粉防己鹼在製備抑制肝星狀細胞遷移的藥物中的應用的製作方法

2023-05-15 22:51:36

專利名稱：粉防己鹼在製備抑制肝星狀細胞遷移的藥物中的應用的製作方法
技術領域：
本發明屬中藥領域，具體涉及粉防己鹼在製備抑制肝星狀細胞遷移的藥物中的應用。
背景技術：
粉防己鹼又名漢防己甲素，是防己科植物粉防己的主要生物活性成分，屬雙苄基異喹啉類化合物，是Ca2+拮抗劑，既可阻滯細胞膜電壓門控通道介導的Ca2+內流，還可以阻滯受體門控通道幹預細胞內Ca2+分布，從而阻斷有關病理過程；如抑制纖維形成細胞的增殖，ECM(extracellular matrix,細胞外基質)的合成、排泌,生長因子的促纖維化作用等。 研究發現其有對心血管系統，肝、肺纖維化、炎症反應等有較好的治療作用。粉防己鹼能夠顯著減輕CCl4誘導大鼠實驗性肝纖維化程度，降低纖維化大鼠血清ALT、HA、PIIIP含量，改善肝功能，抑制ECM形成。臨床研究顯示肝硬化患者口服粉防己鹼6-18個月後，血清PIIIP、HA含量顯著下降，肝、腎功能不同程度得以改善，活檢發現治療後患者肝組織炎性細胞浸潤明顯減輕或消失，膠原纖維沉積減少，I型及III型膠原含量顯著下降。各種肝臟疾病，如慢性B型肝炎、慢性C型肝炎，酒精性或非酒精性脂肪性肝病，自身免疫性肝病，藥物性肝病，慢性血吸蟲病以及一些代謝性或先天性慢性肝病都可通過肝纖維化發展成肝硬化。肝星狀細胞Ofepatic Stellate Cell，HSC)在肝纖維化的發生發展中起著關鍵作用。在肝臟炎症狀態下，HSC經多種細胞因子如血小板衍生生長因子(TOGF)和轉化生長因子β UTGF-β I)的激活，活化為肌成纖維細胞並大量增殖，表達α-平滑肌肌動蛋白、合成分泌大量細胞外基質，細胞可以收縮，亦可從Disse腔內向肝細胞壞死區域遷移聚集。肝纖維化進程中，HSC所表現出的遷移特性，可導致炎症區域活化的HSC數目增多，而加重病灶局部的纖維化程度，促使疾病進展。所以，如能抑制HSC在肝損傷時向炎症區域遷移，就可能干擾或減輕肝纖維化的進程，達到抗肝纖維化的目的。而HSC的遷移受到多種細胞因子和細胞外基質成分的調控，如，H)GF、TGF-13 I等；其中TOGF是最強的促進HSC增殖遷移的刺激因子。為此，本發明設計了以TOGF誘導的人肝星狀細胞株(LX-2)遷移的篩選平臺，篩選出粉防己鹼抑制HSC遷移的適宜濃度及其最佳的工作濃度。目前，對粉防己鹼在抑制肝星狀細胞遷移中的作用尚未見相關報導。

發明內容
本發明要解決的技術問題在於提供粉防己鹼的新用途。為解決上述技術問題，本發明提供粉防己鹼在製備抑制肝星狀細胞遷移的藥物中的應用。所述粉防己鹼抑制肝星狀細胞遷移的有效濃度為10_4mol/L 10_7mol/L，優選為106mol/L。本發明設計了以TOGF誘導的人肝星狀細胞株(LX-2)遷移的篩選平臺，篩選出粉防己鹼抑制HSC遷移的適宜濃度及其最佳的工作濃度。實驗證明10_4mol/L、10_5mol/L、10_6mol/L和10_7mol/L 4個濃度梯度的粉防己鹼均可抑制I3DGF誘導的LX-2遷移。