄產物中的該5'引物和/或3'未翻譯的區域已經先於所關心的 的基因的克隆存在於該載體中。在這些實施方案中，至少一個TEE位於該5'引物和/或該 3'未翻譯的區域。一般地，該翻譯增強子位於轉錄啟動子和AUG密碼子之間。相對於該啟動子和所 關心的的基因的帽子位點TEE的精確位置不是關鍵性的；然而，該精確位置可能影響效率。 例如，一些TEE當位於編碼信使核糖核酸的5'引物中，或者3'未翻譯的區域中可以增強 翻譯。在一些實施方案中，TEE位於所關心的的基因或者順反子的5'前導序列中。在這些 實施方案中，增強子因子位於翻譯起始位點內大約1-500個核苷酸，特別地是位於翻譯起 始位點內大約1-100或者大約1-50個核苷酸。通過併入上面描述的的翻譯增強子多聚核苷酸，重組載體可以有如SEQ ID NO 1-35所示的一種或多種該特異的翻譯增強子因子。對於任何這些特異的增強子因子，該載 體可以懷有僅僅一個該增強子因子的拷貝或者相同增強子因子的多個拷貝。例如，為了增 加由一種聯合順反子的多肽表達，如SEQ ID NO 1-35所示的特異的TEE的2，5，10，20，35， 50或者75個拷貝的串聯體可以存在於一些重組表達載體中。其它的載體有多重序列片段， 這些多重序列片段可以獨立地包含一種或多種在這裡所示例的特異的TEE序列。另外，重組或者表達載體可以包含輔助的序列因子。例如，載體可以包含一種複製 的起點，和特異的標記，這些標記允許轉染的或者轉化的宿主細胞的表型選擇。存在於載體 實施方案其他因子的變化取決於宿主細胞類型，但通常包含涉及轉錄和翻譯的開始和轉錄 的終止序列信號。翻譯增強子序列也可能存在。載體還可以編碼序列，該多腺苷酸化作用 包含帶有相同轉錄單位，控制因子例如核糖體結合部位，和多腺苷酸化作用位點，被那些允 許在宿主細胞中克隆，表達，和轉化的相同的或者不同的啟動子，序列輔助的轉錄單位所控 制的輔助的轉錄單位。在一些實施方案中，該載體還可以包含編碼一種分子標記的多聚核 苷酸，該標記可以便於從那些不表達所報導的基因的宿主細胞中分離那些表達該報導基因 的宿主細胞。在一些實施方案中，重組載體打算用於在真核生物的宿主細胞中表達所關心的蛋 白質。如下面所詳細描述的，這些包含各種各樣的哺乳動物細胞以及昆蟲細胞或者植物 細胞。在一些實施方案中，提供了脫氧核糖核酸疫苗，它表達來自這裡所公開的表達載體 的一種靶子抗原。適合用於真核生物中的大量載體是本領域技術人員所已經知道的。實 例包含用於哺乳動物細胞中表達的pMSXND表達載體(Lee和Nathans，J. Biol. Chem. 263 3521，1988)；用於昆蟲細胞中表達的baculo病毒衍生的載體；及其他如Botstein等， Miami Winter Symp. 19 265,1982 ；Broach Cell28 203,1982 ；Bollon ^,J. Cin. Hematol. Oncol. 10 :39，1980 ；和細胞生物學一種綜論，Goldstein和Prescott (eds.)，學術出版社 公司，美國(1980)描述的用於真核生物的表達的載體。在一些實施方案中，該翻譯增強子 因子或者多聚核苷酸結合進脫氧核糖核酸構造設計用於同源重組。這些構造的描述，例如， Capecchi，TIG 5 :70，1989 ；Mansour et α/·，自然 336 :348，1988 ；Thomas et al，細胞51 503,1987 ；and Doetschman et al,自然 330 :576，1987。為了所關心的蛋白質的載體表達，信使核糖核酸TEE或者翻譯增強子多聚核苷酸 一般存在於可操作地連接到調節因子例如如上所述的一種啟動子的載體中。取決於所關 心的特殊蛋白質和使用的載體/宿主系統，許多不同的啟動子可以用於重組載體中。能被 使用的啟動子的實例包含老鼠金屬硫蛋白I基因的啟動子(Hamer等，J. MoI. Appl. Gen. 1 273，1982)；皰疹病毒的快速的早期和TK啟動子(Yao等，J. Virol. 69 =6249-6258,1995)； SV 40早期啟動子(Benoist等自然290 :304-310，1981)；和人CMV啟動子(Boshart等細 胞41 =521-530,1985) ；CaMV的35S核糖核酸和19S核糖酸啟動子(Brisson等，自然，310 511，1984 ;0dell等，自然，313 :810，1985)；來自玄參花葉病毒(FMV)的全長轉錄產物啟動 子(Gowda等，J.Cell Biochem. , 13D =301,1989)和來自菸草花葉病毒的外殼蛋白啟動子 (Takamatsu等，EMBO J. 6 :307，1987)。可用於構造重組表達載體的輔助的啟動子包含來自 核酮糖雙磷酸鹽羧化酶(ssRUBISCO)的小亞基的松的-可誘導的啟動子(Coruzzi等，EMBO J.