抑制轉穀氨醯胺酶的肽的製作方法

2023-05-15 23:49:46 3

專利名稱：：抑制轉穀氨醯胺酶的肽的製作方法
技術領域：
：本發明涉及轉穀氨醯胺酶肽抑制劑。更具體而言，本發明涉io及轉穀氨醯胺酶特異性肽抑制劑，其抑制轉穀氨醯胺酶介導的I-KBa聚合，因此有效地預防和治療由轉穀氨醯胺酶活化引起的疾病。本發明也涉及包含一種或多種轉穀氨醯胺酶肽抑制劑作為活性成分的藥學組合物，以及涉及使用該組合物預防和治療由於轉穀氨醯胺酶活化所引起的疾病的方法。1
背景技術：
：轉穀氨醯胺酶是保護性酶，其在正常條件下是造成對組織受損應答的血凝固的原因。然而，這些酶也被報導在缺乏其表達水平20調控的多種疾病的病理機制中，起關鍵作用(Soo-YoulKim:NewTargetAgainstInflammatoryDiseases:Transglutaminase2.Ac/n'v羅/wmwwo/og/aecfeT7era//ae52，332-337,2004.Soo-YoulKim.Transglutaminase2ininflammation,i^owf5/os"'.11,3026-3035，2006)。特別地，當多種炎性疾病發生時，轉穀氨醯胺酶的表達增加，25所述炎性疾病包括類風溼性關節炎、糖尿病、炎性肌炎、動脈粥樣壞死、中風、肝硬化、乳腺癌、阿爾茨海默氏病、帕金森病、杭廷頓舞蹈病、腦炎、腹部疾病等。當癌症開始轉移或改變成化學抗性或抗輻射性時，也觀察到轉穀氨醯胺酶和NF-kB表達水平的增加(Soo-YoulKim.Transglutaminase2ininflammation.FrawfB/cwc/.11，3026-3035,302006)。癌症中轉穀氨醯胺酶和化學抗性的關係，至今仍保持不清楚。然而，當轉穀氨醯胺酶表達在化學抗性的乳腺癌細胞中被抑制時，癌細胞變得高度容易受到化學藥品影響，並最後死亡(Antonyaketal.,Augmentationoftissuetransglutaminaseexpressionandactivationbyepidermalgrowthfactorinhibitdoxorubicin-inducedapoptosisinhuman5breastcancercells.JBiolChem.2004Octl;279(40):41461-7.;Dae-SeokKimetal.ReversalofDrugResistanceinBreastCancerCellsbyTransglutaminase2InhibitionandNF-BInactivation.CancerRes.2006.66，10936-10943)。也因為負責活化轉穀氨醯胺酶的病原機制被在分子水平闡述10清楚，所以存在令人信服的抑制轉穀氨醯胺酶活性的原因(KeyChungPark,KyungCheonChung，Yoon-SeongKim,JongminLee,TongH.Joh，andSoo-YoulKim.Transglutaminase2inducesnitricoxidesynthesisinBV-2microglia._Sz'oc/zem.5z'op/zj^.C"owmww.323，1055-1062,2004;JongminLee，Yoon-SeongKim，Dong畫HeeGhoi,MoonS.Bang,TTay15R.Han,TongH.Joh，andSoo-YoulKim.Transglutaminase2inducesNF-kBactivationviaanovelpathwayinBV-2microglia./5/o/.CT^m.279，53725-53735,2004;Dae-SeokKimetal.ReversalofDrugResistanceinBreastCancerCellsbyTransglutaminase2InhibitionandNuclearFactor畫KBInactivation.CancerRes.2006.CancerRes.2006.66,2010936-10943)。