一種超大孔連續床晶膠介質及其製備方法
2023-05-15 20:28:51 1
專利名稱：一種超大孔連續床晶膠介質及其製備方法
技術領域：
本發明涉及一種超大孔連續床晶膠介質及其製備方法，屬於生物分離與醫藥技術領域。
背景技術：
超大孔連續床層析分離方法是繼擴張床吸附層析後的又一重要的新型生物層析分離技術，可在高流速下實現從複雜料液系統中直接提取和分離目標物。超大孔連續床內有尺寸達數微米至數百微米的超大孔隙，可以使原料液中的細胞、細胞碎片等固相順利通過，並可實現與擴張床可比擬的高速處理，其成本較低。該方法綜合了擴張床和傳統固定床的優點，將離心、過濾、濃縮和層析分離幾個步驟集為一體，其操作壓力低，目標物在床內的停留時間短，選擇性強，在重組蛋白、酶、基因治療用質粒DNA等重要生物大分子物質以及醫學領域對抗體、特殊目標細胞(如癌細胞)、微生物細胞的分離純化方面有廣闊應用前景。
晶膠介質的製備方法是超大孔連續床的關鍵技術。國外對超大孔連續床技術及介質製備方法的研究始於近兩年，主要是歐洲的研究小組，尚處於起步階段。國內尚沒有相關研究報導。目前，晶膠介質吸附容量低(例如對溶菌酶的吸附容量約0.2mg/ml介質)是急需解決的問題，需要相關的製備方法與技術。納米級吸附介質顆粒比表面積巨大，活性高，對蛋白質、酶等生物大分子的吸附容量較常規微米級介質的吸附容量高出1～2個數量級。最近，基於納米級吸附介質發展起來的生物質納米介質磁分離技術，具有吸附迅速、吸附容量大的優點，還可以直接處理含有細胞或細胞碎片的複雜料液。但是，將這些納米級吸附介質從料液中分離出來所需要的磁場強度高，而實際規模化應用時所需的磁場強度不易達到，且強磁場產生的熱效應影響目標物的穩定性，對生物質的分離不利，大規模產業化有困難。
發明內容本發明綜合利用納米級吸附介質高吸附容量的優點，以及超大孔連續床集成化分離的優勢，避免了外場分離的不利方面，提供了一種具有高吸附容量和分離效率的超大孔連續床晶膠介質。
本發明還提供了一種所述超大孔連續床晶膠介質的製備方法。
本發明所述的超大孔連續床晶膠介質內嵌有尺寸為1～500nm的吸附介質顆粒，所述的吸附介質顆粒優選為1～100nm的納米粒，如納米Fe3O4、TiO2、SnO2、Fe2O3以及外裹磷脂類分子膜的複合納米粒(如外裹1，2-肉豆蔻醯磷脂醯膽鹼DMPC、2-肉豆蔻醯磷脂醯甘油DMPG等的內核為金屬的複合納米粒)等，優選為下列之一Fe3O4磁性納米粒、DMPG複合納米粒、DMPC複合納米粒。
所述的晶膠介質具有如下物化性能孔隙率70～95％，孔徑範圍5～200μm；流速在0.2～15cm/min範圍內，晶膠床柱內等板高度小於0.1mm；吸附容量1～50mg BSA/ml床層介質。
本發明所述超大孔連續床晶膠介質的製備方法，包括如下步驟(1)製備穩定劑穩定並分散的吸附介質顆粒混合液，所述顆粒的尺寸在1～500nm；(2)將床層骨架聚合物單體、交聯劑、配基材料、吸附介質顆粒混合液、水混合均勻，形成含單體、交聯劑、配基材料、吸附介質顆粒總濃度2～15w/v％的混合液，加入引發劑聚合併置入冷卻系統中進行冷卻結晶，然後升溫至室溫使晶體融化形成超大孔隙，即得內嵌吸附介質顆粒的超大孔連續床晶膠介質。
所述的步驟(2)中各組分用量優選的百分含量為聚合物單體佔混合液的2～14w/v％，聚合物單體∶交聯劑∶配基材料∶吸附介質顆粒∶催化劑的重量比為1∶0.05～0.4∶0.05～0.2∶0.01～0.5∶0.01～0.05。
步驟(1)中所述的穩定劑如羥丙基纖維素、短鏈脂肪酸(異戊酸、己酸、辛酸、癸酸等)，長鏈脂肪酸(C12、C14、C16、C18等)和不飽和脂肪酸等，優選為C8-C12的脂肪酸，穩定劑的用量為吸附介質顆粒質量的0.1-5倍。