，3 =1671,1984 ；和Broglie等，科學，224 =838,1984)；甘露鹼合成酶基因啟動子(Velten 等，EMBO J.，3 2723,1984)；胭脂鹼合成酶(NOS)啟動子(Shaw 等，Nucl. Acids Res.，12 7831-46,1984)；章魚鹼合成酶(OCS)啟動子 Koncz 等，EMBO J. 2 1597-603，1983)；和熱休 克啟動子，例如，大豆 hspl7. 5-E 或者 hspl7. 3B(Gurley 等，MoI. Cell. Biol.，6 :559，1986 ； Severin 等，Plant MoI. Biol.，15 :827，1990)。啟動子可以既包含結構的也可以包含可誘導的自然的啟動子以及設計的啟動子。 CaMV啟動子是結構的啟動子的實例。為使其最有用，可誘導的啟動子將1)在誘導物不存在 時提供低的表達；2)在誘導物存在時提供了高的表達；3)使用那些不幹擾植物的正常的生 理學的誘導程序；和4)對其他的基因的表達無效。在一些實施方案中，該重組載體可以選擇性地包含一種可選擇的標記。該標記一 般地編碼一種性狀或者一種允許選定區域的表現型，或者用於包含該標記的宿主細胞篩 選。在一種實施方案中，該標記基因是一種抗生素抗性基因由此合適的抗生素可用於從那 些沒有轉化的細胞之中篩選轉化的植物細胞。合適的可選擇的標記的實例包含腺苷脫氨 酶，二氫葉酸還原酶，潮黴素-B-磷酸轉移酶，胸苷激酶，黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶和 氨基苷3'-氧-磷酸轉移酶II (卡那黴素，新黴素和G418抗性)。其他的合適的標記將 是本領域技術人員所已知的，例如，螢光標記例如GUS報導基因(UidA)，螢光素酶或者GFP 基因。IV.用於提高所關心的多肽的產量的宿主細胞翻譯增強子多聚核苷酸和有關的載體在各種各樣的工業和醫療的應用中是有用 的。在一些實施方案中，提供了使用這些表達載體/宿主細胞體系用於表達治療的蛋白 質或者工業的公用事業在增加的水平上的蛋白質的用法。例如，可以用載體表達的治療
15的蛋白質可以包含治療的抗體例如赫賽汀，來自各種各樣的病原體的多肽抗原例如細菌 或者病毒(例如，大腸桿菌，銅綠假單胞菌，金黃色葡萄球菌，瘧疾，愛滋病病毒，狂犬病 病毒，HBV，和巨細胞病毒)引起的疾病，及其他蛋白質例如乳鐵傳遞蛋白，硫氧還蛋白和 β-caseinvaccine。其他的合適的蛋白質或者多肽適當包含，例如，營養地重要的蛋白質； 發育增進因素；用於植物早開花的蛋白質；在某些環境條件下給植物提供保護的蛋白質， 例如，對於金屬或者其他的有毒物質有抗性的蛋白質，例如除草劑或者殺蟲劑；給予溫度極 限耐受性應激相關蛋白質；給予真菌，細菌，病毒，昆蟲和線蟲抗性的蛋白質；特效的商業 價值的蛋白質，例如，涉及代謝途徑的酶，例如EPSP合成酶。在這裡所描述的懷有所關心的基因的重組載體和信使核糖核酸TEE或者增強子 多聚核苷酸可以通過使用本領域技術人員已知的任何方法引入到合適的宿主細胞中。例 如，載體可以通過磷酸鈣共同沉澱，通過傳統的機械的程序例如微量注射或者電轉化，通過 脂質體包裹的質粒插入，和通過病毒載體的方法轉染到宿主細胞中。這些方法全都是眾所 周知的並且本領域技術人員熟練操作，，例如，Brent等，分子生物學通用操作規程，John ffiley& Sons，公司(ringbou 等，2003)；和 Weissbach & Weissbach，植物分子生物學方法， 學術出版社，紐約，VIII節，421-463頁，1988。懷有該轉染的重組載體的宿主細胞可以使用 載體上的選定區域標記來確定和分離。大量受體細胞可以在選擇含有包含載體的細胞的培 養基中生長。這些細胞可以直接使用或者該表達重組蛋白質可以按照傳統方法例如抽提， 沉澱，色譜法，親合方法，電泳等等來純化。使用的正確的程序取決於產生的特殊蛋白質和 利用的的特殊的載體/宿主表達體系。在一種實施方案中，用於表達該重組載體的宿主細胞是真核生物的細胞。真核生 物的載體宿主系統，和哺乳動物表達體系，允許適當的表達哺乳動物蛋白質的翻譯後修飾 存在，例如，適當的進行主要的轉錄產物，糖基化作用，磷酸化作用和有益地表達產物的分 泌。所以，真核細胞例如哺乳動物細胞可以是用於所關心的的一種多肽的蛋白質的宿主細 胞。這些宿主細胞系的實例包含 CHO，BHK, HEK293, VERO, HeLa, COS, MDCK, NSO 和 W138。在一些實施方案中，使用設計的哺乳動物細胞系統，這些哺乳動物細胞系統利用 重組病毒或者病毒因子來指導所關心的的蛋白質的表達。例如，當使用腺病毒表達載體時， 與TEE或者翻譯增強子多聚核苷酸一起的所關心的蛋白質的編碼序列可以連接到腺病毒 轉錄/翻譯控制複合物，例如，延遲的啟動子和分成三部分的前導序列。