發炎很大程度上歸因於NF-kB的活化。己知NF-kB通過信號轉導途徑中的激酶而活化。然而，也發現NF-kB可獨立於激酶而被活化，從而使激酶抑制劑的功能無效(Tergaonkaretal.，I-kappaBkinase-independentI-Bdegradationpathway:functionalNF-kappaB25activityandimplicationsforcancertherapy.MolCellBiol.2003Nov;23(22):8070畫83.)。在本發明人進行的先前的研究中，報導了轉穀氨醯胺酶獨立於激酶(IKK、NAK)的活化，通過誘導I-KB的交聯而活化NF-KB(JongminLee，etal.Transglutaminase2inducesNF-kBactivationviaa30novelpathwayinBV-2microglia.J.Biol.Chem.279,53725-53735,2004)。轉穀氨醯胺酶是鈣依賴性酶，其僅在細胞內鈣水平升高的情況下可以活化NF-kB。—旦發炎，轉錄因子NF-kB的活化不但導致了包括轉穀氨醯胺酶的炎性因子的表達水平升高，而且導致了其抑制劑I-KB的表達水平升高。持續NF-KB活化在正常條件下被I-KB抑制，但是在慢性炎性疾病中NF-kB繼續活化。有趣地，TNF-a或LPS(脂多糖)誘導的NF-kB活化引起了轉穀氨醯胺酶表達。因此，在炎性細胞中異常活化的轉谷5氨醯胺酶預期直接活化NF-KB或進一步保持活化的NF-KB，從而在炎症持續中起重要作用(圖1)。此外，這種惡性循環可以是癌症轉移和化學抗性的主要原因(JongminLee,etal.Transglutaminase2inducesNF-kBactivationviaanovelpathwayinBV-2microglia.J.Biol.Chem.279，53725-53735,2004)。io因此，轉穀氨醯胺酶抑制劑可以在中斷KF-KB持續循環中起關鍵作用，本發明人提出的類固醇取代效應(steroid-substitutingeffect)正是基於此點(Sohn，J"Kim，T,I.,Yoon，Y,H.，andKim,S,Y.:TransglutaminaseInhibitor:ANewAnti-InflammatoryApproachinAllergicConjunctivitis.J.Clin.Invest.Ill,121-8，2003)。15己知胺化合物抑制轉穀氨醯胺酶活性。代表性的TGase抑制劑是胱胺(NatureGenetics18，111-117,1998;NatureMedicine8,143-149,2002)和腐胺。除了胺化合物，其它化學抑制劑，例如單丹醯屍胺(J.Med.Chem.15，674-675，1972)、w-二節基氨基烷基胺(J.Med.Chem,18，278-284，1975)、3-卣素-4，5-二氫異"惡唑(Mol.Pharmacol.35，20701-706，1989)和2-[(2-氧丙基)硫]咪唑鐨鹽衍生物(Blood,75,1455-1459，1990)也被發展，但是報導其有毒性以致於在體內非特異性抑制其它酶。