豬血漿蛋白肽的安全性評價方法
2023-05-15 17:45:26 1
專利名稱：豬血漿蛋白肽的安全性評價方法
技術領域：
本發明屬食品安全領域，是利用食品安全評價技術對豬血漿蛋白肽進行安全性評 價。
背景技術：
活性聚肽不僅具有營養作用和生物活性，而且還具有快速吸收的特點，因此活性 聚肽在食品中的應用前景廣闊。目前，國內對於酶解後的生物活性肽的研究集中在分離、純 化和功能性研究上，未見相關安全性及毒性研究方法的報導。但是，在食品研究與開發中為 確保肽的食用安全，相關安全性及毒理學研究也是必不可少的。為評價其安全性，我們進行 了急性毒性，遺傳毒性實驗及30天餵養實驗研究，為動物血液多肽保健食品的開發和其合 理安全使用提供科學依據。
發明內容
(1)豬血漿蛋白肽的小鼠急性毒性評價方法小鼠隔夜空腹，一次性灌胃0. 5g/mL質量濃度的豬血漿酶解肽，在兩周內記錄小 鼠的死亡情況，計算LD5tl，評價豬血漿蛋白肽的急性毒性。(2)豬血漿蛋白肽的遺傳毒性評價方法豬血漿蛋白肽的骨髓細胞微核試驗7-12周齡的清潔級昆明種(KM)小鼠，設立3個試驗組，2個對照組，各組雌雄各 半。高劑量組、中劑量組、低劑量組，分別灌胃質量濃度0.5，0. 25,0. 125g/mL的豬血漿蛋白 肽，陰性對照組灌等體積的蒸餾水，陽性對照組灌胃蒸餾水後腹腔注射環磷醯胺。兩次灌胃 後處死小鼠，取其胸骨骨髓塗片固定染色後在油鏡下觀察嗜多染紅細胞，計算微核率。小鼠精子畸形試驗成年雄性昆明種(KM)小鼠，設立3個試驗組，2個對照組。高劑量組、中劑量組、低 劑量組，分別灌胃質量濃度0. 5,0. 25,0. 125g/mL的豬血漿蛋白肽，陰性對照組灌等體積的 蒸餾水，陽性對照組腹腔注射環磷醯胺。連續處理5天，每天一次，5周後處死小鼠，取下雙 側附睪，製備精子塗片，染色後在高倍顯微鏡下觀察，計算精子畸形率。(3)豬血漿蛋白肽粉的大鼠亞慢些毒性評價方法SD大鼠，設立3試驗組，1個對照組，各組雌雄各半。高劑量組、中劑量組、低劑量 組，將飼料與豬血漿蛋白肽按比例每天餵養大鼠，3個試驗組大鼠飼料中豬血漿蛋白肽質量 分數分別為100%，50%和25%，對照組採用全價飼料餵養。連續餵養30天，觀察動物一般 表現、行為等特徵，在試驗結束時進行大鼠血常規檢查、白細胞檢查及血液生化指標檢查。
具體實施例方式實施例11材料及分析方法
1.1 樣品試驗樣品為豬血漿蛋白肽粉。1.2供試動物清潔級昆明種小鼠，6-8周齡，體重18 20g。1.3統計學方法計量資料方差分析，計數資料卡方檢驗。2小鼠急性毒性實驗雌雄各10隻，預飼養5d以適應環境。取豬血漿蛋白肽粉，按0. 5g/mL的質量濃度 與水混勻成糊狀。小鼠在給予受試物前小鼠隔夜空腹禁食16h，按0.4mL/20g—次性灌胃。 實驗室環境溫度為20 24°C，溼度為55% 60%。連續觀察2周，記錄小鼠中毒症狀，注意觀察記錄發生各種症狀的時間、症狀表觀 程度、發展的過程和死亡的數目、死亡前特徵及死亡時間，計算豬血漿蛋白肽的LD5tl，進行急 性毒性分級。實施例21.材料及分析方法1. 1 樣品試驗樣品為豬血漿蛋白肽粉；陽性對照物為環磷醯胺(現配現用)；陰性對照物為蒸餾水。1. 2試驗動物昆明種(KM)小鼠。1.3統計學方法計量資料方差分析；計數資料卡方檢驗。以P <0.05為有統計學顯著差異。2.遺傳毒性實驗2. 1骨髓細胞微核試驗7-12周齡昆明種(KM)小鼠50隻，隨機分為5組，每組10隻，雌雄各半。編為A， B, C，D，E組，其中A組為陰性對照組，B組為高劑量組，C組為中劑量組，D組為低劑量組，E 組為環磷醯胺陽性對照組。各組的處理方法各組分別按最大灌胃容量0. 4mL/20g灌胃，其 中A和E組灌胃物為蒸餾水，B，C，D組灌胃物分別為質量濃度0. 5,0. 25,0. 125g/mL的蛋白 肽溶液，E組腹腔注射環磷醯胺(40mg/kg)。各組均採用全價飼料飼養，自由飲水。實驗室 環境溫度為20 24°C，溼度為55% 60%。二次間隔24h灌胃，第二次灌胃後6h，頸椎脫臼處死小鼠。剖開胸腹部，小心的取 下胸骨剔去肌肉，用止血鉗擠出骨髓於有一滴小牛血清的載玻片上，均勻混合。塗片自然幹 燥後放入甲醇中固定15min，將固定好的塗片放入Giemsa應用液中，染色10-20min，用蒸餾 水洗淨浮色、晾乾。每隻動物塗片在油鏡下計數1000個嗜多染紅細胞，觀察含有微核的嗜 多染紅細胞數，計算微核率。2. 