所述的床層骨架聚合物單體如丙烯醯胺(AAm)、N，N-二甲基丙烯醯胺(DMAAm)、甲基丙烯酸二甲氨基乙酯(DMAEMA)等，優選為下列之一AAm、DMAAm；所述的吸附介質顆粒優選為1～100nm的納米級顆粒，如納米Fe3O4、TiO2、SnO2、Fe2O3以及外裹磷脂類分子膜的複合納米粒(如外裹1，2-肉豆蔻醯磷脂醯膽鹼DMPC、2-肉豆蔻醯磷脂醯甘油DMPG等的內核為金屬的複合納米粒)等，優選為下列之一Fe3O4磁性納米粒、DMPG複合納米粒、DMPC複合納米粒；所述的交聯劑如N，N′-亞甲基雙丙烯醯胺(MBAAm)、N，N′-雙烯丙醯基乙二胺等，優選為MBAAm；所述的配基材料如烯丙基縮水甘油醚(AGE)、1，4-丁二醚等，優選為AGE；所述的催化劑為聚合反應的引發劑、加速劑等，如硫酸銨(APS)、四甲基乙二胺(TEMED)、三乙醇胺、二甲氨基丙睛(DMPN)等，優選為過硫酸銨(APS)和四甲基乙二胺(TEMED)。
步驟(2)中所述的反應液在0～-50℃範圍內冷卻結晶，多次反覆的降溫、升溫能促使晶膠介質的生成。適宜的變化歷程為(A)降溫1～3小時內，由0℃下降到-10～-30℃；(B)恆溫恆溫3～18小時；(C)升溫1～5小時內，升溫至0℃以上，當達-5～5℃時加入介質體積的25％～90％的水，以減少介質的收縮。
再優選的變化歷程為(A)降溫1～3小時內，由0℃下降到-10～-30℃；(B)升溫1～3小時內，升溫至5～10℃；(C)恆溫恆溫0.5～3小時；(D)降溫1～3小時內，重新降溫至-5～-20℃；(E)恆溫恆溫5～18小時；(F)升溫1～5小時內，升溫至1～10℃，當達-5-5℃時加入介質體積的25％～90％的水，以減少介質的收縮。
步驟(2)中所述的反應液冷卻結晶的溫度變化歷程再優選為(A)線性降溫1.5小時內，由0℃下降到-20℃；(B)線性升溫1.5小時內，升溫至5℃；(C)恆溫恆溫1小時；(D)線性降溫1.5小時內，重新降溫至-15℃；(E)恆溫恆溫12小時；(F)線性升溫2小時內，升溫至4℃，當達0℃時加入介質體積的50％的水，以減少介質的收縮。
為了得到更純的晶膠介質，還可以對製得的晶膠介質進行清洗以除去穩定劑、未聚合的單體、交聯劑、及未固載的吸附介質顆粒等。如具體方法可以是用蠕動泵在低流速下向晶膠介質內泵入有機溶劑(如丙酮、乙醇、甲醇、異丙醇等的水溶液)，使得吸附介質顆粒周圍的穩定劑溶解洗脫；然後向其中注入水或者緩衝液，除去介質孔隙內未聚合的單體、交聯劑、穩定劑及未固載的吸附介質顆粒，得到可用於生物大分子物質的吸附分離的晶膠介質。
本發明所述的晶膠介質，具有如下特性1)晶膠介質的物理性能孔隙率70～95％，孔徑範圍5～200μm，連通性好；水流速1cm/min時，柱壓降梯度小於0.05atm/cm；流速在0.2～15cm/min範圍內，介質的結構不變。
2)晶膠介質的吸附分離性能流速在0.2～15cm/min範圍內，晶膠床柱內等板高度小於0.1mm，分離性能良好；吸附容量1～50mg BSA/ml床層介質，適於分子量10000～100000範圍的蛋白質、酶、尺寸10～1000nm質粒DNA等生物大分子的直接分離。
3)晶膠介質的壽命可方便地再生，重複使用20次以上。
本發明所述的晶膠介質具有如下優點1)採用結晶致孔方法，單體材料易得，工藝簡單迅速，成本低，規模化生產十分容易；2)晶膠介質超大孔隙尺寸較均勻，連通性好，晶膠介質與床柱壁面間沒有「短路」孔；3)吸附容量大，可再生，便於在生物、醫學、藥物等領域的規模化分離過程中應用。
(四)
具體實施例方式
下面結合實施例對本發明作進一步說明，但本發明的保護範圍並不限於此。
實施例1將4.5g FeCl2·4H2O和12.3g FeCl3·6H2O溶於230ml去離子水中，加熱到84℃，向其中加入40ml含0.8g癸酸的乙醇溶液和18ml 28％的NH4OH，攪拌；然後，繼續加入癸酸19g，恆溫攪拌60min，冷卻至室溫，得到尺寸在10～15nm的Fe3O4磁性納米粒吸附介質。用分子量截留值MWCO 10000的半透膜透析48小時以除去小分子雜質，製備得到穩定分散的Fe3O4納米粒吸附介質混合液。