因此，需要安全並且有效的轉穀氨醯胺酶特異性抑制劑。近來，Sohn等己經成功地從重組肽中，得到與用於豚鼠模型中豚草過敏25性結膜炎炎症的類固醇藥物相同的效果(Sohn,J.，Kim,T,I.,Yoon，Y,H.,andKim，S.-Y.:TransglutaminaseInhibitor:ANewAnti-InflammatoryApproachinAllergicConjunctivitis.J.Clin.Invest.Ill,121-8，2003)。考慮到這點，使用抗炎蛋白(PLA2抑制劑)或抑彈性蛋白酶蛋白(非常強的轉穀氨醯胺酶底物，Nara，K.，etal.1994.Elastaseinhibitorelafinisa30newtypeofproteinaseinhibitorwhichhasatransglutaminase-mediatedanchoringsequencetermed"cementoin".JBiochem(Tokyo).6115:441-448)-衍生的合成肽，該合成肽模擬轉穀氨醯胺酶催化位點。基於前述，本發明人進行了精深而完整的研究，導致了本發明，其允許本發明人鑑定涉及轉穀氨醯胺酶誘導的I-KBa聚合的穀氨醯胺和賴氨酸殘基的位置，並且使得本發明人發現，含有這些殘基的5I-KBa-來源的肽或其同系物，抑制轉穀氨醯胺酶誘導的I-KBa的聚合，因此可作為轉穀氨醯胺酶抑制劑。
發明內容io[12]因此，本發明的一個目標是提供抑制轉穀氨醯胺酶的肽，其包括I-KBa源片段或其突變體。本發明的另一個目標是提供抑制轉穀氨醯胺酶的組合物，其包括所述肽作為活性成分。本發明的進一步的目標是提供抑制轉穀氨醯胺酶的方法，其15包括施用所述肽。本發明的更進一步的目標是提供製備所述肽的突變體的方法，所述突變體對轉穀氨醯胺酶介導的I-KBa聚合具有抑制活性，所述方法包括在所述肽胺基酸序列中取代、缺失或插入至少一個胺基酸殘基。20附圖簡述通過下面結合附圖進行的詳細描述，本發明的上面的和其它的目標、特徵和優勢將被更清楚地理解，其中25[17]圖1是如此示意圖，其闡明了在免疫細胞(NTHi,非典型流感嗜血桿菌；TLR，toll樣受體；TNFR,腫瘤壞死因子-a受體；IKK，I-kB激醇；CKII,酪蛋白激酶II;TK，酪氨酸激酶；C0X-2,環加氧酶-2;PLA2,可溶性磷酯酶A2;NO,—氧化氮)的活化過程中的轉穀氨醯胺酉每(transglutaminase)的作用；30[18]圖2是轉穀氨醯胺酶的酶反應的順序，其中底物2提供了賴氨酸殘基(醯基受體、胺供體)，用於和穀氨醯胺殘基異形成異肽共價鍵[N、(Y-穀氨醯基)-L-賴氨酸(GGEL)]，並且GQCWVFA是位於轉穀氨醯胺酶活化位點處的胺基酸序列。硫酯共價酶中間產物在反應中間被看到。基於"桌球"動力學機制的這種酶反應，可以使用胺化合物(胺、二胺、多胺)代替賴氨酸殘基作為醯基受體。5[19]圖3示出了分離的I-KBa通過轉穀氨醯胺酶的聚合，其在4-12%NuPAGE(Invitrogen)上進行鑑定；圖4和圖5示出了在轉穀氨醯胺酶誘導的I-KBa交聯後，水解消化I-KBa釋放出的肽的MS分析，其中使用MALDI-TOF確定肽質io[21]圖6示出了I-KBa的胺基酸序列，其中紅色字符表示轉穀氨醯胺酶的結合位點；圖7和8示出了轉穀氨醯胺酶介導的I-kB(x的聚合，其通過使用合成肽處理而被拯救(rescue);和圖9是代表了I-KBa中的多種功能結構域和胺基酸殘基的示15意圖。在I-KBa的N-末端區域，發現兩個遍在蛋白化位點、兩個絲氨酸磷酸化位點和一個酪氨酸磷酸化位點。C-末端區域包括PEST序列和富含QL(穀氨醯胺和亮氨酸)的區域。