核酸外切酶Ⅲ消化包被在微孔板上的含有特殊標記的雙鏈核酸分子檢測轉錄因子蛋白的製作方法
2023-05-15 06:49:16 2
專利名稱：核酸外切酶Ⅲ消化包被在微孔板上的含有特殊標記的雙鏈核酸分子檢測轉錄因子蛋白的製作方法
技術領域：
轉錄因子(transcription factor)是生物蛋白質組(proteomics)中一類負責基因表達調控(geneexpression regulation)的重要蛋白質，是基因表達調控通路(pathway)及網絡(network)的樞紐，是功能基因組(functional genomics)和蛋白質組研究的重要對象；許多疾病都與轉錄因子的異常表達(expression)及活化(activation)存在密切的關係，成為轉錄治療(transcriptional therapy)和藥物研究的重要靶點(drug target)。轉錄因子表達及活化程度的檢測分析是研究其功能的主要手段。本專利提出了一種檢測轉錄因子表達和活化水平的新方法，該方法將為是分子生物學(molecular biology)、功能基因組學、蛋白質組學及生物醫學(Biomedicine)領域中的轉錄因子相關研究提供一種新的檢測分析技術，可促進這些領域中轉錄因子相關的科學研究，以及在生物醫學領域中提供一種疾病相關轉錄因子的診斷技術、以及轉錄因子為靶點的藥物篩選(drug screening)技術。
背景技術：
轉錄因子蛋白是生物蛋白質組中一類負責基因表達調控的重要蛋白質，是基因表達調控通路及網絡的樞紐，是功能基因組和蛋白質組研究的重要對象；許多疾病都與轉錄因子的異常表達及活化存在密切的關係，成為轉錄治療和藥物研究的重要靶點。轉錄因子表達及活化程度的檢測分析是研究其功能的主要手段。因此，有關檢測分析轉錄因子表達及活化程度技術的研究一直受到科學界的重視。
分子生物學研究表明，在基因的上下文(context)存在一些發揮啟動(promote)、增強(enhance)或衰減(attenuate)基因轉錄作用的特定DNA序列，稱為順式作用元件(cis-actingelements)，如啟動子(promoter)、增強子(enhancer)、衰減子(attenuater)；轉錄因子蛋白是生物蛋白質組中一類特殊的蛋白質，這類蛋白質的細胞質中完成其翻譯(translation)後，在正常細胞功能狀態或細胞受到特定因子誘導下，進入細胞核，與基因組中的順式作用元件發生特異性識別結合，組成基因轉錄機器(transcription apparatus)，實現其基因表達的調控功能，稱為反式作用因子(trans-acting factors)。轉錄因子蛋白與順式作用元件組成基因轉錄機器的首要環節是轉錄因子蛋白中一些具有特殊結構轉錄因子直接與順式作用元件DNA序列發生序列特異性結合(sequence-specific binding)，完成基因轉錄機器組裝的第一步。因此，檢測分析轉錄因子表達及活化程度的技術主要建立在DNA/蛋白質相互作用這一層次，即運用含有順式作用元件的DNA為探針，探測轉錄因子的表達及活化。
時至目前，科學家們已經建立多種基於DNA/蛋白質相互作用這一層次的轉錄因子表達及活化程度的檢測分析技術。其中最經典的是電泳遷移率變動分析(Electrophoresis MobilityShift Assay)，即凝膠遷移實驗(gel shift assay)。該技術一般是人工合成含有轉錄因子結合序列(consensus，binding sites)的雙鏈(double-stranded)寡核苷酸(oligonucleotides)，並用放射性同位素標記寡核苷酸，將標記寡核苷酸與含有轉錄因子蛋白的細胞或組織抽提物混合孵育一段時間後，進行自然聚丙烯醯胺凝膠電泳(native polyacrylamide gel eletrophoresis，PAGE)，分離游離(free DNA)和與蛋白質結合的DNA(retarded DNA)，在通過X-光底片暴光顯現與蛋白質結合的DNA(retarded DNA)，來反映轉錄因子表達及活化程度。