一種與胃癌輔助診斷相關的低頻高外顯性遺傳標誌物及其應用的製作方法
2023-05-16 00:55:16
一種與胃癌輔助診斷相關的低頻高外顯性遺傳標誌物及其應用的製作方法
【專利摘要】本發明屬於基因工程及腫瘤醫學領域，公開了一種與胃癌輔助診斷相關的低頻高外顯性遺傳標誌物及其應用。該標誌物為rs3827760，rs11570112，rs201130283，rs201477597，rs1264429，rs143989805，rs147592698，rs41269281，rs17217280，rs191127702，rs2793086，rs6446315，rs111909699，rs142508708，rs3733782，rs138921247，rs45611935，rs35683659等52個低頻SNV的組合。該標誌物可用於製備胃癌輔助診斷試劑盒。
【專利說明】一種與胃癌輔助診斷相關的低頻高外顯性遺傳標誌物及其 應用 發明領域
[0001] 本發明屬於基因工程及腫瘤醫學領域，涉及一種與胃癌輔助診斷相關的低頻高外 顯性遺傳標誌物及其應用。
【背景技術】
[0002] 惡性腫瘤是危害人類健康重大疾病之一。據世界衛生組織國際癌症研究署（IARC) 最新估計，每年全球新發癌症病例達1200餘萬，約700萬人死於惡性腫瘤。胃癌是全球最 常見的惡性腫瘤之一。據世界衛生組織（WHO)估計，2012年全球範圍內大約63萬胃癌新 發病例，佔全部腫瘤發病的8. 5%，僅次於肺癌、前列腺癌和結直腸癌。在我國，惡性腫瘤是 僅次於心血管疾病的第二大死因，其中胃癌死亡率僅次於肺癌居我國惡性腫瘤第二位，每 年46. 4萬人死於胃癌，約佔全球胃癌死亡人數的47%。在我國，胃癌年齡標化發病率為 22. 7/10萬，僅次於肺癌。儘管在全球範圍內胃癌的發病率及死亡率均處於下降趨勢，而我 國仍處於較高發病的及死亡水平。隨著人口基數的不斷增大和胃癌期望壽命的延長，胃癌 患病和死亡人數，將在未來相當長一段時期內給我國帶來嚴重的負擔，依舊是腫瘤預防及 控制的重點。
[0003] 惡性腫瘤是一種慢性複雜性疾病，是環境和遺傳因素長期共同作用的結果。雙生 子研究表明，遺傳因素在胃癌等惡性腫瘤的發生中扮演極其重要角色。胃癌的形成是一個 多因素、多階段、複雜的過程，從慢性萎縮性胃炎、腸化生、不典型增生等癌前病變最終進展 為胃癌。不過目前其確切發病機制還不是很清楚。在環境暴露誘導下，遺傳因素將在一 定程度上決定個體對腫瘤的易感程度。幽門螺桿菌（Helicobacter Pylori)感染已經在 1994年被世界衛生組織（WHO)確認為一級致癌物，是胃癌明確的危險因素之一。然而，相 同的環境危險因素暴露下僅有少數個體最終發展為胃癌，這說明不同個體對環境暴露的反 應存在不同的易感性，這種易感性目前認為是由個體的遺傳因素所決定。例如，全球人群的 Helicobacter Pylori 感染率大約在 40%-80%，但其中只有 1 %的 Helicobacter Pylori 感染患者進而發展為胃癌，這說明遺傳因素在胃癌的發生發展中起了重要作用。低頻高外 顯性遺傳標誌物是指較小等位基因頻率（MF)小於0.05的遺傳變異。遺傳變異的存在被 認為賦予了個體不同的表型性狀，以及對環境暴露、藥物治療等因素的不同反應，因此可能 是導致個體對常見疾病發病和預後易感性差異的重要遺傳基礎。
[0004] 目前，胃癌初步診斷的方法主要包括病史詢問、體格檢查、實驗室檢查、胃腸 X線 檢查、纖維內窺鏡檢查、脫落細胞學檢查、B超以及CT檢查、腫瘤標記物檢測等。鑑別診斷 主要依靠 X線鋇餐造影、胃鏡和活組織病理檢查。但是現在臨床常用的X線鋇餐造影和纖 維內窺鏡檢查存在一些弊端。X線鋇餐造影難以發現，或難以肯定局部黏膜上較小的腫瘤； 檢查存在一定的盲區，可能會漏掉一些小的病變；不能確定病變的性質，可能存在假陽性或 假陰性。纖維內窺鏡檢查對胃壁整體蠕動情況及胃的形態觀察欠完整；對腫瘤的浸潤深度、 有無轉移了解不清；對外壓性腫物還是胃壁內腫物難以區別。目前臨床所用胃癌標誌物的 特異性不強，血清癌胚抗原（CEA)對診斷意義不大，雖半數患者的胃液中CEA有明顯升高， 超過l〇〇ng/ml，但也與慢性萎縮性胃炎的胃液中含量有重疊。病理活組織檢查作為胃癌診 斷的金標準，在臨床胃癌確診中居於重要地位，但由於需要做胃鏡取尾部組織，不適宜作為 臨床健康篩查的手段。
[0005] 通過疾病易感的遺傳標誌物來診斷疾病的發生，靈敏、準確和快速，具有廣闊的應 用前景。近年來，疾病遺傳標誌物已經成為臨床和科研工作者的研究熱點，在腫瘤和心腦血 管疾病等常見重大疾病的應用價值已初見端倪。
[0006] 然而，目前還沒有將低頻高外顯性遺傳標誌物應用於胃癌診斷的報導，若能篩選 出胃癌易感的低頻高外顯性遺傳變異作為生物標誌物，並研製相應的診斷試劑盒，對我國 胃癌診斷現狀將會是個有力的推動，也為其藥物篩選、藥效評價及靶向治療開闢了新的途 徑。
【發明內容】
[0007] 本發明的目的是針對上述技術問題，提出一種與胃癌輔助診斷相關的低頻高外顯 性遺傳標誌物及其應用。
[0008] 本發明的第二個目的是提供上述遺傳標誌物的特異性引物。
[0009] 本發明的第三個目的是提供上述遺傳標誌物及其特異性引物在製備胃癌輔助診 斷試劑盒中的應用。
[0010] 本發明第四個目的是提供胃癌輔助診斷試劑盒。
[0011] 發明人通過分離和研究胃癌患者及與其年齡匹配的健康對照外周血DNA中的單 核苷酸多態性，尋找一組與胃癌高度相關的高特異性和敏感性的低頻高外顯性遺傳標誌 物，並研製出可便於臨床應用的胃癌輔助診斷試劑盒，為胃癌的篩查和診斷提供數據支持， 為發現具有潛在治療價值的新型小分子藥物提供數據支持。
[0012] 本發明的目的是通過下列技術方案實現的：