五個錨蛋白重複序列用帶陰影的方框所表示，並且交聯位點被用黑體字符在上面的圖中指出。20本發明的最佳實施方式依照一個方面，本發明涉及抑制轉穀氨醯胺酶活性的I-KBa來源的肽。轉穀氨醯胺酶(Transglutaminase(TGase))屬於0&2+-依賴型25酶家族，其催化在肽結合賴氨酸和穀氨醯胺殘基之間形成N、(Y-L-穀氨醯基)-L-賴氨酸異肽鍵(圖2)。已知N、(？L-穀氨醯基)-L-賴氨酸的交聯，穩定了在上皮、凋亡和細胞外基質形成中起屏障功能的細胞內和細胞外蛋白。TGase通常在許多不同的組織中以低水平進行表達，並且TGase不適合在多種病理條件下活化。特別地，炎性疾病和癌症引起30TGase表達的增加。在本發明人先前進行的研究中，已經證明TGase誘導的免疫應答機制是基於轉穀氨醯胺酶誘導I-kB(x聚合併因而活化NF-kB的能力(JongminLee，etal.Transglutaminase2inducesNF-kBactivationviaanovelpathwayinBV-2microglia.CTzem.279，53725-53735,2004)。根據本發明，提供了轉穀氨醯胺酶特異性肽抑制齊U，用來抑制轉穀氨醯胺酶活化機制中的I-KBa的聚合(ParkS.-S.，etal.5Transglutaminase2mediatespolymerformationofI-kappaBalphathroughC-terminalglutaminecluster.JBiolChem.2006Sep20;[Epubaheadofprint].)。如本文使用的，術語"肽"指經醯胺鍵(或肽鍵)連接在一起的胺基酸的聚合物。根據本發明的肽，是抑制轉穀氨醯胺酶誘導的ioI-KBa的聚合的轉穀氨醯胺酶特異性抑制劑。在更多的細節中，作為轉穀氨醯胺酶抑制劑的本發明的肽，源自I-kBoi的SEQIDNO.:l的胺基酸序列，其具體為(i)由胺基酸位置11到30的5個或更多連續胺基酸構成的肽片段，其中包含賴氨酸21和賴氨酸22，(ii)由胺基酸位置81至U100的5個或更多連續氨15基酸構成的肽片段，其中包含賴氨酸87，(iii)由胺基酸位置151到200的5個或更多連續胺基酸構成的肽片段，其中包含賴氨酸177，(iv)由胺基酸位置261到290的5個或更多連續胺基酸構成的肽片段，其中包含穀氨醯胺266到268或穀氨醯胺271,或(v)由胺基酸位置301到317的5個或更多連續胺基酸構成的肽片段，其中包含穀氨醯胺31320(ParkS.-S.，etal.Transglutaminase2mediatespolymerformationofI-BthroughC-terminalglutaminecluster.JBiolChem.2006,281，34965-72)。在本發明的實施方式中，分離的I-KBa在存在轉穀氨醯胺酶的情況下被誘導聚合，以便確定轉穀氨醯胺酶誘導的聚合發生的I-KBa25位點。使用蛋白酶將I-KBa聚合物消化完全，並且使用MALDI-TOF質譜儀(4700ProteomicsAnalyzer,AppliedBiosystems)分析該肽消化物。MALDI-TOF質譜儀上的數據揭示，在位置21、22、87和177的賴氨酸殘基和在位置266-268、271和313的穀氨醯胺殘基，在轉穀氨醯胺酶介導的I-kBcx的交聯被優選使用。30[28]從在轉穀氨醯胺酶介導的I-kBcx聚合中涉及的胺基酸殘基上的信息，本領域技術人員可很容易合成包含聚合誘導殘基的多種肽，以致其表現出對轉穀氨醯胺酶的抑制活性(ParkS.-S.