這一技術目前仍非常有效地用於轉錄因子蛋白檢測分析。但存在放射性標記對實驗人員及環境危害的缺陷。因此，對這一技術後來進行了非放射性標記的改進。即用地高辛(digoxigenin，DIG)標記寡核苷酸，進行自然聚丙烯醯胺凝膠電泳，再將電泳產物轉印(blotting)到尼龍膜(nylon membrane)等介質上，依靠鹼性磷酸酶或辣根過氧化物酶耦聯的DIG抗體和相應酶的生色(colorimetric)或發光(chemiluminescent)底物(substrate)，進行化學生色或發光檢測，來反映轉錄因子表達及活化程度。也有採用螢光(fluorescent)標記寡核苷酸進行電泳遷移率變動分析的改進技術。這些技術也能夠很好地用於轉錄因子蛋白檢測分析。但這些技術仍然存在自身的缺點，即它們雖然避免了經典放射性標記探針凝膠遷移實驗的缺點，但同時帶來實驗流程的複雜化和更多的影響因素，如尼龍膜實驗的高背景、轉引設備需求及實驗成本提高等問題。同時，這些改進技術從根本上未擺脫種凝膠遷移實驗的技術思想，無法克服凝膠遷移實驗對實驗樣品數量需求大、實驗耗時長、分析效率低等缺陷。
鑑於這些技術目前仍然存在的缺點，建立從技術思想角度上完全不同於凝膠遷移實驗的轉錄因子表達及活化檢測及分析技術是非常必要的。為此我們已經進行了諸多相關研究，並發展了一些新的技術。例如，利用基因晶片技術的策略，我們曾經致力於將含有轉錄因子蛋白結合位點的雙鏈DNA固定到固相載體如玻片表面，製備雙鏈DNA微陣列晶片(double-stranded DNA microarray chip)，用於轉錄因子表達及活化的檢測及分析。我們發明了數種製備雙鏈DNA微陣列晶片的技術(中國專利ZL02112780.8，02137945.9，03152881.3)，並成功製備了專用於檢測轉錄因子蛋白NF-κB的雙鏈DNA微陣列晶片(中國專利03132206.9)，而且由此建立了一種在「DNA/蛋白質」相互作用的分子層面上從複雜組分物質如中藥和組合化學混合物中高通量篩選、捕獲和分離目標分子的技術(中國專利03152882.1)。
技術的有效性和實用性是技術的命脈。雖然我們的雙鏈DNA微陣列晶片技術已經達到了實用化水平，但我們注意到該項技術的推廣應用仍然面臨很大的困難，即晶片的製備和使用成本比較高昂。特別是晶片的實際使用中必須依賴於目前非常昂貴的基因晶片掃描裝置，極大地限制了雙鏈DNA微陣列晶片技術的商業化。由此，我們著力改進這一技術，將DNA固相化技術與核酸外切酶III及傳統的微孔板實驗技術結合在一起，提出了本發明「核酸外切酶III消化包被在微孔板上的含有特殊標記的雙鏈核酸分子檢測轉錄因子蛋白」技術。這一技術將雙鏈DNA微陣列晶片技術中的DNA固定介質有玻片改為微孔板，檢測儀器自然由昂貴的基因晶片掃描裝置改變為成本低廉的酶標儀等。這一改進，極大地降低了製備和使用成本，能夠很好地解決我們建立的雙鏈DNA微陣列晶片技術的應用化問題。
發明內容
(1)、發明目的本發明的目的是提供一種製備和使用成本較低的檢測轉錄因子表達和活化水平的新方法，便於在普通設備條件下製備雙鏈核酸分子包被微孔板，依靠用於傳統酶聯免疫吸附實驗的酶標儀、洗板機等低價設備，運用成熟的酶聯免疫吸附實驗技術流程實現轉錄因子表達和活化水平的高通量檢測分析。為分子生物學、功能基因組學、蛋白質組學及生物醫學等領域中的轉錄因子的相關研究提供一種新的實驗技術，促進這些領域中轉錄因子相關的科學研究，以及針對轉錄因子的臨床檢測和藥物篩選研究。
(2)、技術方案本專利提出了一種檢測轉錄因子表達和活化水平的新技術，即「核酸外切酶III消化微孔板包被特殊標記雙鏈核酸分子檢測轉錄因子蛋白」。