[0013] 一種與胃癌輔助診斷相關的低頻高外顯性遺傳標誌物，該標誌物為rs3827760， rsll570112, rs201130283, rs201477597, rsl264429, rsl43989805, rsl47592698, rs41269281, rsl7217280, rsl91127702, rs2793086, rs6446315, rslll909699, rsl42508708, rs3733782, rsl38921247, rs45611935, rs35683659, rsl47031025, rs200847762, rs78373056, rs3739757, rs679882, rsl41615048, rsl46021011, rs7769051, rs201854588, rs41302077, rsll571707, rs78738447, rs79153019, rs35511555, rsl90646764,rs76685516,rs61752940,rsl90958876,rs9475487,rs80358282,rs2305985, rs201287330, rsl88551104, rs202172344, rsll564258, rs2242527, rsl052690, rsll7207261, rsl40636259, rs2305710, rs61978639, rs3130257, rs34908836,和 rs56229136 的組合。
[0014] 所述的遺傳標誌物的特異性擴增引物，該引物為：
[0015] rs3827760 的引物序列為 SEQ ID No:l 和 SEQ ID No:2 ;
[0016] rsll570112 的引物序列為 SEQ ID No:4 和 SEQ ID No:5 ;
[0017] rs201130283 的引物序列為 SEQ ID No:7 和 SEQ ID No:8 ;
[0018] rs201477597 的引物序列為 SEQ ID No: 10 和 SEQ ID No: 11 ;
[0019] rsl264429 的引物序列為 SEQ ID No:13 和 SEQ ID No:14 ;
[0020] rsl43989805 的引物序列為 SEQ ID No: 16 和 SEQ ID No: 17 ;
[0021] rs 147592698 的引物序列為 SEQ ID No :19 和 SEQ ID No :20 ;
[0022] rs41269281 的引物序列為 SEQ ID No:22 和 SEQ ID No:23 ;
[0023] rsl7217280 的引物序列為 SEQ ID No:25 和 SEQ ID No:26 ;
[0024] rsl91127702 的引物序列為 SEQ ID No:28 和 SEQ ID No:29 ;
[0025] rs2793086 的引物序列為 SEQ ID No:31 和 SEQ ID No:32 ;
[0026] rs6446315 的引物序列為 SEQ ID No:34 和 SEQ ID No:35 ;
[0027] rs 111909699 的引物序列為 SEQ ID No :37 和 SEQ ID No :38 ;
[0028] rsl42508708 的引物序列為 SEQ ID No:40 和 SEQ ID No:41 ;
[0029] rs3733782 的引物序列為 SEQ ID No:43 和 SEQ ID No:44 ;
[0030] rsl38921247 的引物序列為 SEQ ID No:46 和 SEQ ID No:47 ;
[0031] rs45611935 的引物序列為 SEQ ID No :49 和 SEQ ID No :50 ;
[0032] rs35683659 的引物序列為 SEQ ID No:52 和 SEQ ID No:53 ;
[0033] rs 147031025 的引物序列為 SEQ ID No :55 和 SEQ ID No :56 ;
[0034] rs200847762 的引物序列為 SEQ ID No:58 和 SEQ ID No:59 ;
[0035] rs78373056 的引物序列為 SEQ ID No:61 和 SEQ ID No:62 ;
[0036] rs3739757 的引物序列為 SEQ ID No:64 和 SEQ ID No:65 ;
[0037] rs679882 的引物序列為 SEQ ID No :67 和 SEQ ID No :68 ;
[0038] rsl41615048 的引物序列為 SEQ ID No:70 和 SEQ ID No:71 ;
[0039] rsl46021011 的引物序列為 SEQ ID No:73 和 SEQ ID No:74 ;
[0040] rs7769051 的引物序列為 SEQ ID No:76 和 SEQ ID No:77 ;
[0041] rs201854588 的引物序列為 SEQ ID No :79 和 SEQ ID No :80 ;
[0042] rs41302077 的引物序列為 SEQ ID No:82 和 SEQ ID No:83 ;
[0043] rsll571707 的引物序列為 SEQ ID No:85 和 SEQ ID No:86 ;
[0044] rs78738447 的引物序列為 SEQ ID No:88 和 SEQ ID No:89 ;
[0045] rs79153019 的引物序列為 SEQ ID No:91 和 SEQ ID No:92 ;
[0046] rs35511555 的引物序列為 SEQ ID No:94 和 SEQ ID No:95 ;
[0047] rs 190646764 的引物序列為 SEQ ID No :97 和 SEQ ID No :98 ;
[0048] rs76685516 的引物序列為 SEQ ID No: 100 和 SEQ ID No: 101 ;
[0049] rs61752940 的引物序列為 SEQ ID No: 103 和 SEQ ID No: 104 ;
[0050] rs 190958876 的引物序列為 SEQ ID No: 106 和 SEQ ID No: 107 ;
[0051] rs9475487 的引物序列為 SEQ ID No:109 和 SEQ ID No:110 ;
[0052] rs80358282 的引物序列為 SEQ ID No:112 和 SEQ ID No:113 ;
[0053] rs2305985 的引物序列為 SEQ ID No:115 和 SEQ ID No:116 ;
[0054] rs201287330 的引物序列為 SEQ ID No:118 和 SEQ ID No:119 ;
[0055] rsl88551104 的引物序列為 SEQ ID No:121 和 SEQ ID No:122 ;