，etal.Transglutaminase2mediatespolymerformationofI-kappaBalphathroughC-terminalglutaminecluster.(JBiolChem.2006，281，34965-72》。在本發明的另一個實施方式中，在賴氨酸和穀氨醯胺殘基基5礎上合成肽，以便具有下列胺基酸序列SEQIDNO.:2的RDGUCKERIX、SEQIDNO.:3的IHEEKALTM、SEQIDNO.:4的HSILKATNY、SEQIDNO.:5的IL^AT、SEQIDNO.:6的GVLTQSCTT、SEQIDNO.:7的ENLQMLP、SEQIDNO.:8的VFGGQRLTL、SEQIDNO.:9的TRIQOOLGOLTL、10的RIQQQLGio和SEQIDNO.:11的LGQLT，並且發現該肽抑制轉穀氨醯胺酶介導的I-kBcx的聚合。進一步，根據本發明的肽的突變體處於本發明的範圍內。如本文使用的術語"突變體"指具有如此胺基酸序列的肽，其通過至少一個胺基酸殘基的缺失、插入或非保守或保守的取代或它們的組合，15使其不同於源自I-KBot胺基酸序列的天然胺基酸序列。在本發明的進一步的實施方式中，具有SEQIDNO.:12的RIQEELG、SEQIDNO.:13的RIEQELG和SEQIDNO.:14的RIEEQLG胺基酸序列的突變體被發現抑制了轉穀氨醯胺酶介導的I-kB(x的聚合(transglutaminase-mediatedI-kBcxpolymerization)。20[32]本發明的肽可以具有L-構型或D-構型，或者可以是它們的消旋體。進一步，本發明的肽可以根據目的進行修飾，例如在特定的原子或原子團上具有羥基和/或甲基取代基的衍生物、用醯胺或酯基取代C-末端羧基的衍生物、或用氫取代N-末端氨基的衍生物。另外，本發明的肽可以包含靶向信號、標誌、標記的殘基或25適於增加其穩定性的附加胺基酸序列。也可以加入促進將肽引入細胞的細胞可滲透肽。本發明的肽也可根據本領域眾所周知的多種技術進行製備，這些技術包括化學合成、無細胞蛋白質合成或基因重組。鹽是本發明的肽的可能形式。本發明的肽可與酸形成鹽，所30述酸例如無機酸(鹽酸、氫溴酸、磷酸、硝酸或硫酸)、有機羧酸(乙酸、滷代乙酸例如三氟乙酸、丙酸、馬來酸、琥珀酸、蘋果酸、檸檬酸、酒石酸或水楊酸)和有機磺酸(甲磺酸或對甲苯磺酸)，其包括糖酸(糖醛酸、半乳糖醛酸、葡糖酸或抗壞血酸)、酸性多糖(透明質酸、硫酸軟骨素或arginicacid)或者磺酸酯(硫酸軟骨素)。依照本發明，轉穀氨醯胺酶肽抑制劑有效地預防和治療由轉s穀氨醯胺酶不恰當活化引起的所有疾病。優選地，本發明的肽可用於預防或治療不恰當的轉穀氨醯胺酶活化引起的炎性疾病或癌症。依照另一個方面，本發明涉及包含至少一種本發明的肽的轉穀氨醯胺酶抑制組合物。術語"炎性疾病(inflammatorydisease)"指通過對抗機體狀io態(物理、化學和生物狀態)的有害影響而產生的機體的防禦應答或炎性應答引起的任何疾病或紊亂，其伴隨著紅斑、水腫、觸痛、發熱和/或機能障礙綜合症。本發明的組合物可用於預防和治療轉穀氨醯胺酶過量表達誘導的所有炎性疾病。轉穀氨醯胺酶活化引起的炎性疾病的實例包括變性關節炎(類風溼性關節炎)、糖尿病、自身免疫性肌炎15(炎性肌炎)、動脈粥樣硬化、中風、肝硬化、乳腺癌、阿爾茨海默氏病、帕金森病、杭廷頓舞蹈病、腦炎和腹部疾病。至於癌症，一旦轉移或開始化學抗性或抗輻射性，可發現轉穀氨醯胺酶的表達水平的明顯增加。因此，抑制轉穀氨醯胺酶成為預防和治療癌症以及炎性疾病的關鍵。