然後這些嵌合的基 因可以通過體外或者體內重組被插入到腺病毒基因組中。病毒的基因組的非必要的區域中 插入將產生一種重組病毒，它有活力並且能夠在受感染宿主中表達所關心的多肽(例如， see Logan & Shenk，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3655-3659,1984)。替代地，牛痘病毒 7. 5K啟動子可以被使用，(例如，參見，Mackett等，Proc. Natl. Natl. Acad. Sci.美國，79: 7415-7419，1982 ；Mackett 等，J. Virol. 49 :857_864，1984 ；Panicali 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79 :4927-4931，1982)。特別有興趣的是基於牛乳頭狀瘤病毒的載體，它能夠複製 作為超染色體因子(Sarver等，MoI. Cell. Biol. 1 :486，1981)。通過在質粒中包含一種可選 擇的標記這些載體能被用於穩定的表達，例如新的基因。替代地，逆轉錄病毒基因組可以修 改用作一種能夠引入並且指導所關心的基因在宿主細胞中表達的載體(Cone Mulligan, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 =6349-6353,1984)。高水平表達也可以使用可誘導的啟動子， 包括但不限於，金屬硫蛋白HA啟動子和熱休克啟動子來完成。
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用於重組載體表達的宿主細胞還可以是酵母。可以使用包含結構的或者可誘導的 啟動子的大量載體。參見，例如，Brent等，分子生物學通用操作規程，John Wiley & Sons， 公司(ringbou等，2003)；和酵母的分子生物學，Strathem等(eds.)，冷泉港出版(1982)。 可以使用一種結構的酵母啟動子例如ADH或者LEU2或者一種可誘導的啟動子例如GAL。替 代地，可以使用載體促進外來脫氧核糖核酸序列整合進入到酵母染色體中。如果使用植物表達載體，所關心的的基因的表達可以由大量啟動子的任何一個 來推動。例如，可以使用病毒啟動子例如CaMV的35S核糖核酸和19S核糖核酸啟動子 (Brisson等，自然310-511-514，1984)或者菸草花葉病毒的外殼蛋白啟動子(Takamatsu 等，EMBO J. ,6 307 311,1987) 0替代地，可以使用植物啟動子例如RUBISC0的小亞基 (Coruzzi 等，EMBO J. 3 1671 1680，1984 ；和 Broglie 等，科學 224 :838_843，1984)或者熱 休克啟動子(Gurley 等，MoI. Cell. Biol.，6 -.559-565,1986)。可用於帶有重組載體的所關心的蛋白質的表達的一種替代的表達體系是昆蟲體 系。在這樣的一種體系中，苜蓿尺蠖核型多角體病毒(AcNPV)被用作一種表達外來基因 的載體。該病毒生長在草地貪夜蛾細胞中。綁定多肽編碼序列的核苷酸_鋅指可以克隆 進該病毒的不重要的區域並且置於AcNPV啟動子(例如，多角體蛋白啟動子))的控制之 下。綁定多肽編碼序列的核苷酸_鋅指的成功插入將引起多角體蛋白基因的失活和非封閉 的重組病毒(也就是，通過多角體蛋白基因用於編碼缺乏蛋白質外衣的病毒)的產生。然 後這些重組病毒用於感染細胞，在這些細胞中，插入基因得到表達。參見，例如，Smith等 J. Biol. 46 :584，1983 ；和 Smith，美國專利號 4，215，051)。一旦重組載體被引入合適的宿主細胞，表達的重組蛋白質可以按照常用方法例如 抽提，沉澱，色譜法，親和層析，電泳等等來純化。使用正確的方法既取決於產生的特殊蛋白 質又取決於利用的特殊的表達體系。對於長期的，高產率的重組蛋白質，穩定的表達是優選 的。勝於使用包含複製起點的載體，宿主細胞可以轉化帶有允許穩定的整合載體進入宿主 染色體的載體。帶有穩定地整合的編碼所關心的蛋白質的多聚核苷酸的宿主細胞可以逐漸 形成中心，該中心可以依次克隆並且擴大為細胞系。例如，隨著外來脫氧核糖核酸的進入設 計的細胞可以允許在一種增菌培養基中生長1-2日，然後轉到一種選擇培養基中。V.治療的應用進一步地提供了載體體系，這些載體體系可以用於各種各樣的治療的應用。例如， 用於蛋白質的治療的表達的一種載體可以由上面描述的帶有一種信使核糖核酸TEE或者 翻譯增強子多聚核苷酸和編碼治療的蛋白質的一種多聚核苷酸構成。其他的實例包含用於 疫苗中的載體以便可以實現增加抗原產量。