[0056] rs202172344 的引物序列為 SEQ ID No: 124 和 SEQ ID No: 125 ;
[0057] rsll564258 的引物序列為 SEQ ID No:127 和 SEQ ID No:128 ;
[0058] rs2242527 的引物序列為 SEQ ID No: 130 和 SEQ ID No: 131 ;
[0059] rsl052690 的引物序列為 SEQ ID No: 133 和 SEQ ID No: 134 ;
[0060] rsll7207261 的引物序列為 SEQ ID No:136 和 SEQ ID No:137 ;
[0061] rsl40636259 的引物序列為 SEQ ID No:139 和 SEQ ID No:140 ;
[0062] rs2305710 的引物序列為 SEQ ID No: 142 和 SEQ ID No: 143 ;
[0063] rs61978639 的引物序列為 SEQ ID No: 145 和 SEQ ID No: 146 ;
[0064] rs3130257 的引物序列為 SEQ ID No: 148 和 SEQ ID No: 149 ;
[0065] rs34908836 的引物序列為 SEQ ID No: 151 和 SEQ ID No: 152 ;
[0066] rs56229136 的引物序列為SEQIDNo:154和SEQIDNo:155。
[0067] 所述的遺傳標誌物的特異性延伸引物，該引物為：
[0068] rs3827760 的引物序列為 SEQ ID No:3 ;rsll570112 的引物序列為 SEQ ID No:6 ; rs201130283 的引物序列為 SEQ ID No:9;rs201477597 的引物序列為 SEQ ID No:12; rsl264429 的引物序列為 SEQ ID No:15;rsl43989805 的引物序列為 SEQ ID No:18; rsl47592698 的引物序列為 SEQ ID No:21;rs41269281 的引物序列為 SEQ ID No:24; rsl7217280 的引物序列為 SEQ ID No:27;rsl91127702 的引物序列為 SEQ ID No:30; rs2793086 的引物序列為 SEQ ID No:33 ;rs6446315 的引物序列為 SEQ ID No:36 ; rslll909699 的引物序列為 SEQ ID No:39;rsl42508708 的引物序列為 SEQ ID No:42; rs3733782 的引物序列為 SEQ ID No:45;rsl38921247 的引物序列為 SEQ ID No:48; rs45611935 的引物序列為 SEQ ID No:51;rs35683659 的引物序列為 SEQ ID No:54; rsl47031025 的引物序列為 SEQ ID No:57;rs200847762 的引物序列為 SEQ ID No:60; rs78373056 的引物序列為 SEQ ID No:63;rs3739757 的引物序列為 SEQ ID No:66; rs679882 的引物序列為 SEQ ID No:69;rsl41615048 的引物序列為 SEQ ID No:72; rsl46021011 的引物序列為 SEQ ID No:75;rs7769051 的引物序列為 SEQ ID No:78; rs201854588 的引物序列為 SEQ ID No:81;rs41302077 的引物序列為 SEQ ID No:84; rsll571707 的引物序列為 SEQ ID No:87;rs78738447 的引物序列為 SEQ ID No:90; rs79153019 的引物序列為 SEQ ID No:93;rs35511555 的引物序列為 SEQ ID No:96; rsl90646764 的引物序列為 SEQ ID No:99;rs76685516 的引物序列為 SEQ ID No:102; rs61752940 的引物序列為 SEQ ID No:105;rsl90958876 的引物序列為 SEQ ID No:108; rs9475487 的引物序列為 SEQ ID No:lll;rs80358282 的引物序列為 SEQ ID No:114; rs2305985 的引物序列為 SEQ ID No:117;rs201287330 的引物序列為 SEQ ID No:120; rsl88551104 的引物序列為 SEQ ID No:123;rs202172344 的引物序列為 SEQ ID No:126; rsll564258 的引物序列為 SEQ ID No:129;rs2242527 的引物序列為 SEQ ID No:132; rsl052690 的引物序列為 SEQ ID No:135;rsll7207261 的引物序列為 SEQ ID No:138; rsl40636259 的引物序列為 SEQ ID No:141;rs2305710 的引物序列為 SEQ ID No:144; rs61978639 的引物序列為 SEQ ID No:147;rs3130257 的引物序列為 SEQ ID No:150; rs34908836 的引物序列為 SEQ ID No:153;rs56229136 的引物序列為 SEQ ID No:156。
[0069] 所述的遺傳標誌物在製備胃癌輔助診斷試劑盒中的應用。
[0070] 所述的遺傳標誌物的特異性擴增引物在製備胃癌輔助診斷試劑盒中的應用。
[0071] 所述的遺傳標誌物的特異性延伸引物在製備胃癌輔助診斷試劑盒中的應用。