可施用本發明的轉穀氨醯胺酶肽20抑制劑進行治療和預防的癌症的具體實例，包括但不限於大腸癌、小腸癌、直腸癌、肛門癌、食道癌、胰腺癌、胃癌、腎癌、子宮癌、乳腺癌、肺癌、淋巴瘤、甲狀腺癌、前列腺癌、白血病、皮膚癌、結腸癌、腦瘤、膀胱癌、卵巢癌、膽囊癌等。如本文使用的術語"預防(prevention)"或"預防(prophylaxis)"25指所有這樣的行為通過施用本發明的組合物抑制或延緩(restrainorretard)轉穀氨醯胺酶活化引起的任何疾病的發生。如本文使用的術語"治療"指所有這樣的行為通過施用本發明的組合物，轉穀氨醯胺酶活化引起的任何疾病己有所好轉或者己有利地減輕。本發明的組合物可被運用到，由於轉穀氨醯胺酶的活化而遭30受炎性疾病或癌症的哺乳動物，這些哺乳動物包括牛、馬、綿羊、豬、山羊、駱駝、羚羊、狗、和貓，以及人。包含至少一種本發明肽的組合物可被單獨使用，或者與其它化合物聯合使用，所述化合物例如糖鏈、脂類、核酸、其它肽或蛋白質。例如，可以與本發明的肽一起使用的脂類的實例如下二棕櫚酸磷脂醯膽鹼(dipalmitoylphosphatidykholine(DPPC))、棕櫚醯油基磷脂5醯甘油酯(palmitoyloleyphosphatidylglycerol(POPG))、磷脂醯甘油酯(phosphatidylglycerol(PG))、C18飽和脂肪酸、C16不飽和脂肪酸和C18不飽和脂肪酸。依照給藥途徑，本發明的組合物可配製成包含藥學上可接受載體的多種劑型。適當的劑型在本領域是眾所周知的，其可以包括幫io助肽滲透入或運動入細胞的典型的添加劑。包含依照本發明作為活性成分的肽的組合物可被用於普通的醫藥製劑中。非口服劑型可以是無菌水溶液、非水溶液、懸浮液、乳劑或凍幹製劑。適合本發明的組合物的口服劑型的實例包括片劑、含片、膠囊、酏劑、懸浮液、糖漿或糯米紙囊劑。注射劑可被製備成例15如單劑針劑型或多劑針劑型。本發明的藥學上的組合物也可包括藥學上可接受的賦型劑。例如適合用於口服給藥的賦形劑，其包括結合劑、潤滑劑、崩解劑、賦形劑、增溶劑、分散劑、穩定劑、懸浮劑、染料和/或香料。注射劑可包含添加劑，例如緩衝劑、防腐劑、疼痛緩解劑、增溶劑、等滲劑20(isotonics)和穩定劑的組合。對於局部給藥，可以使用基質、賦形劑、潤滑劑和防腐劑。任選地，本發明的組合物可包含編碼本發明肽的核酸序列，其可作為模板用來在細胞內表達肽。依照進一步的方面，本發明涉及抑制轉穀氨醯胺酶的方法，25其包括施用一種或多種所述肽或所述組合物。優選地，提供了預防和治療免疫疾病的方法，該方法的特徵是施用本發明的一種或多種肽的組合物，以便抑制轉穀氨醯胺酶介導的I-kBcx的聚合。在本發明的實施方式中，用於抑制轉穀氨醯胺酶的方法通過30將本發明的一種或多種肽或組合物經過適當的途徑投藥給患者而實現。投藥可使用但不限於腹腔內的、靜脈內的、肌肉內的、皮下的、皮內的、口服的、局部的、鼻內的、肺內的或直腸的途徑。對於口服給藥，肽可優選地使用適當的物質進行包衣，或者肽可配製到製劑中，以便不會在胃被消化或溶解。本發明的藥學上的組合物也可藉助於將活性成分輸送進入靶細胞的方法進行投藥。優選地是靜脈內注射、皮5下注射、皮內注射或滴注。注射劑製劑可基於水溶液，例如生理鹽水或格林氏溶液(Ringer'ssolution)，或基於非水溶液，例如植物油、高級脂肪酸酯(例如油酸乙酯等)和醇(例如乙醇、苯甲醇、丙二醇或丙三醇)，並且注射劑製劑可包括藥學上可接受的載體，例如抗菌穩定劑(例如抗壞血酸、亞硫酸氫鈉、焦亞硫酸鈉、BHA、維生素E、EDTAio等)、乳化劑、pH調節緩衝液、和/或抗菌防腐劑(例如硝酸苯汞、乙基汞硫代水楊酸鈉、苯扎氯銨、苯酚、甲酚、苯甲醇等)。在本發明優選的實施方式中，用於抑制轉穀氨醯胺酶的方法通過以治療有效量施用本發明的肽或組合物得以實現。