抑制遷移作用最強的10_4mol/L組與其他3組之間有統計學差異，但10_5mol/L組和10_6mol/L組之間無統計學差異，抑制遷移作用最弱的10_7mol/L組與其它3組比較均有統計學差異。在與遷移同等條件下培養細胞時發現，10_4mol/L組較正常培養的細胞包體回縮為小圓形且明顯變小，胞漿內可見黑色顆粒狀物質；10_5mol/L組的部分細胞胞體亦明顯回縮。遵從藥物篩選原則，捨棄10_4mOl/L、10_5mOl/L粉防己鹼，選擇與10_7mol/L組有統計學差異者即10_6mol/L粉防己鹼。從而本發明驗證了 10_4mol/L 10_7mol/L的粉防己鹼均可抑制TOGF誘導的HSC的遷移，從而可幹擾或減輕肝纖維化的進程，達到抗肝纖維化的效果，即本發明驗證了粉防己鹼可用於製備抑制肝星狀細胞遷移的藥物。


圖1是本發明試驗例中細胞遷移杯(Transwell)的示意圖；細胞遷移杯為一個可放置在孔板裡的小杯子，其關鍵部分就是杯底層一張半透膜(一般是聚碳酸酯膜)此膜有 密度均一的許多微孔，孔徑為8. O μ m。將Transwell放入24孔培養板中形成Transwell與培養板的雙腔系統，Transwell內稱上室,培養板內稱下室,上下層培養液以半透膜相隔。將細胞種在上室內，由於聚碳酸酯膜有通透性，下層培養液中的成分可以影響到上室內的細胞，上層中的細胞亦可遷移至下層，從而可以研究下層培養液中的成分對細胞生長、運動等的影響。圖2是本發明試驗例中不同濃度粉防己鹼對LX-2遷移和形態學的影響示意圖；圖2A表示對TOGF誘導的人LX-2遷移的抑制(蘇木素染色，X 200)；圖2B表示對LX-2形態的影響，X 200。
具體實施例方式以下通過試驗例對本發明粉防己鹼的藥理活性試驗及結果作進一步的闡述試驗例一、材料與方法(一)材料粉防己鹼Tetrandrine,分子式(C38H42N2O6),分子量623,純度彡 ％ % (byHPLC),購自於南京澤朗醫藥科技有限公司。人肝星狀細胞株LX-2，其製備方法為約15g重正常人肝臟組織先後經鏈酶蛋白酶和膠原酶消化後，由8. 2% Nycodenz離心分離得肝星狀細胞(HSC)。細胞用含10%胎牛血清的M199培養液培養。當細胞長滿培養皿後，用胰蛋白酶和EDTA消化傳代，每7_10傳代一次。當HSC培養傳到4代，將SV40T-抗原DNA轉染入HSC，獲得細胞株LX-1。該細胞用含10%胎牛血清的DMEM培養液培養7代後，與原代細胞相比形態發生明顯變化，增殖加快。LX-2是以含1%胎牛血清的DMEM培養液培養半年後篩選得到的耐低血清(2%胎牛血清)培養的細胞株(具體參見L Xu, A Y Hui,E Albanis,M J Arthur, S M 0』Byrne,WS Blaner,PMukherjee,S L FriedmaniF J Eng. Human hepatic stellate cell lines,LX-1and LX-2 new tools for analysis of hepatic fibrosis Gut 2005 ;54 :142-151.)。