[0072] -種胃癌輔助診斷試劑盒，該試劑盒用於檢測外周血DNA中rs3827760， rsll570112, rs201130283, rs201477597, rsl264429, rsl43989805, rsl47592698, rs41269281, rsl7217280, rsl91127702, rs2793086, rs6446315, rslll909699, rsl42508708, rs3733782, rsl38921247, rs45611935, rs35683659, rsl47031025, rs200847762, rs78373056, rs3739757, rs679882,rsl41615048,rsl46021011,rs7769051, rs201854588, rs41302077, rsll571707, rs78738447, rs79153019, rs35511555, rsl90646764,rs76685516,rs61752940,rsl90958876,rs9475487,rs80358282,rs2305985, rs201287330, rsl88551104, rs202172344, rsll564258, rs2242527, rsl052690, rsll7207261, rsl40636259, rs2305710, rs61978639, rs3130257, rs34908836,和 rs56229136〇
[0073] 所述的診斷試劑盒，該試劑盒含有上述的特異性擴增引物和/或特異性延伸引 物。
[0074] 所述診斷試劑盒，該試劑盒還包括PCR技術常用的試劑，如Taq酶、dNTP混合液、 MgCl2溶液、去離子水等；還可以含有標準品和/或對照品。
[0075] 具體地說，本發明解決問題的技術方案包括：（1)建立統一標準的標本庫和數據 庫：以標準操作程序（SOP)採集符合標準的血液樣本，系統收集完整的人口學資料和臨床 資料。（2)基因型檢測：選擇胃癌病例以及與之匹配的對照，利用高密度低頻高外顯性遺傳 標誌物晶片，在全外顯子組範圍內找出與胃癌相關的遺傳標誌物。（3)對篩選出的陽性關聯 遺傳標誌物，進一步在樣本中進行檢測，以判斷其關聯的穩定性。（4)胃癌輔助診斷試劑盒 的研製：根據胃癌病例和健康對照中基因型分布頻率有顯著差異的遺傳標誌物開發輔助診 斷試劑盒。
[0076] 本發明人以標準操作程序（SOP)採集符合標準的血液樣本，系統收集完整的人口 學資料、臨床資料等，並米用了 Illuminalnnnium?Human Exome BeadChip(Illumina Inc·， San Diego, CA)晶片進行全外顯子組掃描，Sequeom MassARRAY基因分型進行單個位點的檢 測等。
[0077] 具體來說研究的實驗方法主要包括以下幾個部分：
[0078] 1.研究樣本的選擇
[0079] (1)經病理學明確診斷的胃癌病例；
[0080] (2)與病例匹配的對照；
[0081] 本研究共選用4090例符合標準的樣本進行研究。
[0082] 2.酚-氯仿法提取外周血基因組DNA，按常規方法操作。通常能得到20_50ng/ μ 1DNA，純度（紫外 2600D 與 2800D 比值）在 1. 6-2. 0。
[0083] 3. Illumina InHniumw Human Exome BeadChip (Illumina Inc. , San Diego, CA) 晶片檢測
[0084] (1)取受試者全基因組DNA樣本；
[0085] (2) ￠: Illumina InIlnium00 Human Exome BeadChip (Illumina Inc. , San Diego, CA)晶片上進行全外顯子組掃描；
[0086] (3)檢測並比較各基因型在胃癌病例與健康對照中的分別差異。
[0087] 4.單個遺傳標誌物的Sequeom MassARRAY基因分型
[0088] (1)取受試者DNA樣本；
[0089] (2)設計單個遺傳標誌物的特異性引物；
[0090] (3)進行 PCR 反應；
[0091] (4)檢測並比較胃癌病例與健康對照中不同基因型的分布差異。
[0092] 5.診斷試劑盒製備方法
[0093] Illumina InIlniumui' Human Exome BeadChip (Illumina Inc. , San Diego, CA)芯 片進行全外顯子組掃描和單個遺傳標誌物檢測後確定胃癌病例與健康對照中基因型分布 頻率有顯著差異的遺傳標誌物，作為胃癌診斷的指標。最後篩選出的與胃癌發病有關的 遺傳標誌物組成輔助診斷試劑盒（rs3827760, rsll570112, rs201130283, rs201477597， rsl264429, rsl43989805, rsl47592698, rs41269281, rsl7217280, rsl91127702, rs2793086,rs6446315,rslll909699,rsl42508708,rs3733782,rsl38921247,rs45611935, rs35683659,rsl47031025,rs200847762,rs78373056,rs3739757,rs679882,rsl41615048, rsl46021011, rs7769051, rs201854588, rs41302077, rsll571707, rs78738447, rs79153019, rs35511555, rsl90646764, rs76685516, rs61752940, rsl90958876, rs9475487, rs80358282, rs2305985, rs201287330, rsl88551104, rs202172344, rsll564258, rs2242527,rsl052690,rsll7207261, rsl40636259, rs2305710, rs61978639, rs3130257, rs34908836,和rs56229136)。診斷試劑可以包括這些遺傳標誌物的特異性引 物對，以及Taq酶、dNTP等試劑。
[0094] 6.統計分析方法
[0095] 運用X 2檢驗（用於分類變量）或者student t檢驗（用於連續性變量）比較人 口學特徵等在研究對象組間分布的差異。用logistic回歸分析中的additive模型進行關 聯分析。