對患者的治療有效量可依照本領域眾所周知的多種因素進行改變，這些因素包括疾15病種類、患者的生理狀況——例如年齡、體重、健康狀態、性別、藥物敏感性等——、給藥途徑、給藥頻率和給藥時間、治療時間周期、劑型、一起使用的其它藥物等。依照更進一步的方面，本發明涉及製備所述肽突變體衍生物的方法，所述突變體衍生物仍抑制轉穀氨醯胺酶介導的I-KB(x聚合，所20述方法包括在所述肽的胺基酸序列中取代、缺失或插入一個或多個胺基酸殘基。在本發明的實施方式中，己經發現I-KBa源的轉穀氨醯胺酶突變體具有對轉穀氨醯胺酶的抑制活性。根據下面的實施例，可以更好的理解本發明，提出這些實施25例是為了進行說明，而不能理解為對本發明的限制。實施例1:轉穀氨醯胺酶作用於I-KB(X的交聯位點通過轉穀氨醯胺酶的I-KBa聚合30[54]人I-KBa在大腸桿菌(￡.co/OBL21(DE3)中大量表達，並且在使用前進行純化。將人I-KBa基因亞克隆到pET-30EK/LIC載體，攜帶該載體的五.co/ZBL21，在37'C下，在存在100ppm卡那黴素的LB培養基中培養。當培養基達到0.2-0.3的OD時，加入IPTG(異丙基-P-D-硫代吡喃半乳糖苷)0.2-1.0mM，然後誘導I-KBa表達3-12小時。在離心後，超聲處理細胞沉澱，由於N-末端的組氨酸標記，使用Ni-NTA5樹脂初步分離出I-KBa。通過使用腸激酶進行消化和通過與Ni-NTA樹脂再次結合，N-末端的組氨酸標記被完全分離，以便提供完整的I-kBou對於在體外聚合，將10微克純化的I-KBa和lmU的轉穀氨醯胺酶(豚鼠肝，Sigma)—起溫育在包含pH7.5的50mMTris-HCl和10mMCaCl2的反應混合物中。使用4-12%的NuPAGE凝膠電泳10(Invirtrogen)分析聚合作用(圖3)。因此，使用離心過濾設備(Centricon,分子量截留值(M.W.cut-off)100kDa,Millipore)分離I-KBa聚合物。如圖3中所見，磷酸化位點都被修飾的完整I-KBa和突變體I-KBa，通過轉穀氨醯胺酶被聚合成高分子量的聚合物。作為鈣-依賴性酶，轉穀氨醯胺酶在存在EDTA的情況下被抑制。15I-KBa聚合體的水解為了變性，純化的I-KBa聚合體(10微克)，在55。C下，溫育在4M含有10mM的二硫酚蘇糖醇的尿素中過夜，使用100mM的NH4HC03將尿素的濃度稀釋到1M。使用胰蛋白酶(Promega)或內切蛋白酶Glu-C(V8，Roche)，在37'C下過夜消化該聚合體。20MALDI-TOFMS分析使用MALDI-TOF質譜儀(4700ProteomicsAnalyzer,AppliedBiosystems)確定消化的肽的質量(圖4和圖5)。使用Zip-TipsC18(Millipore)將樣品脫鹽，在正好位於質量分析靶(massanalysistarget)上的基質溶液(CHCA的1:1v/v0.1%TFA/CAN溶液)中洗脫樣品，25並且乾燥樣品。在陽離子反射模式中施行分析，使用得自4700CalMix(AppliedBiosystems)的標準樣品在50ppm容許下，校準測量的質譜。使用的標準樣品如下脫-精氨酸、緩激肽(Mr卯4.46S1)、血管緊張素1(Mr1296.6853)、穀氨酸L血纖肽B(Mr1570.6774)、ACTH1-17中間葉促皮質樣肽(clip)(Mr2093.0867)、ACTH18-39中間葉促皮質30樣肽(Mr2465.1989)和ACTH7-38中間葉促皮質樣肽(Mr3657.9294)。