疫苗通常可以由一種表達載體組成，在這裡疫苗抗原的表達是由於一個或多個翻 譯增強子因子(例如，SEQ ID NOs 1-35)的存在而增強的。在一些實施方案中，脫氧核 糖核酸疫苗可以傳遞和表達多於一個抗原。除了編碼該疫苗抗原和該翻譯增強子因子的 序列之外，脫氧核糖核酸疫苗載體一般地也包含一種用於在真核生物的細胞中有活性的 轉錄開始的啟動子。這些脫氧核糖核酸疫苗載體可以根據本領域技術人員眾所周知的方 法來生成。例如，用於給定抗原的脫氧核糖核酸疫苗的製造和使用方法的描述見，例如， Gurunathan 等，Ann. Rev. Immunol. , 18 927, 2000 ；Krieg, Biochim. Biophys. Acta. , 1489 107，1999 ；Cichutek, Dev. Biol. Stand.，100 :119，1999 ；Davis, Microbes Infect.，1 -J,1999 ；和 Leitner,疫苗，18 :765，1999。上面描述的任何載體可以用於表達脫氧核糖核酸疫苗中的一種疫苗抗原。可用於 結構的脫氧核糖核酸疫苗的輔助載體可以包含病毒載體例如ALVAC (—種金絲雀痘病毒)， MVA ( —種牛痘變體)，和ADV5 (腺病毒5)載體，以及質粒載體例如pUC19 (ATCC#_37254)， pcDNA3. 1 (Invitrogen, Carlsbad, CA),pNGVL(國家的基因載體實驗室，密西根州大學，MI)， p414cyc(ATCC#_87380)，pBSL130(ATCC#_87145)，和 pECV25 (ATCC#_77187)。可以用於疫苗 載體的啟動子的實例包含，例如，SV40早期啟動子，巨細胞病毒快速的早期啟動子/增強 子，和各種各樣的在這裡所描述的真核生物的啟動子。疫苗抗原的不同的系列可以由脫氧核糖核酸疫苗來表達。這些包含，例如，愛滋病 病毒-I抗原，肝炎C病毒抗原，B型肝炎病毒抗原，單純性皰疹病毒抗原，痘病毒抗原，流感 病毒抗原，麻疹病毒抗原，登革熱病毒抗原，痢疾內變形蟲抗原，塞姆利基森林病毒抗原，乳 頭狀瘤病毒抗原，間日瘧原蟲和惡性瘧原蟲抗原。可以在脫氧核糖核酸疫苗中表達的抗原 的補充信息可以從網址DNAvaccine. com處獲得。脫氧核糖核酸疫苗可用於使任何患者免疫以防止或者保護阻止病原體的傳染 (例如，愛滋病病毒傳染)。這些患者包含人和非人的動物例如齧齒動物(例如老鼠，家屬 和豚鼠)，豬，小雞，雪貂，非人的靈長類。本技術領域技術了脫氧核糖核酸疫苗給藥到合適 的患者的方法。參見，例如，Webster 等，Vacc，12 =14951498,1994 ；Bernstein 等，疫苗，17 1964，1999 ；Huang 等，Viral Immunol.，12 :1，1999 ；Tsukamoto 等，病毒學 257 :352，1999 ； Sakaguchi 等，疫苗，14 :747，1996 ；Kodihalli 等，J. Virol. ,71 :3391，1997 ；Donnelly 等， 疫苗，15 =865,1997 ；Fuller 等，疫苗，15 =924,1997 ；Fuller 等，免疫細胞生物學，75 :389， 1997 ；Le 等，疫苗，18 1893, 2000 ；Boyer 等，J. Infect. Dis.，181 :476，2000。除了增強通過使用在這裡所描述的特殊的TEE或者信使核糖核酸翻譯增強子多 聚核苷酸的疫苗抗原的表達之外，脫氧核糖核酸疫苗還可以用帶有一種輔助的合適的輔料 配製，可以使用的輔料包含，例如，磷酸鋁或者鋁羥基磷酸物，單磷醯基_脂質體A，QS-21皂 角苷，地塞米松，CpG脫氧核糖核酸序列，霍亂毒素，細胞因子或者趨化因子。這些輔料增強 脫氧核糖核酸疫苗的免疫原性。製備這些改進的脫氧核糖核酸疫苗的方法是本領域技術人 員已知的。參見，例如，Ulmer e/α/·，疫苗 18 18,2000 ；Schneerson 等，J. Immunol. 147 2136-2140,1991 ；Sasaki 等，Immunol. 65 :3520_3528，1997 ;Lodmell 等，疫苗，18 10591066，2000 ；Sasali 等，J. Virol. 72 :4931，1998 ；Malone 等，J. Biol. Chem. 269 :29903， 1994 ；Davis 等，J. Immunol. 15 :870，1998 ；Xin 等，臨床免疫，92 :90，1999 ；Agren 等，免疫細 胞生物學 76 :280，1998 ；和 Hayashi 等，疫苗，18 :3097_3105，2000。在一些實施方案中，提供了用於增強治療各種各樣的疾病的治療的蛋白質的表達 的方法。在這些方法中，懷有翻譯增強子因子或者多聚核苷酸並且表達治療的蛋白質的表 達載體通過載體和靶細胞的相互作用，體外或者體內轉染進入靶細胞。