[0096] 為了進一步研究這52個低頻高外顯性遺傳標誌物構成的綜合指徵用於早期診 斷的效果，我們構建了一個數學公式，綜合考慮每個遺傳標誌物與胃癌發病的正、負關聯 情況和聯繫強度。具體來說，我們對每個遺傳標誌物的三種基因型進行評分，野生純合，以單個SNP分析時的additive模型下的回 歸係數為權重，綜合考慮每個遺傳標誌物的情況給每個研究對象確定一個危險分值。危 險分值的計算方法如下：危險分值=(〇. 450Xrs3827760的評分）+ (0. 797Xrsll570112 的評分）+ (1. 001Xrs201130283 的評分）+ (1. 456Xrs201477597 的評 分）+ (0· 476Xrsl264429 的評分）+ (0· 935Xrsl43989805 的評分）+ (0· 742Xrsl47592698 的評分）+ (1. 286 Xrs41269281 的評分）+ (0.663Xrsl7217280 的評 分）+ (1. 473Xrsl91127702 的評分）+ (0· 551Xrs2793086 的評分）+ (1. 836Xrs6446315 的評分）+ (_〇· 782Xrsl 11909699 的評分）+ (0.757Xrsl42508708 的評 分）+ (-0· 634Xrs3733782 的評分）+ (0· 542Xrsl38921247 的評分）+ (0· 459Xrs45611935 的評分）+ (0.504Xrs35683659 的評分）+ (2. 569Xrsl47031025 的評 分）+ (-0· 826Xrs200847762 的評分）+ (1. 379Xrs78373056 的評分）+ (2. 163Xrs3739757 的評分）+ (0.454Xrs679882 的評分）+ (0.926Xrsl41615048 的評 分）+ (1. 070Xrsl46021011 的評分）+ (0· 369Xrs7769051 的評分）+ (1. 250Xrs201854588 的評分）+ (〇.448 Xrs41302077 的評分）+ (1. 144Xrsll571707 的評 分）+ (-0· 418Xrs78738447 的評分）+ (0· 864Xrs79153019 的評分）+ (1. 259Xrs35511555 的評分）+ (1. 749Xrsl90646764 的評分）+ (0.363Xrs76685516 的評 分）+ (I. 012 X rs61752940 的評分）+ (0· 923 X rs 190958876 的評分）+ (0· 450 X rs9475487 的 評分）+ (1. 709 Xrs80358282 的評分）+ (0· 541 Xrs2305985 的評分）+ (1. 275 Xrs201287330 的評分）+ (1. 272Xrsl88551104 的評分）+ (1. 156Xrs202172344 的評 分）+ (0· 416Xrsl 1564258 的評分）+ (0· 694Xrs2242527 的評分）+ (-0· 606Xrsl052690 的評分）+ (-1. 261Xrsll7207261 的評分）+ (-0· 764Xrsl40636259 的評 分）+ (0· 373Xrs2305710 的評分）+ (· 486Xrs61978639 的評分）+ (1. 169Xrs3130257 的評 分）+ (0. 856 Xrs34908836的評分）+ (0. 523 X rs56229136的評分），獲得的危險分值係數以 及界限值被直接應用於全基因組關聯研究的4090例樣本中。（以rs3827760為例：0. 450 為rs3827760的回歸係數（見表I)，，某個SNP的基因型由儀器檢測結果確定；某個樣本的總評分是這些個 SNP分別評分的總和，單個SNP的基因型只是計算評分的一個中間過程，不需要知道具體基 因型。）
[0097] 統計學分析均通過專門的統計學分析軟體完成（PLINK1. 07)。統計學顯著性水平 P值設為〇. 05,所有統計學檢驗均為雙側檢驗。
[0098] 以下是本發明進一步的說明：
[0099] 在上述1140例符合條件的胃癌病例及2950例健康對照中，兩組年齡、性別均衡可 t匕。我們將這兩組人群經 Illumina Inrinium?:Human Exome BeadChip (Illumina Inc.，San Diego, CA)晶片進行全外顯子組掃描獲得相關結果。
[0100] 根據 Illumina Infinium? Human Exome BeadChip (IIlumina Inc. , San Diego, CA)晶片檢測，本發明人檢測到在"胃癌病例"組和"健康對照"組中基因型分布頻率 存在差異的遺傳標誌物包括：rs3827760, rsll570112, rs201130283, rs201477597， rsl264429, rsl43989805, rsl47592698, rs41269281, rsl7217280, rsl91127702, rs2793086,rs6446315,rslll909699,rsl42508708,rs3733782,rsl38921247,rs45611935, rs35683659,rsl47031025,rs200847762,rs78373056,rs3739757,rs679882,rsl41615048, rsl46021011, rs7769051, rs201854588, rs41302077, rsll571707, rs78738447, rs79153019, rs35511555, rsl90646764, rs76685516, rs61752940, rsl90958876, rs9475487, rs80358282, rs2305985, rs201287330, rsl88551104, rs202172344, rsll564258, rs2242527,rsl052690,rsll7207261, rsl40636259, rs2305710, rs61978639, rs3130257, rs34908836,和 rs56229136。
[0101] 單因素和多因素 Logistic回歸分析結果均表明，這52個遺傳標誌物與胃癌的發 病存在著顯著關聯。
[0102] 進一步分析這52個遺傳標誌物的組合用於胃癌診斷的效果，發現其組合能夠很 好的區分病例與對照。
[0103] 根據上述實驗結果，本發明人製備了一種能用於胃癌輔助診斷的試劑盒，包含測 定受試者血標本DNA中上述遺傳標誌物的特異性引物和其他檢測試劑。