運用該方法檢測轉錄因子蛋白表達和活化水平包括如下步驟a)準備特殊標記的核酸分子；b)將特殊標記的核酸分子連接固定到微孔板孔內；c)將轉錄因子蛋白與微孔板孵育；d)將核酸外切酶III反應液與微孔板與孵育；e)將核酸分子上特殊標記的特異性結合物與微孔板孵育；f)對特異性結合物進行檢測分析，反映轉錄因子蛋白表達和活化水平。
以上步驟的技術思想包括三個部分，首先是準備特殊標記的核酸分子，其次是雙鏈核酸分子包被微孔板的製備，最後是運用製備的微孔板檢測轉錄因子蛋白。
準備特殊標記的核酸分子是實現本發明技術的第一步，也是非常重要的一步，關鍵問題是準備的特殊標記的核酸分子要滿足在微孔板上固定、核酸外切酶III作用、轉錄因子蛋白結合、對特殊標記便於檢測等要求。用於本發明中的特殊標記的核酸分子在結構上應滿足下列條件a)所準備的核酸分子，為兩條具有特殊結構特徵的核酸分子A和B；b)核酸分子A和B是兩條鹼基序列反向互補的核酸分子；c)核酸分子A和B退火後形成的雙鏈核酸分子上，含有轉錄因子蛋白可識別並與之結合的核苷酸序列；d)核酸分子A的3′末端依據微孔板表面的化學基團進行了相應的化學修飾，以便將其通過化學反應連接固定到微孔板表面；e)核酸分子A和B退火後，B的3′末端與A的5′末端平齊或B的3′末端凹進，以便外切核酸酶作用於AB複合物時，能從B的3′末端進行性降解B；f)核酸分子B的5′末端或靠近5′末端含有特殊標記耦連的核苷酸，特殊標記耦連的核苷酸數目至少為一個；g)核酸分子B所含有的特殊標記耦連的核苷酸，其特殊標記為地高辛、生物素、螢光素等可依靠其化學特性進行檢測分析的化學分子；h)核酸分子B的轉錄因子蛋白結合序列位於特殊標記耦連的核苷酸和3′末端之間；雙鏈核酸分子包被微孔板的製備，其技術思想來源於我們對雙鏈DNA微陣列晶片技術的研究和發明，以及傳統分子生物學中運用DNA包被的介質進行DNA結合蛋白親合層析分離純化的實驗技術。製備雙鏈核酸分子包被微孔板的技術關鍵是如何將雙鏈核酸分子牢固地連接固定到微孔板孔內，使固定的雙鏈核酸分子既保持與液相中轉錄因子蛋白的結合活性，又能夠經受檢測過程中頻繁的洗滌而不致脫落。
為了使固定的雙鏈核酸分子具有與液相中轉錄因子蛋白的結合活性，要求用於固定的雙鏈核酸分子具有足夠的長度，特別是雙鏈核酸分子上所嵌合的轉錄因子蛋白結合序列，要與微孔板表面間存在充分的距離，避免微孔板表面對核酸分子與蛋白質的結合反應造成空間障礙(steric hindrance)。用於與微孔板表面連接的核酸分子的一端應連接較長的手臂分子(arm，linker，spacer molecules)，如C12、PEG(Hexaethylene glycol)、等。另外微孔板表面固定的核酸分子密度(density)也要適宜，避免過密的核酸分子造成蛋白質結合的空間障礙。由於與轉錄因子蛋白發生序列特異性識別結合的DNA為雙鏈DNA，因此固定的核酸分子應在檢測的全過程中維持穩定的雙鏈狀態，避免解鏈喪失活性，為此DNA分子的兩條鏈應有足夠的GC含量和長度，以便雙鏈DNA分子有較高的Tm值，耐受檢測過程中一定溫度和鹽濃度環境而不致解鏈。
為了牢固地將雙鏈核酸分子連接固定到微孔板孔內，使其能夠經受檢測過程中頻繁的洗滌而不致脫落，製備雙鏈核酸分子包被的微孔板時，應對針對不同材質的微孔板如玻璃底微孔板(glass-bottom microplate)、聚苯乙烯微孔板(polystyrene)、聚乙烯微孔板(polyethylene)、聚丙烯微孔板(polypropylene)，聚碳酸酯微孔板(polycarbonate)等進行表面活化處理，如玻璃底微孔板的矽烷化處理、聚苯乙烯及聚乙烯微孔板的紫外線照射(ultravioletirradiation)、低能量多原子離子束照射(Low-Energy Polyatomic Ion Beams)、等離子處理(plasma treatment)、γ射線等物理、化學處理，使微孔板表面形成特定的反應基團(reactivegroups)，如氨基(amino)、醛基(aldehyde)、羧基(carboxyl)、羥基(hydroxyl)、硫醇基(thiol)、N-氧琥珀醯亞胺酯(N-oxysuccinimide esters，NOS groups)等。