DataExplorer軟體(AppliedBiosystem)被用於處理數據。在除去了對應於角蛋白和蛋白酶本身的峰之後，測量的峰與理論上可能的肽的峰相符合。對於這點，在100ppm容許，使用Paw程序(GenomicSolutions)。實施例2:使用I-kBoi聚合體的Gki-C消化液進行蛋白分析5競爭測定I-KBa(2微克)與0.5mU的TGase—起溫育在包含pH7.5的50mMTris和10mMCaCl2的反應緩衝液中，並且該緩衝液中含有或不含有表1中的肽(2nmol)，以便觀察到I-KBa交聯。表1中的肽在PeptronInc合成。在37。C下溫育10分鐘後，通過SDS-PAGE分離反應io物，並且通過Coomassie染色使其可視化。使用AdobePhotoshop軟體測量帶的強度(圖7和圖8)。如圖7和圖8所見，特別包含N-末端穀氨醯胺簇(Q255-Q268)、賴氨酸177或穀氨醯胺313的肽是優秀的競爭劑，賴氨酸殘基21和22競爭性抑制酶。表ltableseeoriginaldocumentpage15工業實用性作為迄今描述的轉穀氨醯胺酶抑制劑，根據本發明的肽或包含所述肽之一的藥學組合物，在預防和治療轉穀氨醯胺酶異常活化引起的疾病中是非常有用的，特別在預防和治療炎性疾病和癌症中是非常有用的。本發明已經以說明性的方式進行了描述，應該理解，使用的術語擬為描述的類型，而不是限制的類型。按照上面的教導，本發明的許多修改和變化是可行的。因此，應該理解，除了具體描述的本發明，在所附權利要求範圍內本發明也是可行的。權利要求1.轉穀氨醯胺酶肽抑制劑，其對轉穀氨醯胺酶具有抑制活性，並且其源自I-κBα的SEQIDNO.1的胺基酸序列，其包括(i)由胺基酸位置11到30的5個或更多連續胺基酸構成的肽片段，其中包含賴氨酸21和賴氨酸22；(ii)由胺基酸位置81到100的5個或更多連續胺基酸構成的肽片段，其中包含賴氨酸87；(iii)由胺基酸位置151到200的5個或更多連續胺基酸構成的肽片段，其中包含賴氨酸177；(iv)由胺基酸位置261到290的5個或更多連續胺基酸構成的肽片段，其中包含穀氨醯胺266到268或穀氨醯胺271；或(v)由胺基酸位置301到317的5個或更多連續胺基酸構成的肽片段，其中包含穀氨醯胺313。2.根據權利要求l所述的轉穀氨醯胺酶肽抑制劑，其中所述抑制劑包括至少一種選自SEQIDNO.:2到14的胺基酸序列。3.用於抑制轉穀氨醯胺酶的藥學組合物，其包括權利要求l所述的轉穀氨醯胺酶肽抑制劑作為活性成分。204.根據權利要求3所述的藥學組合物，其中所述藥學組合物對轉穀氨醯胺酶具有抑制活性，並且所述藥學組合物有效地預防和治療炎性疾病或癌症。5.用於抑制轉穀氨醯胺酶的方法，其包括使用至少一種權利要求1所述的轉穀氨醯胺酶肽抑制劑。6.根據權利要求5所述的方法，其中所述方法被用於預防和治療炎性疾病或癌症。7.用於製備對轉穀氨醯胺酶介導的I-KBa的聚合具有抑制活性的突變體肽的方法，其包括在權利要求1所述的轉穀氨醯胺酶肽抑制劑的胺基酸序列中取代、缺失或插入至少一個胺基酸殘基。全文摘要本文公開的是對轉穀氨醯胺酶具有抑制活性的轉穀氨醯胺酶肽抑制劑，和包含一種轉穀氨醯胺酶肽抑制劑作為活性成分的藥學組合物。抑制劑或組合物可用於預防和治療由異常轉穀氨醯胺酶活化所引起的多種疾病，所述疾病包括炎性疾病和癌症。本文也公開了治療各種炎性疾病和癌症的方法，和製備能抑制轉穀氨醯胺酶的突變體肽的方法。文檔編號C07K14/00GK101180311SQ200680011298公開日2008年5月14日申請日期2006年10月11日優先權日2005年12月16日發明者樸成洙,金仁厚,金銖烈申請人:國立癌中心