將1.4g丙烯醯胺單體，0.17g交聯劑MBAAm和0.27g配基材料AGE溶於12ml去離子水中，加入10ml含260mg Fe3O4磁性納米粒吸附介質的混合液，攪拌均勻後，迅速加入10mg TEMED和23mg APS，將所得混合液裝入內徑16mm、長200mm的玻璃層析柱內，密封后，在可程序控溫的恆溫冷卻系統中，進行冷卻結晶致孔。溫度變化歷程為(A)線性降溫1.5小時內，由0℃下降到-20℃；(B)線性升溫1.5小時內，升溫至5℃；(C)恆溫恆溫1小時；(D)線性降溫1.5小時內，由0℃重新降溫至-15℃；(E)恆溫恆溫12小時；(F)線性升溫2小時內，升溫至4℃，當達0℃左右時加入10ml的水，以減少介質的收縮；然後，在室溫下融化晶體，形成超大孔隙，得到內嵌納米粒超大孔連續床晶膠介質。用掃描電子顯微鏡SEM和透射電子顯微鏡TEM，分別對介質的超大孔及納米粒內嵌情況進行了分析。製備得到的介質外觀呈褐色，孔隙率89％，SEM顯示其孔徑範圍10～50μm，連通性好；水流速1cm/min時，柱壓降梯度小於0.03atm/cm；流速在0.2～15cm/min範圍內，介質的結構不變，晶膠床柱內等板高度0.09mm，分離性能良好；吸附容量10mg BSA/ml床層介質，適於生物大分子的直接分離，可再生。介質經乾燥後，結構不變，重新置於水中，1～2秒內即恢復原狀，彈性和耐壓性能很好。
實施例2將2.9g DMAEMA單體，0.15g交聯劑MBAAm和0.16g配基材料AGE溶於15ml去離子水中，加入7ml十二酸穩定的含60mg TiO2納米粒(450nm)吸附介質的混合液，攪拌均勻後，迅速加入12mg TEMED和25mg APS，將所得混合液裝入內徑16mm、長200mm的玻璃層析柱內，密封后，在可程序控溫的恆溫冷卻系統中，進行冷卻結晶致孔。溫度變化歷程為(A)線性降溫1.8小時內，由0℃下降到-25℃；(B)線性升溫2小時內，升溫至3℃；(C)恆溫恆溫2小時；(D)線性降溫3小時內，由0℃重新降溫至-17℃；(E)恆溫恆溫18小時；(F)線性升溫4小時內，升溫至5℃，當達0℃左右是加入15ml的水，以減少介質的收縮；在室溫下融化晶體，形成超大孔隙。這樣，得到內嵌納米粒超大孔連續床晶膠介質，其孔隙率72％，孔徑範圍5～40μm，連通性好；水流速1cm/min時，柱壓降梯度小於0.028atm/cm；流速在0.2～13cm/min範圍內，介質的結構不變，晶膠床柱內等板高度0.07mm，分離性能良好；吸附容量2.2mgBSA/ml床層介質，適於生物大分子的直接分離，可再生。
實施例3將2.5g DMAAm單體，0.25g交聯劑MBAAm和0.27g配基材料AGE溶於50ml去離子水中，加入19ml十二酸穩定的含750mg Fe2O3納米粒(32nm)吸附介質的混合液，攪拌均勻後，迅速加入27mg TEMED和72mgAPS，將所得混合液裝入內徑26mm、長300mm的玻璃層析柱內，密封后，在可程序控溫的恆溫冷卻系統中，進行冷卻結晶致孔。溫度變化歷程為(A)線性降溫2.4小時內，由0℃下降到-23℃；(B)線性升溫2小時內，升溫至4℃；(C)恆溫恆溫1小時；(D)線性降溫5小時內，由0℃重新降溫至-12℃；(E)恆溫恆溫18小時；(F)線性升溫4小時內，升溫至10℃，當達0℃左右是加入15ml的水，以減少介質的收縮；在室溫下融化晶體，形成超大孔隙。這樣，得到內嵌納米粒超大孔連續床晶膠介質，其孔隙率94％，孔徑範圍15～120μm，連通性好；水流速1cm/min時，柱壓降梯度小於0.028atm/cm；流速在0.1～15cm/min範圍內，介質的結構不變，晶膠床柱內等板高度0.1mm，分離性能良好；吸附容量38mg BSA/ml床層介質，適於生物大分子的直接分離，可再生。