組合物以一足夠量 給藥患者使得患者體內引起治療性的響應。在大量的文獻中這些基因治療方法已經用於矯 正獲得和繼承遺傳缺陷，癌，和病毒感染。參見，例如，Anderson，科學256 =808-813,1992 ； Nabel & Feigner, TIBTECH 11:211_217，1993 ；Mitani & Caskey，TIBTECH 11 :162_166， 1993 ；Mulligan，科學 926-932，1993 ；Dillon, TIBTECH 11 :167_175，1993 ；Miller,自然 357 :455-460，1992 ；Van Brunt,生物技術 6 :1149_1154，1998 ；Vigne 等，RestorativeNeurol,禾口 Neurosci. 8 :35_36，1995 ；Kremer &Perricaudet, Br. Med. Bull. 51 :31_44， 1995 ；Haddada等，微生物學和免疫學中現行主題(DoerfIer & Bohm eds.，1995)；和Yu等， 基因治療 1 :13-26，1994。在這裡所描述的治療的方法適合於治療各種各樣的疾病和病症。這些包含各種各 樣的器官系統的惡性腫瘤，例如，肺，胸部，淋巴的，胃腸的，和生殖-泌尿道。也適合於治 療腺癌，包含惡性腫瘤例如大多數結腸癌，腎細胞癌，前列腺癌，肺的非小細胞癌，小腸的癌 瘤，和食道癌。包含在這裡所公開的一種信使核糖核酸TEE或者翻譯增強子多聚核苷酸的 重組表達載體對治療非惡性的細胞_增生疾病例如牛皮癬，尋常天皰瘡，白塞氏症候群，和 類脂組織細胞增多病也是有用的。實質上，任何用治療的蛋白質可以治療或者改善的任何 病症被認為是對用表達載體治療敏感的，該表達載體由於載體中翻譯增強子因子的存在而 在增多的水平上表達該治療的蛋白質。大量傳送方法可用於在這裡所描述的實踐治療的方法。這些方法對本領域技術人 員是眾所周知的。非病毒載體傳送系統包含脫氧核糖核酸質粒，裸露的核苷酸，和帶有一種 運載工具例如脂質體的核苷酸複合物。病毒載體傳送系統包含脫氧核糖核酸和核糖核酸病 毒，它在傳送給細胞後有游離基因或者整合基因組。核苷酸的非病毒傳遞方法包含脂質體 轉染，微量注射，基因槍方法，病毒顆粒，脂質體，免疫脂質體，聚陽離子或者脂酸共軛物， 裸露的脫氧核糖核酸，人工的病毒粒子，和DNA的增強吸收藥劑。脂質體轉染的描述見，例 如，美國專利號5，049，386，美國專利號4，946，787 ；和美國專利號4，897，355並且脂質體轉 染試劑是商業上銷售的(例如，Transfectam和Lipofectin)。適合於多聚核苷酸的有效的 受體識別脂轉染的陽離子的和中性類脂包含那些，例如，WO 91/17424和WO 91/16024中所 描述的。可以傳送到細胞(體外給藥)或者靶組織(體內給藥)。在許多基因治療應用中，需要基因治療載體高度專一的傳送到一種特定的組織類 型。一般地病毒載體通過病毒外表面上的病毒外殼蛋白表達配位體成為融合蛋白質的方式 改進以對給定的細胞有專一性。選擇的配位體對所關心的細胞上存在的已知的受體是有親 和力的。例如,Han 等(Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 92 :9747_9751，1995)報導說莫洛尼鼠科 的白血病毒可以改進來表達人heregulin融合到gp70，並且該重組病毒感染某些表達人表 皮生長因子受體的人乳癌細胞。這個原則可以延至其他的表達一種配位體融合蛋白質的病 毒對和表達一種受體的靶細胞。例如，絲狀的噬菌體可以設計來顯示抗體片段(例如，FAB 或者Fv)，這些抗體片段對於任何選擇的細胞的受體實際上有特殊的綁定親合力。儘管上面 描述的申請首要對於病毒載體，相同原則可以被用於非病毒載體。這些載體可以被設計包 含那些認為有利於特定的靶細胞吸收的特殊的吸收序列。表達載體通過給個體患者給藥傳送到體內，一般地通過系統的給藥(例如，靜脈 內的，腹膜內的，肌肉的，皮下的，或者顱內的輸注)或者局部施用，如下所述。替代地，載體 可以體外傳送給細胞，例如自個體患者的細胞外植體(例如，淋巴細胞，骨髓抽出物，組織 切片)或者萬能供血者造血幹細胞，然後通常在選擇併入載體的細胞後將該細胞植入到患 者體內。對於診斷，研究，或者對於基因治療(例如，通過轉染的細胞再輸注進入宿主生物 體)的體外細胞轉染對本領域那些熟練的技術人員是眾所周知的。在一種實施方案中，細 胞可以從患者體內分離，用核苷酸(基因或者互補DNA)轉染，並且再注回到患者體內(例 如患者)。適合於體外轉染的各種各樣的細胞類型是本領域技術人員所熟知的(參見，例如，Freshney等，動物細胞培養，一種基本技術指南(第三版，1994)和為了評述怎樣分離和 培養來自患者的細胞在這裡列舉的對照)。