這些反應基團能夠和化學修飾在核酸分子末端的相應反應基團發生化學反應，形成共價鍵(covalent bond)，如希夫鹼(Schiffbase)等，將核酸分子共價連接固定(immobilizing)在微孔板孔內。除了這種共價連接外，也可以利用鏈親合素包被的微孔板(Streptavidin coated microplate)將生物素(biotinated)標記的核酸分子固定到微孔板孔內。另外通過在微孔板孔內鋪設葡聚糖(allyldextran)、瓊脂糖(agarose)、聚丙烯醯胺(polyacrylamide)、親水膠(hydrogel)薄層(monolayer，layer)等手段造就反應基團，也可以實現核酸分子的固定。
在微孔板內包被雙鏈核酸分子，可以通過多種途徑來實現。一般表現為兩種方式，一是首先將帶反應基團的一條單鏈核酸分子連接固定到微孔板表面，再通過核酸雜交復性的手段將另一條鹼基序列互補的單鏈核酸分子退火上去，形成固定的雙鏈核酸分子；二是先將兩條鹼基序列互補的單鏈核酸分子在液相中復性，形成雙鏈核酸分子，再將雙鏈核酸分子加入微孔板內固定連接。PCR產物可以在擴增後直接加入微孔板內固定連接或經純化更換溶液後再加入微孔板內固定連接。
完成微孔板內包被雙鏈核酸分子後，首先要採用適宜的洗滌措施，除去微孔板內未通過化學鍵連接到微孔板表面的物理吸附的核酸分子，如用2×SSC、0.1％的洗滌液洗滌等。在洗滌除去微孔板內未通過化學鍵連接到微孔板表面的核酸分子後，還要採用適宜的技術滅活微孔板表面剩餘的反應基團，避免它們處於活性狀態，與蛋白質分子發生化學反應，造成非特異性結合的假陽性結果，如採用NaBH4溶液滅活醛基、用牛血清白蛋白(Bovine serum albumin，BSA)及Tris溶液滅活N-氧琥珀醯亞胺酯基團等。
通過上述技術流程，則製備出了可以用於轉錄因子蛋白檢測的雙鏈核酸分子包被的微孔板。微孔板包被的質量決定了微孔板檢測轉錄因子蛋白的可靠性。因此製備高質量雙鏈核酸分子包被的微孔板是實現本發明轉錄因子蛋白檢測功能的關鍵所在。
製備了雙鏈核酸分子包被的微孔板為本發明轉錄因子蛋白的檢測提供了工具。利用這種雙鏈核酸分子包被的微孔板檢測轉錄因子蛋白，首先要將含有轉錄因子蛋白的細胞或組織抽提物(cell or tissue extracts)，一般為細胞核抽提物(nuclear extracts)，與特定化學物質配方的DNA結合緩衝液(DNA binding buffer)混合，在微孔板外孵育適當時間，再將孵育物加入雙鏈核酸分子包被的微孔板內，在適宜溫度下繼續孵育適當時間，使抽提物中的轉錄因子蛋白與包被到微孔板表面雙鏈核酸分子結合，形成「核酸/蛋白質」複合物(complex)。需要強調的是，此步反應中，應在DNA結合緩衝液中加入適量的非競爭性DNA(noncompetitiveDNA)，如鮭魚精DNA(salmon sperm DNA)、鯡魚精DNA(herring sperm DNA)、擔體DNA[poly(dI-dC)、poly(dA-dT)]等，先將「非競爭性DNA/抽提物/結合緩衝液」系統在微孔板外孵育適當時間，才可以加入雙鏈核酸分子包被的微孔板，以防形成非特異性結合。另外，在細胞或組織抽提物與微孔板孵育前，可先用封閉劑對微孔板進行封閉處理，如BSA、脫脂奶粉、Denhardt試劑、BLOTTO試劑、商業化Blocking試劑等，以防形成非特異性結合和增高背景。轉錄因子蛋白與雙鏈核酸分子包被的微孔板的特異性反應，可以通過向結合體系中摻入過量的冷探針DNA觀察其對信號的影響加以評判。含有轉錄因子蛋白的細胞或組織抽提物與雙鏈核酸分子包被的微孔板反應後，除去反應液，再用適宜的洗滌液洗滌微孔板，如含有微量非離子去汙劑Tween 20、Triton X-100的馬萊酸緩衝液(maleate buffer)、磷酸緩衝鹽溶液(phosphate buffered saline，PBS)，以除去非特異性結合的蛋白質。