O. 1% I 型膠原溶液(Col I，lot 107K2331)(美國 sigma 公司)。PDGF (血小板衍生生長因子)，分子量12. 4kDa, Cat. No. 220BB，純度> 97% (SDSPAGE)購於 R&D Systems, Inc。( 二 )方法1.粉防己鹼濃度配製粉防己鹼取20mg。粉防己鹼溶於3. 2ml DMSO (二甲基亞碸)中，成l(T2mol/L儲存液。將上述粉防己鹼儲存液均分別經O. 45 μ m濾膜過濾除菌，以含3 % FBS的DMEM培養基依次稀釋為 l(T4mol/L，l(T5mol/L，l(T6mol/L，l(T7mol/L 共 4 個濃度梯度。 2.細胞遷移篩選實驗(採用如圖1所示的細胞遷移杯)(I)細胞培養與藥物孵育將LX-2用含10% FBS DMEM在Φ IOOmm的培養皿中培養至細胞密度達到80%左右。於遷移實驗開始前24h，將細胞按表I或表2分組，每組I皿並將培養液更換為3%FBSDMEM。於遷移實驗開始12h前，按照分組情況加入培養液或相應藥物的濃度進行孵育，藥物孵育時間為12h。表1.粉防己鹼篩選實驗細胞分組和孵育用藥
分空白對PDGF 組PDGFPDGFPDGFPDGF組昭相 /、、、-H1.+10'4 mol/L 組+ΙΟ·5 mol/L組+ΙΟ·6 mol/L組+ΙΟ·7 mol/L組用3%FBS3%FBSIO'4 mol/LIO'5 mol/L粉IO'6 mol/L粉IO'7 mol/L粉藥粉防己鹼防己鹼防己鹼防己鹼 表2.粉防己鹼的最佳濃度統一篩選實驗細胞分組和孵育用藥
分組空白對照組 PDGF組 PDGF +
粉防已鹼組
用藥^3%FBS3%FBS 粉防已鹼(2)以I型膠原包被細胞遷移杯半透膜將I型膠原用DMEM以1: 100稀釋至10 μ g/ml (Col I溶液)。取24孔板，加入Col I溶液600 μ I/孔；用無菌鑷子取細胞遷移杯放入加有Col I溶液的培養孔內，在每個細胞遷移杯內加入Col I溶液400μ1。放入恆溫箱，37°C，45min。(3)接種細胞從恆溫箱中取出孵育培養24h的LX-2，用胰蛋白酶傳代細胞後，用含3% FBS的DMEM重懸細胞並調整細胞數為2 4X IO5個/ml。取出已包被Col I溶液的細胞遷移杯，吸棄細胞遷移杯內液體並用DMEM清洗2次，移入另一 24孔板(每孔預加O. 5ml含3% FBS的DMEM)。每個細胞遷移杯內加入300 μ I細胞懸液，放入CO2培養箱，37°C，lh。
(4)藥物配製與添加①TOGF的添加將接種有LX-2的細胞遷移杯取出，吸棄上層培養液後移入另一24孔板，並依照表I或表2加藥(每組3孔)；含TOGF各組中加入TOGF並使其終濃度為10ng/mlο②粉防己鹼篩選將粉防己鹼依照表3加藥(每組3孔)。本實驗重複3次。表3粉防己鹼篩選實驗藥物添加表
空白對~PDGF 組 PDGFPDGFPDGFPDGF
昭鉬+IO'4 mol/L +IO-5 mol/L組 +IO-6 mol/L組 +IO-7 mol/L組/、、、>-~π.