實施例提供下列實施例作為進一步闡述，但並不限制其範圍。其他的變形對於本發明所 屬領域普通技術人員來講是顯而易見的並且包括在本發明所附的權利要求保護的範圍內。實施例1識別翻譯增強子的IH反饋載體體系TEE的識別包括一種雙重的單作用子正反饋載體的使用一種是編碼Gal4VP16轉 錄因子的順反子，另一種是編碼Renilla螢光素酶的順反子。兩種順反子包含帶有4拷貝的 上遊活化序列(UAS)的一種最小的啟動子，這種啟動子當綁定到Gal4VP16上增強了轉錄。 當被引入細胞時，該最小的啟動子驅使信使核糖核酸和編碼蛋白質極低的水平。那些可以 增強翻譯進入Gal4VP16順反子的5'引物的序列驅使Gal4VP16信使核糖核酸的翻譯。然 後Gal4VP16蛋白質可以綁定這兩種啟動子增強轉錄，驅使它自己的轉錄和在兩個基因的 啟動子中通過特異的結合部位的另一個順反子的轉錄從而開始正反饋環路。TEE從隨機的 核苷酸序列庫中被識別。在一種實施方案中，僅僅使用編碼增強的GFP(EGFP)的順反子並 且改善信噪比允許每個轉染的細胞的單個庫質粒的分離。確認包括在正反饋體系和非放大 載體體系兩者中的試驗。圖表1闡述了一種示意圖，代表了翻譯增強正反饋載體以及不同的啟動子(PI)和 轉錄增強子(P2)、轉錄因子(TF)基因和所關心的蛋白。轉錄因子基因和所關心的基因可以 在相同的或者不同的質粒上。對於選定區域的應用，一種隨機的核苷酸序列(N)，η個核苷 酸長度，存在於轉錄因子信使核糖核酸的5'引物中。起翻譯增強子因子(TEE)作用的序列 將便於這個信使核糖核酸的翻譯。然後編碼的轉錄因子將綁定到兩個基因的啟動子中的位 點並且增強它們的轉錄。在一種具體實施方案中，該構造表達兩個信使核糖核酸一個編碼 所關心的蛋白質，它可以是一種報導的蛋白質；另一個編碼一種轉錄因子。兩個信使核糖核 酸的轉錄都是通過最小的啟動子驅動的但可以通過經由位於兩個基因的啟動子中的轉錄 因子的結合部位的轉錄因子的表達來增強。少量轉錄因子信使核糖核酸由最小的啟動子表 達但是這個信使核糖核酸的翻譯被編碼轉錄因子的信使核糖核酸的5'引物中的障礙所阻 斷。這個障礙可以是一種穩定的莖-圈結構和/或上遊AUG起始密碼子。這些轉錄因子的 合成取決於編碼這個因子的信使核糖核酸中翻譯增強子的存在。圖2闡述了翻譯增強子驅使的正反饋載體與一種第三蛋白阻礙宿主蛋白質合成。 開頭兩個基因(轉錄因子基因和所關心的基因)除了所有三種信使核糖核酸包含在它們的 5'引物中包含一種球座之外與圖1中的是相同的。通過阻斷宿主信使核糖核酸翻譯並且 減少與它們的競爭第三蛋白質(例如，輪狀病毒NSP3蛋白質)將增強開頭兩個編碼的信使 核糖核酸的翻譯。第三基因在啟動子P3的轉錄控制之下，啟動子P3是一種結構的啟動子 或者一種可誘導的啟動子。P3也可以包含啟動子因子Pl和P2。對於選定區域的應用，對 於所關心的基因的信使核糖核酸和第三蛋白質將包含一種已知的TEE，同時該轉錄因子基 因將包含一種隨機的核苷酸序列。在這個方案中，TEE抵抗第三蛋白質的活性。對於一種 蛋白質生產應用，所有三個基因可以包含一種已知的抵抗第三蛋白質活性的TEE。該三個基 因可以在一個，兩個，或者三個不同的質粒上。使用正反饋體系來識別TEE的更詳細的步驟在前面已經描述過，例如，PCT出版物W02007/025008。實施例2 —致的翻譯增強子樽體的識別使用如上所述的一種雙重的單作用子正反饋載體系統，那些在中國倉鼠卵巢 (CHO)及其他細胞系，包含BHK(小型的倉鼠腎)細胞中起翻譯增強子作用許多短的核苷酸 序列被識別。這些翻譯增強子因子(TEE)長度範圍在七個到十二個不等。如圖3所示，這些 TEE的多拷貝在CHO細胞中增強了蛋白質產量直到25倍。在每一個實施例中，在螢光蟲熒 光素酶順反子的5'引物中至少有5個相同的TEE連接的拷貝。第一個結構是不包含TEE 的大小對比對照。結構被短暫地轉染的進CHO細胞並且在2日後試驗。翻譯效率涉及大小 對比對照結構的活性。在圖3中，頂端13條信號號分別低於相應的對照條信號的由13個 不同的TEE的5個拷貝得到的結果。其次的兩個條信號顯示了 5個或者15個拷貝的另一 個TEE的翻譯增強活性。底下的條信號闡明了當使用5-25個拷貝時又一個TEE序列的翻 譯增強活性。這些TEE的幾個顯示了序列相似性，並且被公認的一致的模體由這些TEE來識 別(參見圖4)。TEE模體的兩個實施方案的序列如下RNSGAGMGRMR(SEQ ID N0:1)，和 MSCSGCNGMWA (SEQ ID NO :2)。注意到在這些序列中，R表示A或者G，M表示A或者C，S表 示G或者C，W表示A或者U，以及N表示A，G，C或者U。在另一個實施方案中，模體Ia序列是模體1是RmiSlGAGMlGR2M2R2R3R4(SEQ ID NO :3)。