含有轉錄因子蛋白的細胞或組織抽提物與雙鏈核酸分子包被的微孔板孵育反應並充分洗滌後，將核酸外切酶III反應液加入微孔板孵育一定時間，使核酸外切酶III與微孔板中的DNA發生酶切反應；酶切反應結束後，除去酶切反應液，再用適宜的洗滌液洗滌微孔板，如含有微量非離子去汙劑Tween20、Triton X-100的馬萊酸緩衝液(maleate buffer)、磷酸緩衝鹽溶液(phosphate buffered saline，PBS)，以除去非特異性吸附的酶等。
核酸外切酶III在微孔板中的酶切反應有兩種情況，當微孔板中的DNA與轉錄因子蛋白形成「DNA/轉錄因子蛋白」複合物時，則當核酸外切酶III消化至轉錄因子蛋白覆蓋的DNA附近時，由於轉錄因子蛋白形成的空間障礙，核酸外切酶III不能繼續前進，則位於被消化鏈(核酸分子B)5′端或附近的特殊標記耦連的核苷酸不能被酶切釋放入反應溶液中，即成為游離的單核苷酸；而當微孔板中的DNA未與轉錄因子蛋白形成「DNA/轉錄因子蛋白」複合物時，則核酸外切酶III的消化可到達被消化鏈(核酸分子B)5′端或附近的特殊標記耦連的核苷酸，特殊標記耦連的核苷酸則被酶切釋放入反應溶液中，成為游離的單核苷酸。酶切反應結束後，從微孔板除去轉錄因子蛋白抗體包括能與待檢轉錄因子蛋白發生特異性結合的單抗、雙抗及肽段，一般最好為單克隆抗體，以保證檢測的特異性。轉錄因子蛋白抗體與微孔板孵育反應後，除去核酸外切酶III反應液並洗滌微孔板，那些被核酸外切酶III酶切釋放入反應溶液中的游離的單核苷酸則從微孔板被清除。在被檢測分析的細胞或組織抽提物中轉錄因子蛋白的含量越高、活性越好，則在細胞或組織抽提物與微孔板孵育時，形成的「DNA/轉錄因子蛋白」複合物越多，相應保留在微孔板上的受轉錄因子蛋白保護而不被核酸外切酶III酶切的特殊標記耦連的核苷酸則越多，後續反應中針對特殊標記的檢測信號則越強，使轉錄因子蛋白與特殊標記的檢測信號間存在數量依存關係。
核酸外切酶III反應結束並充分洗滌後，將針對核酸分子上特殊標記的特異性結合物加入微孔板孵育一定時間，使特異性結合物與核酸分子上的特殊標記發生特異性結合，形成「特殊標記/特異性結合物」複合物。此處僅舉兩例對此步「特殊標記/特異性結合物」複合物形成加以說明若核酸分子B含有的特殊標記耦連的核苷酸，其特殊標記為地高辛(digoxigenin，DIG)，則加入微孔板孵育的特異性結合物為地高辛抗體；若核酸分子B含有的特殊標記耦連的核苷酸，其特殊標記為生物素(biotin)，則加入微孔板孵育的特異性結合物可為生物素抗體、親合素(avidin)、鏈親合素(streptavidin)。
為便於檢測分析，加入微孔板孵育的特異性結合物，可對其進行化學修飾、標記等處理，包括放射性同位素標記、螢光染料標記、鹼性磷酸酶(Alkaline Phosphatase，AP)、過氧化物酶(Peroxidase)等酶標、膠體金(gold)等金屬顆粒標記等。一般情況下，為降低實驗成本和提高檢測的靈敏性，特異性結合物的標記最好是鹼性磷酸酶、過氧化物酶等酶標。
微孔板中核酸分子B上的特殊標記與其特異性結合物發生特異性結合反應後，依據特異性結合物所攜帶的化學修飾或標記的物理或化學性質進行下一步檢測分析。此處僅舉四例對此步反應加以說明若特異性結合物用放射性同位素標記，如3H、125I、32P等同位素，則加入特異性結合物孵育適當時間後洗板，再對微孔板進行γ射線儀、液閃儀等測定；若特異性結合物用螢光素標記，如FITC、Cy3、Cy5等，則加入特異性結合物孵育適當時間後洗板，再對微孔板進行螢光測定；若特異性結合物用膠體金(gold)等金屬顆粒標記，則加入特異性結合物孵育適當時間後洗板，再對微孔板進行分光光度測定。