2小鼠精子畸形分析成年雄性昆明種(KM)小鼠25隻，分為5組，編號為A，B, C，D，E組，每組5隻。其 中A組為陰性對照組，B組為高劑量組，C組為中劑量組，D組為低劑量組，E組為環磷醯胺陽性對照組。各組的處理方法分別按最大灌胃容量0. 4mL/20g灌胃，其中A和E組灌胃物 為蒸餾水，B, C，D組灌胃物分別為質量濃度0. 5,0. 25,0. 125g/mL的蛋白肽溶液，E組再按 40mg/kg腹腔注射環磷醯胺，各組均以全價飼料飼養，自由飲水。連續處理5d，每天一次。在首次給藥5周後，以頸椎脫臼法處死小鼠，摘取雙側附睪置於約2ml磷酸鹽緩衝 生理鹽水中。用眼科剪將副睪縱向剪1-2刀，靜置3-4min後輕輕搖動。用四層擦鏡紙過濾， 吸取精子懸液塗片。空氣乾燥後，用甲醇固定5min以上，乾燥，用2%伊紅水溶液染色lh， 用蒸餾水洗去浮色，烘乾。每隻動物塗片在高倍鏡下觀察1000個精子，記錄精子畸形數。實施例31材料及分析方法1. 1 樣品豬血漿蛋白肽粉。1. 2試驗動物離乳SD大鼠，體重77 95g。1. 3統計學方法計量資料方差分析；計數資料卡方檢驗。以P <0.05為有統計學顯著差異。2 30天餵養試驗取80隻大鼠，雌雄各40隻，隨機分成4組，3個試驗組和一個對照組，每組雌雄各 10隻，試驗前稱重，動物體重的差異不超過平均體重的120%。中劑量組、低劑量組受試物 的配製方法為取血漿蛋白肽粉和全價飼料豬，分別按1 1和1 4的比例混合均勻，再 用制粒機壓製成含蛋白肽粉質量分數分別為50%和25%的顆粒料；高劑量組採用100%豬 血漿蛋白肽粉飼喂，對照組採用全價飼料飼喂。飼養30天。2. 1 一般情況觀察每天觀察並記錄動物的一般表現、行為、體重、中毒表現和死亡情況。2. 2血液學指標餵養試驗結束時從大鼠眼窩靜脈叢處採血，EDTA鈉鹽抗凝，測定血液學常規指 標。包括紅細胞(RBC)計數，白細胞(WBC)計數、血紅蛋白(Hb)、中性粒細胞(GR)和血小板 (PLT)計數等。2. 3血液生化學指標餵養試驗結束時從大鼠眼窩靜脈叢處採血，恆溫箱中凝固2h，離心分離血清，檢測 谷丙轉氨酶(ALT)、穀草轉氨酶(AST)、尿素氮(BUN)、肌酐(CRE)、血糖(Glu)、血清白蛋白 (Alb)、總蛋白(TP)、總膽固醇(TCH)和甘油三醋(TG)。
權利要求
本發明涉及到一種酶法製取血漿蛋白肽的安全性評價方法，其特徵在於所述方法包括下述步驟a)豬血漿蛋白肽對小鼠的急性毒性研究，灌胃0.2～0.8g/mL質量濃度的豬血漿蛋白肽；b)豬血漿蛋白肽對小鼠的遺傳毒性研究，試驗組分別灌胃0.2～0.8g/mL質量濃度的豬血漿蛋白肽溶液，從高到底依次遞減；c)豬血漿蛋白肽對大鼠亞慢性毒性研究，試驗組大鼠飼料為全價飼料與豬血漿蛋白肽按一定比例混合，從高到底豬血漿蛋白肽含量依次遞減；d)根據以上試驗綜合評價豬血漿蛋白肽的安全性。
2.根據權利要求1所述的豬血漿蛋白肽對小鼠的急性毒性研究，其特徵在於對小鼠灌 胃0. 5g/mL質量濃度的豬血漿蛋白肽，觀察小鼠中毒死亡的數量，計算LD50，評價豬血漿蛋 白肽的急性毒性。
3.根據權利要求1所述的豬血漿蛋白肽對小鼠遺傳毒性研究，其特徵在於3個試驗組 分別灌胃質量濃度0. 5,0. 25，0. 125g/mL的豬血漿蛋白肽溶液。
4.根據權利要求1所述的豬血漿蛋白肽對小鼠亞慢性毒性研究，其特徵在於3個試驗 組大鼠飼料中豬血漿蛋白肽質量分數分別為100%，50%和25%。
5.根據權利要求2所述豬血漿蛋白肽對鼠的急性毒性研究，其特徵在於試驗採用的是 6-8周齡昆明小鼠。
6.根據權利要求3所述豬血漿蛋白肽對小鼠遺傳毒性研究，其特徵在於在骨髓細胞微 核試驗中採用的小鼠為7-12周齡清潔級昆明小鼠，在精子畸形試驗中採用的是成年雄性 昆明小鼠。
7.根據權利4所述豬血漿蛋白肽對小鼠亞慢性毒性研究，其特徵在於採用的試驗動物 是離乳SD大鼠，體重77 95g。
全文摘要
本發明提供了一種血漿蛋白肽安全性評價的方法。本方法首先選用國內資源浪費嚴重的豬血液作為原料提取血漿蛋白，通過酶解製備豬血漿生物活性肽。為評價其安全性，進行了小鼠急性毒性及遺傳毒性實驗研究，為動物血液多肽保健食品的開發和其合理安全使用提供科學依據。
文檔編號G01N33/02GK101915822SQ20101022212
公開日2010年12月15日 申請日期2010年7月9日 優先權日2010年7月9日
發明者吳涵, 宮新統, 李洪山, 潘風光, 趙婭婭 申請人:吉林大學