在這一序列中，Rl是缺失，如果存在的話，是A或者G ；Nl是缺失，如果存在的話，是 A、C或者G，優選是A、C、或者G ;S1是缺失，如果存在的話是C或者G，優選是C或者G ；Ml 是A或者C ；R2是缺失，如果存在的話，是A或者G，優選是A或者G，並且，Rl和R2可以是 相同的或者不同的；M2是缺失，如果存在的話，是A或者C，優選是A或者C ；R3是缺失，如 果存在的話，是A或者G，優選是缺失；R4是缺失，如果存在的話，是C，優選是缺失。在另一 個實施方案中，模體 1 是 RmiSlGAGMlGR2M2R2R3R4(SEQ ID NO :3)，其中 R1、R3、R4 是缺失， 附是A、C或者G ;S1是C或者G ;M1是A或者C ;R2是A或者G並且M2是A或者C。在另一個實施方案中，模體2a序列R5M3S2CS3GCN2GM4WR6(SEQ ID NO :4)。在此 序列中，R5是缺失，如果存在的話，是A，優選是缺失；M3是缺失，如果存在的話，是C或者A， 優選是C或者A ；S2是缺失，如果存在的話，是C或者G，優選是C或者G ;S3是G或者C ;N2 是G、C或者T ;M4是A或者C ；W是缺失，如果存在的話是A或者T ；R6是缺失，如果存在的 話是A。在另一個實施方案中，模體2是R5M3S2CS3GCN2GM4WR6(SEQ ID NO :4)。在此序列 中，R5和R6是缺失；M3是缺失，如果存在的話是A或者C ;S2是C或者G ； S3是C或者G並 且S2和S3可以是相同的或者不同的；N2是G、C或者T ;M2是A或者C ;W是缺失，如果存在 的話是A。^MM 3合成言核Il翻譯t曾強子因子 射舌個牛基於上述注釋的一致模體，合成大略相當於模體1和2的各種各樣的特異的TEE 序列並且試驗翻譯增強活性(參見表格1的SEQ ID Ν0:5-35)。包含試驗序列的脫氧核糖核 酸片段由兩個重疊，互補的寡聚核苷酸彼此合成以及退火後生成。退火的寡聚核苷酸在每 個末端有未配對的核苷酸，它對使用EcoRl以及BamHl.克隆進載體提供了粘末端。該片段 在如實施例1中所述的正反饋表達載體中被克隆進螢光素酶報導基因信使核糖核酸的5' 引物。包含模體序列的Renilla螢光素酶結構然後短暫地轉染進CHO細胞。3日後對細胞
21試驗這些測試序列增強翻譯的能力。一種對比對照(對照)質粒在克隆區域中包含polyA。 報導基因多肽的翻譯效率上TEE的效果如圖5所示。結果表明一致的模體是可預計相當於這些的模體的一個的一種TEE的翻譯增強 活性的。也如同該圖中顯示的，基於模體1的TEE序列比那些基於模體2的TEE序列往往 引起更高的增強翻譯水平。表1相當於一致的模體1 (Ml)和2(M2)在這裡所描述的新的翻譯增強子可以有各種各樣的實際的和工業的應用。例如， 他們可以最小化與工業規模培養有關的成本並且減少藥劑成本。較高的蛋白質濃度還可以 便於蛋白質提純。另外，這些翻譯增強子增強子可以實現那些由於弱的蛋白質表達而不可 能的過程，例如從一種脫氧核糖核酸疫苗中表達足夠的抗原來產生一種免疫反應。這些可 用於顯著地提高哺乳動物細胞中特殊蛋白質的產率。例如，許多治療的蛋白質在CHO細胞 中被表達以確保正確的翻譯後過程，CHO細胞是最常使用的用於大規模生產治療的蛋白質。 除工業的蛋白質生產之外，翻譯增強子在各種各樣的載體體系中有潛在的使用。例如，為了 研究目的，蛋白質治療的表達，和脫氧核糖核酸疫苗，為了增強抗原產量。儘管本發明說明書包含了具體實施方案並參照其優選的實施方案進行了描述，但 這些並不應被認為是本發明要求保護的範圍或者任意可以要求保護的範圍的限制，這只是 對特定實施方案特點的描述。本發明所屬領域普通技術人員可以理解，在不脫離這裡描述 的本發明的意思的情況下，在形式和細節上，本發明可以存在多種變化。在本發明說明書中 描述的某些特點以及相互獨立的實施方案還可以被結合到一個實施方案中。反之，單一實 施方案所具有的各種特點可以分別被結合在多個實施方案中或者結合在任意合適的子結 合中。此外，儘管上面描述的特點以結合的方式發揮作用或者最初以結合的方式要求保護， 但在某些情況下，可以從這種要求保護的結合中刪除一種或一種以上特點，並且要求保護 的結合可以包括一種亞結合或者亞結合的變體。本發明的範圍被隨後的權利要求書定義。在說明書中引用的所有的出版物、資料庫、GenBank序列、專利和專利申請通過引 證在此全部併入本文，如同其中每個都被分別地特定的顯示通過引證併入本文。
權利要求