[0104] 具體而言，這52個遺傳標誌物的組合，或者這52個遺傳標誌物的特異性引物構成 的相關診斷試劑盒有助於胃癌的輔助診斷，為臨床醫生快速準確掌握患者的疾病狀態和病 情嚴重程度，及時採取更具個性化的防治方案提供支持。
[0105] 本發明有益效果：
[0106] 本發明提供的遺傳標誌物作為胃癌輔助判斷的標誌物的優越性在於：
[0107] (1)低頻高外顯性遺傳標誌物是一種新型基因生物標誌物，區別於傳統生物標誌 物，穩定、微創、易於檢測，將大大提高疾病診斷的敏感性和特異性，該類生物標誌物的成功 開發將為胃癌的診斷和治療開創全新局面，為其他疾病生物標誌物的研製提供借鑑。
[0108] (2)遺傳標誌物試劑盒是一種系統、全面的診斷試劑盒，可用於胃癌的輔助診斷， 有助於更好地反映患者的疾病狀態，為臨床醫生快速準確掌握患者病情、及時採取更具個 性化的防治方案提供支持。
[0109] (3)採用嚴密的驗證和評價體系，本發明人初期採用全外顯子組晶片掃描以獲取 疾病相關的低頻高外顯性遺傳標誌物，並應用Sequeom MassARRAY基因分型方法在大樣本 中進行了驗證；以上方法和策略的應用加速和保證了低頻高外顯性遺傳生物標誌物和診斷 試劑盒在臨床上的應用，也為其他疾病生物標誌物的研製提供方法和策略上的借鑑。
[0110] 本發明通過控制年齡、性別、吸菸、飲酒等對疾病發展的影響因素，研究遺傳標誌 物在胃癌輔助診斷的應用前景，闡述遺傳標誌物對於胃癌進展的影響，揭示其診斷價值。因 此，本發明獲得了胃癌發病相關遺傳標誌物；通過遺傳標誌物和診斷試劑盒的研製和應用， 可使得胃癌的診斷更加方便易行，為臨床醫生快速準確掌握患者病情，為臨床治療效果評 價奠定基礎，並為發現具有潛在治療價值的新型小分子藥物靶標提供幫助。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0111] 圖1 :顯示全外顯子組關聯研究病例組和對照組的ROC曲線。
[0112] 顯示胃癌病例組對健康對照組為參照的ROC曲線。
【具體實施方式】
[0113] 以下通過實施例對本發明作進一步的闡述。
[0114] 實施例1樣品的收集和樣品資料的整理
[0115] 發明人於2004年開始至2010年從南京醫科大學腫瘤中心收集了大量的胃癌患者 血標本，通過對樣品資料的整理，發明人從中選擇了 4090例符合下列標準的樣本作為全基 因組晶片掃描和單個遺傳標誌物Sequeom MassARRAY基因分型的實驗樣品：
[0116] 1、病理學明確診斷的胃癌患者；
[0117] 2、與之匹配的健康對照；
[0118] 並系統採集了這些樣本的人口學資料和臨床資料等情況。
[0119] 實施例2外周血DNA全外顯子組掃描
[0120] 在上述符合條件的1140例胃癌患者和2950例健康對照中，將這兩組人群經 Illumina Infinium? Human Exome BeadChip (IIlumina Inc. , San Diego, CA)晶片檢測獲 得相關結果。具體步驟為：
[0121] 1、向儲存於2ml凍存管中的外周血加入溶血試劑（即裂解液，40份量配置方法如 下：蔗糖219. 72g、氯化鎂2. 02g和曲拉通X-100 (amresco 0694) 20ml混合後，用TrisHcl溶 液定容至2000ml，下同），顛倒混勻後完全轉入。
[0122] 2、去除紅細胞：用溶血試劑將5ml離心管補至4ml，顛倒混勻，4000rpm離心10分 鍾，棄上清。向沉澱中加入4ml溶血試劑，再次顛倒混勻清洗一次，4000rpm離心10分鐘，棄 上清。
[0123] 3、抽提DNA :向沉澱中加 Iml抽提液（每300ml中含有122.5ml 0.2M氯化鈉， 14. 4ml 0.5M乙二胺四乙酸，15ml 10%十二燒基硫酸鈉，148. Iml雙蒸水，下同）和8μ1蛋 白酶Κ，充分震蕩混勻，37°C水浴過夜。
[0124] 4、去除蛋白質：加 Iml飽和酚充分混勻（手輕搖15分鐘），4000rpm離心10分鐘， 取上清轉入新的5ml離心管中。在上清液中加入等體積氯仿與異戊醇混合液（氯仿：異戊 醇=24 :1，v/v，下同），充分混勻後（手搖15分鐘），4000rpm離心10分鐘，取上清（分入 兩個I. 5ml的離心管）。
[0125] 5、DNA沉澱：在上清液中加入3M的醋酸鈉60 μ 1，再加入與上清液等體積的冰無 水乙醇，上下輕搖，可見白色絮狀沉澱物，再以12000rpm離心lOmin。
[0126] 6、DNA洗漆：在沉澱中加入冰無水乙醇1ml，12000rpm離心IOmin,棄上清後真空抽 幹或置於清潔乾燥環境中蒸乾。
[0127] 7、測量濃度：通常能得到20-50ng/ μ I DNA，純度（紫外2600D與2800D比值）在 1. 6~2, 0〇
[0128] 8、進行全夕卜顯子組掃描：在 Illumina Infinium? Human Exome BeadChip(Illumina Inc.，San Diego，CA)晶片上進行全外顯子組掃描。
[0129] 9、數據分析與處理：在"胃癌病例"組和"健康對照"組中發現的基因型分布頻率 有顯著差異的低頻高外顯性遺傳標誌物在上文中已經羅列出，結果見表1。
[0130] 表1.病例組與對照組全外顯子組關聯分析結果
[0131]
[0132]
【權利要求】
1. 一種與胃癌輔助診斷相關的低頻高外顯性遺傳標誌物，其特徵在於該標誌物 為 rs3827760, rsll570112, rs201130283, rs201477597, rsl264429, rsl43989805， rsl47592698, rs41269281, rsl7217280, rsl91127702, rs2793086, rs6446315, rslll909699, rsl42508708, rs3733782, rsl38921247, rs45611935, rs35683659, rsl47031025, rs200847762, rs78373056, rs3739757, rs679882, rsl41615048, rsl46021011, rs7769051, rs201854588, rs41302077, rsll571707, rs78738447, rs79153019, rs35511555, rsl90646764, rs76685516, rs61752940, rsl90958876, rs9475487, rs80358282, rs2305985, rs201287330, rsl88551104, rs202172344, rsll564258, rs2242527, rsl052690,rsll7207261, rsl40636259, rs2305710, rs61978639, rs3130257, rs34908836,和 rs56229136 的組合。