組
TE^3%FBS^3%FBS^IO'4 mol/L10_5 mol/L粉^10_6 mol/L粉^10_7 mol/L粉
層粉防己鹼防己鹼防己鹼防己鹼
下 3%FBS PDGF PDGF +IO4PDGF+IO'5 PDGF+106 PDGF+107
層mol/L粉防mol/L粉防己 mol/L粉防己 mol/L粉防己
己喊喊喊喊③粉防己鹼的最佳濃度統一篩選以含3% FBS的DMEM配製；篩選出的粉防己鹼的最佳濃度，依照表4加藥(每組3孔)。本實驗重複3次。表4粉防己鹼的最佳濃度統一篩選實驗藥物添加表
空白對照組PDGF組PDGF +
粉防已鹼組^±1 一3%FBS3%FBS 粉防已鹼
下層 3%FBSPDGF PDGF +
粉防已鹼(5)細胞培養將加入各相應藥物的培養裝置放入CO2培養箱，370C，6h。(6)細胞固定與染色取出細胞遷移杯，PBS清洗2次；醫用消毒棉籤輕輕擦去細胞遷移杯底部半透膜內側面未遷移的細胞，PBS清洗2次；將其放入盛有4%多聚甲醛的24孔板內固定IOmin，PBS清洗I次；放入盛有蘇木素的24孔板染色10min，PBS清洗2次；放入盛有100%酒精24孔板中固定Imin ;室溫自然晾乾。用手術刀片小心將半透膜自細胞遷移杯底部取下，置於載玻片上，中性樹膠封片。(7)細胞計數200倍顯微鏡下觀察細胞，由上至下取5個視野計數。(8)統計學方法
將每樣本5個視野細胞數相加，求得均數。用SPSS13. O統計軟體進行數據分析處理，結果以i±S表示，採用單因素方差分析，Q檢驗。
(9)藥物篩選原則①選擇對細胞生長和形態無影響的粉防己鹼濃度。②在滿足上條規定的前提下，選擇同一粉防己鹼同批遷移試驗中遷移細胞數量少而有統計學差異的濃度低者，即抑制遷移效率最佳者。如各濃度間遷移細胞數量無統計學差異，則選擇抑制遷移效果最佳者，即遷移細胞數量絕對值最小者。③在篩選出的粉防己鹼最佳濃度的同批遷移實驗結果中，選擇有統計學差異抑制
率最聞者。3.細胞生長和形態觀察實驗在24孔板中培養LX-2，培養條件、時間和藥物添加均同上述各細胞遷移篩選實驗。各實驗均重複3次。二、結果粉防己鹼抑制TOGF致細胞遷移的濃度篩選實驗結果如圖2所示，與空白組相比，PDGF組可有效誘導LX-2遷移，其差異有統計學意義(P < O. 05)。l(T4mol/L、l(T5mol/L、10-6mol/I^Pl(Tmol/L 4個濃度的粉防己鹼均可抑制TOGF誘導的LX-2遷移(P均<0.05)；抑制遷移作用最強的10_4mol/L組與其他3組之間有統計學差異，但10_5mol/L組和10_6mol/L組之間無統計學差異，抑制遷移作用最弱的10_7mol/L組與其它3組比較均有統計學差異(見表5，圖2A)。在與遷移同等條件下培養細胞時發現，10_4mol/L組較正常培養的細胞包體回縮為小圓形且明顯變小，胞漿內可見黑色顆粒狀物質；l(T5mol/L組的部分細胞胞體亦明顯回縮(見圖2B)。遵從藥物篩選原則，捨棄10_4mol/L、10_5 mol/L粉防己鹼，選擇與10^7mol/L組有統計學差異者即10_6mol/L粉防己鹼。表5粉防己鹼抑制細胞遷移的數量比較(X 土SD)
權利要求
1.粉防己鹼在製備抑制肝星狀細胞遷移的藥物中的應用。
2.如權利要求1所述的應用，其特徵在於，所述粉防己鹼抑制肝星狀細胞遷移的有效濃度為 10 4mol/L 10 7mol/L0
3.如權利要求2所述的應用，其特徵在於，所述粉防己鹼抑制肝星狀細胞迀移的有效濃度為 10—6mol/L。
全文摘要
本發明公開了粉防己鹼在製備抑制肝星狀細胞遷移的藥物中的應用。本發明設計了以PDGF誘導的人肝星狀細胞株(LX-2)遷移的篩選平臺，發現10-4mol/L～10-7mol/L的粉防己鹼均可抑制PDGF誘導的肝星狀細胞(HSC)的遷移。
文檔編號A61P1/16GK102988367SQ20111027464
公開日2013年3月27日 申請日期2011年9月16日 優先權日2011年9月16日
發明者徐列明, 張展 申請人:上海中醫藥大學附屬曙光醫院