實施例4將含有SnO2混合液與含DMPC的溶液混合，經超聲波乳化分散，製備得到穩定分散的複合納米粒混合液。將5.8g DMAAm單體，1.2g交聯劑MBAAm和0.48g配基材料AGE溶於23ml去離子水中，加入26ml含2300mgDMPC複合納米粒吸附介質的混合液，攪拌均勻後，迅速加入27mg TEMED和39mg APS，將所得混合液裝入內徑26mm、長200mm的玻璃層析柱內，密封后，在可程序控溫的恆溫冷卻系統中，進行冷卻結晶致孔。溫度變化歷程為(A)線性降溫1.5小時內，由0℃下降到-20℃；(B)恆溫恆溫14.5小時；(C)線性升溫3小時內，升溫至5℃，當達0℃左右時加入20ml的水，以減少介質的收縮；然後，在室溫下融化晶體，形成超大孔隙，得到內嵌納米粒超大孔連續床晶膠介質，孔隙率83％，孔徑範圍10～120μm，連通性好；水流速1cm/min時，柱壓降梯度0.012atm/cm；流速在0.2～15cm/min範圍內，介質的結構不變，晶膠床柱內等板高度0.069mm，分離性能良好；吸附容量49mgBSA/ml床層介質，適於生物大分子的直接分離，可再生。
實施例5將十二酸穩定的Fe3O4混合液與含DMPG的溶液混合，經超聲波乳化分散，製備得到穩定分散的DMPG複合納米粒混合液。將1.1g AAm單體，0.4g交聯劑MBAAm和0.21g配基材料AGE溶於33ml去離子水中，加入6ml含120mg DMPC複合納米粒(20nm)吸附介質的混合液，攪拌均勻後，迅速加入9mg TEMED和20mg APS，將所得混合液裝入內徑16mm、長300mm的玻璃層析柱內，密封后，在可程序控溫的恆溫冷卻系統中，進行冷卻結晶致孔。溫度變化歷程為(A)線性降溫1小時內，由0℃下降到-12℃；(B)恆溫恆溫18小時；(C)線性升溫5小時內，升溫至4℃，當達0℃左右時加入5ml的水，以減少介質的收縮；然後，在室溫下融化晶體，形成超大孔隙，得到內嵌納米粒超大孔連續床晶膠介質，孔隙率95％，孔徑範圍10～180μm，連通性好；水流速1cm/min時，柱壓降梯度0.01atm/cm；流速在0.1～15cm/min範圍內，介質的結構不變，晶膠床柱內等板高度0.097mm，分離性能良好；吸附容量17mg BSA/ml床層介質，適於生物大分子的直接分離，可再生。
實施例6將7.8g丙烯醯胺，2.4g交聯劑MBAAm和1.2g配基材料AGE溶於60ml去離子水中，加入30ml含670mg DMPC與DMPG(質量比1∶1.5)複合納米粒(22nm)吸附介質的混合液，攪拌均勻後，迅速加入110mg TEMED和251mg APS，將所得混合液裝入內徑26mm、長300mm的玻璃層析柱內，密封后，在可程序控溫的恆溫冷卻系統中，進行冷卻結晶致孔。溫度變化歷程為(A)線性降溫3小時內，由0℃下降到-42℃；(B)線性升溫2小時內，升溫至3℃；(C)恆溫恆溫0.5小時；(D)線性降溫3小時內，由0℃重新降溫至-12℃；(E)恆溫恆溫18小時；(F)線性升溫2小時內，升溫至5℃，當達0℃左右是加入20ml的水，以減少介質的收縮；然後，在室溫下融化晶體，形成超大孔隙，得到內嵌納米粒超大孔連續床晶膠介質，孔隙率86％，孔徑範圍10～70μm，連通性好；水流速1cm/min時，柱壓降梯度0.03atm/cm；流速在0.1～15cm/min範圍內，介質的結構不變，晶膠床柱內等板高度0.069mm，分離性能良好；吸附容量28mg BSA/ml床層介質，適於生物大分子的直接分離，可再生。
權利要求
1.一種超大孔連續床晶膠介質，其特徵在於所述的晶膠介質內嵌有尺寸為1～500nm的吸附介質顆粒。