2. 權利要求1所述的遺傳標誌物的特異性擴增引物，其特徵在於該引物為： rs3827760 的引物序列為 SEQ ID No:l 和 SEQ ID No:2 ; rsll570112 的引物序列為 SEQ ID No:4 和 SEQ ID No:5 ; rs201130283 的引物序列為 SEQ ID No:7 和 SEQ ID No:8; rs201477597 的引物序列為 SEQ ID No:10 和 SEQ ID No:11 ; rsl264429 的引物序列為SEQIDNo:13和SEQIDNo:14; rsl43989805 的引物序列為SEQIDNo:16和SEQIDNo:17; rsl47592698 的引物序列為SEQIDNo:19和SEQIDNo:20; rs41269281 的引物序列為 SEQ ID No:22 和 SEQ ID No:23 ; rsl7217280 的引物序列為 SEQ ID No:25 和 SEQ ID No:26 ; rsl91127702 的引物序列為 SEQ ID No:28 和 SEQ ID No:29; rs2793086 的引物序列為 SEQ ID No:31 和 SEQ ID No:32 ; rs6446315 的引物序列為 SEQ ID No:34 和 SEQ ID No:35; rs 111909699 的引物序列為 SEQ ID No :37 和 SEQ ID No :38 ; rsl42508708 的引物序列為 SEQ ID No:40 和 SEQ ID No:41 ; rs3733782 的引物序列為 SEQ ID No:43 和 SEQ ID No:44 ; rsl38921247 的引物序列為 SEQ ID No:46 和 SEQ ID No:47 ; rs45611935 的引物序列為 SEQ ID No :49 和 SEQ ID No :50 ; rs35683659 的引物序列為 SEQ ID No:52 和 SEQ ID No:53 ; rs 147031025 的引物序列為 SEQ ID No :55 和 SEQ ID No :56 ; rs200847762 的引物序列為 SEQ ID No:58 和 SEQ ID No:59 ; rs78373056 的引物序列為 SEQ ID No:61 和 SEQ ID No:62 ; rs3739757 的引物序列為 SEQ ID No:64 和 SEQ ID No:65 ; rs679882 的引物序列為 SEQ ID No :67 和 SEQ ID No :68 ; rsl41615048 的引物序列為 SEQ ID No:70 和 SEQ ID No:71 ; rsl46021011 的引物序列為 SEQ ID No:73 和 SEQ ID No:74; rs7769051 的引物序列為 SEQ ID No:76 和 SEQ ID No:77 ; rs201854588 的引物序列為 SEQ ID No :79 和 SEQ ID No :80 ; rs41302077 的引物序列為 SEQ ID No:82 和 SEQ ID No:83 ; rsll571707 的引物序列為 SEQ ID No:85 和 SEQ ID No:86; rs78738447 的引物序列為 SEQ ID No:88 和 SEQ ID No:89 ; rs79153019 的引物序列為 SEQ ID No:91 和 SEQ ID No:92 ; rs35511555 的引物序列為 SEQ ID No:94 和 SEQ ID No:95; rsl90646764 的引物序列為 SEQ ID No:97 和 SEQ ID No:98 ; rs76685516 的引物序列為 SEQ ID No:100 和 SEQ ID No: 101; rs61752940 的引物序列為SEQIDNo:103和SEQIDNo:104; rsl90958876 的引物序列為SEQIDNo:106和SEQIDNo:107; rs9475487 的引物序列為 SEQ ID No: 109 和 SEQ ID No: 110; rs80358282 的引物序列為SEQIDNo:112和SEQIDNo:113; rs2305985 的引物序列為 SEQ ID No: 115 和 SEQ ID No: 116; rs201287330 的引物序列為SEQIDNo:118和SEQIDNo:119; rsl88551104 的引物序列為SEQIDNo:121和SEQIDNo:122; rs202172344 的引物序列為SEQIDNo:124和SEQIDNo:125; rsll564258 的引物序列為SEQIDNo:127和SEQIDNo:128; rs2242527 的引物序列為 SEQ ID No: 130 和 SEQ ID No: 131 ; rsl052690 的引物序列為 SEQ ID No: 133 和 SEQ ID No: 134; rsll7207261 的引物序列為SEQIDNo:136和SEQIDNo:137; rsl40636259 的引物序列為SEQIDNo:139和SEQIDNo:140; rs2305710 的引物序列為 SEQ ID No: 142 和 SEQ ID No: 143; rs61978639 的引物序列為SEQIDNo:145和SEQIDNo:146; rs3130257 的引物序列為 SEQ ID No: 148 和 SEQ ID No: 149; rs34908836 的引物序列為 SEQ ID No: 151 和 SEQ ID No: 152 ; rs56229136 的引物序列為SEQIDNo:154和SEQIDNo:155。