一種分離的多核苷酸序列包含至少一種信使核糖核酸翻譯增強因子(TEE)，在這裡TEE由R1N1S1GAGM1GR2M2R2R3R4(SEQ ID NO3)或者R5M3S2CS3GCN2GM4WR6(SEQ ID NO4)、或者其基本上相同的序列組成，其中，R1是缺失，如果存在的話，是A或者G；N1是缺失，如果存在的話，是A、C或者G，優選是A、C、或者G；S1是缺失，如果存在的話是C或者G，優選是C或者G；M1是A或者C；R2是缺失，如果存在的話，是A或者G，優選是A或者G，並且，R1和R2可以是相同的或者不同的；M2是缺失，如果存在的話，是A或者C，優選是A或者C；R3是缺失，如果存在的話，是A或者G，優選是缺失；R4是缺失，如果存在的話，是C，優選是缺失；並且，R5是缺失，如果存在的話，是A，優選是缺失；M3是缺失，如果存在的話，是C或者A，優選是C或者A；S2是缺失，如果存在的話，是C或者G，優選是C或者G；S3是G或者C；N2是G、C或者T；M4是A或者C；W是缺失，如果存在的話是A或者T；R6是缺失，如果存在的話是A。
2.根據權利要求1的分離的多聚核苷酸序列，在這裡TEE由R1N1S1GAGM1GR2M2R2R3R4組 成。在這裡R1, R3和R4是缺失的A1是A，C或G ^是C或者G諷是A或者C ;R2是A或者 G並且M2是A或者C。
3.根據權利要求1的分離的多聚核苷酸序列，在這裡TEE由R5M3S2CS3GCN2GM4WR6組成， 在這裡R5和R6是缺失;M3是缺失，如果存在的話是A或者C ;S2是C或者G ；S3是C或者G 並且S2和S3可以是相同的或者不同的；N2是G、C或者T ;M2是A或者C ；W是缺失，如果存 在的話是A。
4.根據權利要求1，2或者3中任意一項的分離的多聚核苷酸序列，在這裡翻譯增強因 子(TEE)具有的序列與SEQ ID NO :5-35組成的序列群中選擇的一個序列有至少90%的一 致性。
5.根據權利要求1，2或者3中任意一項的分離的多聚核苷酸序列，在這裡翻譯增強因 子(TEE)具有的序列與從SEQ ID NO :5-35組成的序列群中選擇的一個序列相同。
6.根據權利要求1，2或者3中任意一項的分離的多聚核苷酸序列，它包含TEE的至少 2個拷貝。
7.根據權利要求1，2或者3中任意一項的分離的多聚核苷酸序列，它包含TEE的至少 5個拷貝。
8.根據權利要求1，2或者3中任意一項的分離的多聚核苷酸序列，它包含TEE的至少 10個拷貝。
9.用於在真核細胞中重組表達多肽的載體，這種載體包括一種真核啟動子，這種真核 啟動子與一種多聚核苷酸序列可操作的相連，所述聚核苷酸序列包括至少一個這裡公開的 mRNA翻譯增強因子(TEE)，在這裡TEE是從權利要求1，2或者3的TEE中選擇的。
10.根據權利要求9的載體，在這裡信使核糖核酸增強因子組成的序列與從SEQID NO 5-35組成的序列群中選擇的一個序列實際上是相同的。
11.根據權利要求9的載體，在這裡信使核糖核酸增強因子組成的序列與從SEQID NO 5-35組成的序列群中選擇的一個序列是相同的。
12.根據權利要求9的載體，在這裡信使核糖核酸增強因子位於3』引物端並且適合定 向連接編碼所關心的多肽的第二段多聚核苷酸序列。
13.根據權利要求9的載體，進一步包含編碼所關心的多肽的第二段多聚核苷酸序列， 這個多聚核苷酸序列可操作地連接到信使核糖核酸增強因子。
14.根據權利要求9的載體，在這裡信使核糖核酸增強因子位於第二段多聚核苷酸序 列的5』引物序列。
15.一種DNA疫苗包含根據權利要求9的載體。
16.一種真核宿主細胞轉染根據權利要求9的載體。
17.根據權利要求16的宿主細胞，在這裡宿主細胞是CHO細胞。
18.用於重組的生產一種多肽的方法包含(i)構建一種表達載體，這種表達載體包括一種真核啟動子和mRNA翻譯增強因子，每 個都與編碼所關心多肽的聚核苷酸可操作的相連，在這裡TEE是從權利要求1，2或者3的 TEE中選擇的。( )轉染表達載體計入真核宿主細胞；並且(iii)培養轉染帶有表達載體的宿主細胞；從而生產多肽。
19.根據權利要求18的方法，在這裡信使核糖核酸增強因子組成的序列與從SEQID NO 5-35組成的序列群中選擇的一個序列實際上是相同的。
20.根據權利要求18的方法，在這裡信使核糖核酸增強因子組成的序列與從SEQID NO 5-35組成的序列群中選擇的一個序列是相同的。
21.根據權利要求18的方法，進一步包含純化的重組多肽。
22.根據權利要求18的方法，在這裡宿主細胞是CHO細胞。
23.根據權利要求18的方法，在這裡多肽是治療的蛋白質。
全文摘要
這裡提供了mRNA翻譯增強因子(TEEs)，例如，SEQ ID Nos1-35。還提供了包括一種或者一種以上這裡例舉的具體TEEs或其變體、類似物或其功能性衍生物的翻譯增強聚核苷酸。進一步提供了包括這種TEEs或翻譯增強聚核苷酸的表達載體，以及含有這種載體的宿主細胞和表達系統。
文檔編號C12N15/10GK101939428SQ200880126367
公開日2011年1月5日 申請日期2008年12月11日 優先權日2007年12月11日
發明者G·M·伊德爾曼, V·P·莫羅, 周偉 申請人:斯克利普斯研究所