2.如權利要求1所述的超大孔連續床晶膠介質，其特徵在於所述的吸附介質顆粒為1～100nm的納米粒，晶膠介質具有如下物化性能孔隙率70～95％，孔徑範圍5～200μm；流速在0.2～15cm/min範圍內，晶膠床柱內等板高度小於0.1mm；吸附容量1～50mg BSA/ml床層介質。
3.一種權利要求1所述超大孔連續床晶膠介質的製備方法，包括如下步驟(1)製備穩定劑穩定並分散的吸附介質顆粒混合液，所述顆粒的尺寸在1～500nm；(2)將床層骨架聚合物單體、交聯劑、配基材料、吸附介質顆粒混合液、水混合均勻，形成含單體、交聯劑、配基材料、吸附介質顆粒總濃度2～15w/v％的混合液，加入催化劑聚合併置入冷卻系統中進行冷卻結晶，然後升溫至室溫使晶體融化形成超大孔隙，即得內嵌吸附介質顆粒的超大孔連續床晶膠介質。
4.如權利要求3所述的超大孔連續床晶膠介質的製備方法，其特徵在於所述的步驟(2)中聚合物單體佔混合液的2～14w/v％，所述的聚合物單體∶交聯劑∶配基材料∶吸附介質顆粒∶催化劑的重量比為1∶0.05～0.4∶0.05～0.2∶0.01～0.5∶0.01～0.05。
5.如權利要求3所述的超大孔連續床晶膠介質的製備方法，其特徵在於步驟(1)中所述的穩定劑為C8～C12的脂肪酸，穩定劑用量為吸附介質顆粒質量的0.1～5倍。
6.如權利要求3所述的超大孔連續床晶膠介質的製備方法，其特徵在於所述的床層骨架聚合物單體為下列之一丙烯醯胺、N，N-二甲基丙烯醯胺、2-二甲氨基甲基丙烯酸乙酯；所述的交聯劑為N，N′-亞甲基雙丙烯醯胺，所述的配基材料為烯丙基縮水甘油醚，所述的催化劑為過硫酸銨和四甲基乙二胺。
7.如權利要求3所述的超大孔連續床晶膠介質的製備方法，其特徵在於所述的吸附介質顆粒為下列之一Fe3O4磁性納米粒、外裹1，2-肉豆蔻醯磷脂醯膽鹼DMPC複合納米粒或2-肉豆蔻醯磷脂醯甘油DMPG複合納米粒。
8.如權利要求3～7之一所述的超大孔連續床晶膠介質的製備方法，其特徵在於步驟(2)中所述的反應液在0～-50℃範圍內冷卻結晶。
9.如權利要求8所述的超大孔連續床晶膠介質的製備方法，其特徵在於反應液冷卻結晶的溫度變化歷程為(A)降溫1～3小時內，由0℃下降到-10～-30℃；(B)恆溫恆溫3～18小時；(C)升溫1～5小時內，升溫至0℃以上，當達-5～5℃時加入介質體積的25％～90％的水，以減少介質的收縮。
10.如權利要求9所述的超大孔連續床晶膠介質的製備方法，其特徵在於所述的反應液冷卻結晶的溫度變化歷程為(A)線性降溫1.5小時內，由0℃下降到-20℃；(B)線性升溫1.5小時內，升溫至5℃；(C)恆溫恆溫1小時；(D)線性降溫1.5小時內，重新降溫至-15℃；(E)恆溫恆溫12小時；(F)線性升溫2小時內，升溫至4℃，當達0℃時加入介質體積的50％的水，以減少介質的收縮。
全文摘要
本發明提供了一種超大孔連續床晶膠介質及其製備方法。所述的超大孔連續床晶膠介質內嵌有尺寸為1～500nm的吸附介質顆粒，所述的製備方法包括如下步驟(1)製備穩定劑穩定並分散的吸附介質顆粒混合液；(2)將床層骨架聚合物單體、交聯劑、配基材料、吸附介質顆粒混合液、水混合均勻，形成混合液，加入引發劑聚合併置入冷卻系統中進行冷卻結晶，然後升溫至室溫使晶體融化形成超大孔隙，即得內嵌吸附介質顆粒的超大孔連續床晶膠介質。本發明所述的晶膠介質超大孔隙尺寸較均勻，連通性好，晶膠介質與床柱壁面間沒有「短路」孔；吸附容量大，可再生，便於在生物、醫學、藥物等領域的規模化分離過程中應用。
文檔編號B01D15/08GK1736579SQ200510060269
公開日2006年2月22日 申請日期2005年8月2日 優先權日2005年8月2日
發明者貟軍賢, 姚克儉, 沈紹傳 申請人:浙江工業大學