3.權利要求1所述的遺傳標誌物的特異性延伸引物，其特徵在於該引物為： rs3827760 的引物序列為 SEQ ID No:3;rsll570112 的引物序列為 SEQ ID No:6; rs201130283 的引物序列為 SEQ ID No:9;rs201477597 的引物序列為 SEQ ID No:12; rsl264429 的引物序列為 SEQ ID No:15;rsl43989805 的引物序列為 SEQ ID No:18; rsl47592698 的引物序列為 SEQ ID No:21;rs41269281 的引物序列為 SEQ ID No:24; rsl7217280 的引物序列為 SEQ ID No:27;rsl91127702 的引物序列為 SEQ ID No:30; rs2793086 的引物序列為 SEQ ID No:33 ;rs6446315 的引物序列為 SEQ ID No:36 ; rslll909699 的引物序列為 SEQ ID No:39;rsl42508708 的引物序列為 SEQ ID No:42; rs3733782 的引物序列為 SEQ ID No:45;rsl38921247 的引物序列為 SEQ ID No:48; rs45611935 的引物序列為 SEQ ID No:51;rs35683659 的引物序列為 SEQ ID No:54; rsl47031025 的引物序列為 SEQ ID No:57;rs200847762 的引物序列為 SEQ ID No:60; rs78373056 的引物序列為 SEQ ID No:63 ;rs3739757 的引物序列為 SEQ ID No:66 ; rs679882 的引物序列為 SEQ ID No:69;rsl41615048 的引物序列為 SEQ ID No:72; rsl46021011 的引物序列為 SEQ ID No:75;rs7769051 的引物序列為 SEQ ID No:78; rs201854588 的引物序列為 SEQ ID No:81;rs41302077 的引物序列為 SEQ ID No:84; rsll571707 的引物序列為SEQIDNo:87;rs78738447 的引物序列為SEQIDNo:90; rs79153019 的引物序列為SEQIDNo:93;rs35511555 的引物序列為SEQIDNo:96; rsl90646764 的引物序列為SEQIDNo:99;rs76685516 的引物序列為SEQIDNo:102; rs61752940 的引物序列為 SEQ ID No:105;rsl90958876 的引物序列為 SEQ ID No:108; rs9475487 的引物序列為SEQIDNo:lll;rs80358282 的引物序列為SEQIDNo:114; rs2305985 的引物序列為 SEQ ID No:117;rs201287330 的引物序列為 SEQ ID No:120; rsl88551104 的引物序列為 SEQ ID No:123;rs202172344 的引物序列為 SEQ ID No:126; rsll564258 的引物序列為 SEQ ID No:129;rs2242527 的引物序列為 SEQ ID No:132; rsl052690 的引物序列為 SEQ ID No:135;rsll7207261 的引物序列為 SEQ ID No:138; rsl40636259 的引物序列為 SEQ ID No:141;rs2305710 的引物序列為 SEQ ID No:144; rs61978639 的引物序列為 SEQ ID No:147;rs3130257 的引物序列為 SEQ ID No:150; rs34908836 的引物序列為 SEQ ID No:153;rs56229136 的引物序列為 SEQ ID No:156。
4. 權利要求1所述的遺傳標誌物在製備胃癌輔助診斷試劑盒中的應用。
5. 權利要求2所述的遺傳標誌物的特異性擴增引物在製備胃癌輔助診斷試劑盒中的 應用。
6. 權利要求3所述的遺傳標誌物的特異性延伸引物在製備胃癌輔助診斷試劑盒中的 應用。
7. -種胃癌輔助診斷試劑盒，其特徵在於該試劑盒用於檢測外周血DNA中rs3827760， rsll570112, rs201130283, rs201477597, rsl264429, rsl43989805, rsl47592698, rs41269281, rsl7217280, rsl91127702, rs2793086, rs6446315, rslll909699, rsl42508708, rs3733782, rsl38921247, rs45611935, rs35683659, rsl47031025, rs200847762, rs78373056, rs3739757, rs679882, rsl41615048, rsl46021011, rs7769051, rs201854588, rs41302077, rsll571707, rs78738447, rs79153019, rs35511555, rsl90646764,rs76685516,rs61752940,rsl90958876,rs9475487,rs80358282,rs2305985, rs201287330, rsl88551104, rs202172344, rsll564258, rs2242527, rsl052690, rsll7207261， rsl40636259, rs2305710, rs61978639, rs3130257, rs34908836 和 rs56229136〇
8. 根據權利要求7所述的診斷試劑盒，其特徵在於該試劑盒含有權利要求2所述的特 異性擴增引物和/或權利要求3所述的特異性延伸引物。
9. 根據權利要求7或8所述診斷試劑盒，其特徵在於該試劑盒還包括PCR技術常用的 試劑。
【文檔編號】C12Q1/68GK104263823SQ201410469997
【公開日】2015年1月7日 申請日期:2014年9月15日 優先權日:2014年9月15日
【發明者】沈洪兵, 靳光付, 馬紅霞, 胡志斌, 戴俊程, 朱迅 申請人:南京醫科大學