一般情況下，特異性結合物標記為鹼性磷酸酶、過氧化物酶等酶標，此種情況下，加入特異性結合物孵育適當時間後洗板，再加入酶反應底物(developing substrate，developing solution)，採用化學生色(colorimetric)或發光(chemiluminescent)等技術進行信號檢測。化學生色試劑如BCIP(5-bromo-4-chloro-3-indolylphosphate)、BCIP/INT[2-(4-iodophenyl)-5-(4-nitrophenyl)-3-phenyltetrazolium chloride]、BCIP/NBT、BCIP/TNBT(5-bromo-4-chloro-3-indoxyl phosphate/tetranitroblue tetrazolium)、NBT(4-Nitroblue tetrazolium chloride)、pNPP(p-Nitrophenyl phosphate)、ABTS(2，2′-AZINO-bis[3-ethylbenziazoline-6-sulfonic acid])、Fast RED、TMB(3，3′，5，5′-tetramethylbenzidine)等，化學發光試劑如CDP-Star、CSPD、LumiGLO、POD、AttoPhos等。根據反應性質，選擇相應的檢測儀器，如化學生色標記可以採用酶標儀(如SUNRISE酶標儀)進行檢測分析，化學發光標記可以採用帶化學發光檢測功能的凝膠成相系統等進行檢測分析。
(3)、技術效果轉錄因子蛋白因負責基因表達的調控成為目前基因組和蛋白組研究所重視的一類重要蛋白質，而且許多疾病與轉錄因子異常表達及活化間存在的密的關係，引起了生物醫藥領域對轉錄因子研究的關注，轉錄因子已經成為轉錄治療和藥物研究的重要靶點。在這些背景下，有關轉錄因子功能檢測及分析的技術研究受到科學界的重視。多種基於DNA/蛋白質相互作用這一層次的轉錄因子檢測分析技術得到發展，如電泳遷移率變動分析。這一技術及相關的改進技術目前雖然有效地用於轉錄因子的檢測分析，但它們存在放射性標記對實驗人員及環境危害的缺陷、對實驗樣品數量需求大、實驗耗時長、分析效率低及難以高通量化獲取生物等缺陷。為了建立從技術思想角度上完全不同於凝膠遷移實驗的轉錄因子表達及活化檢測及分析技術，我們已經進行了諸多相關研究，並發展了一些新的技術。其中，最重要的是利用基因晶片技術的策略，將含有轉錄因子蛋白結合位點的雙鏈DNA固定到固相載體如玻片表面，製備雙鏈DNA微陣列晶片，用於轉錄因子表達及活化的檢測及分析(中國專利ZL02112780.8，02137945.9，03152881.3，03132206.9)，並將這些技術用於從複雜組分物質如中藥和組合化學混合物中高通量篩選、捕獲和分離目標分子(中國專利03152882.1)。
但我們注意到這些技術目前的推廣應用仍然面臨很大的困難，特別是價值昂貴的晶片製備和信號獲取設備，極大地限制了雙鏈DNA微陣列晶片技術的商業化。因此，我們採用本發明提出的技術對雙鏈DNA微陣列晶片技術進行改進，即將DNA固相化技術與核酸外切酶III及微孔板實驗技術結合在一起，提出了「核酸外切酶III消化微孔板包被特殊標記雙鏈核酸分子檢測轉錄因子蛋白」的技術。這一技術將雙鏈DNA微陣列晶片技術中的DNA固定介質有玻片改為常用於進行酶聯免疫吸附實驗的微孔板，檢測儀器自然由昂貴的基因晶片掃描裝置改變為成本低廉的酶標儀等。這一改進，保持了雙鏈DNA微陣列晶片技術的高通量分析功能，但極大地降低了製備和使用成本，能夠很好地解決我們建立的雙鏈DNA微陣列晶片技術的應用化問題。
本發明提供了一種製備和使用成本較低的檢測轉錄因子表達和活化水平的新方法，便於在普通設備條件下製備雙鏈核酸分子包被微孔板，依靠用於傳統酶聯免疫吸附實驗的酶標儀、洗板機等低價設備，運用成熟的酶聯免疫吸附實驗技術流程實現轉錄因子表達和活化水平的高通量檢測分析。我們的研究及產品研發實驗說明，在普通實驗設備條件下，使用較小的資金消耗，就可以實現雙鏈核酸分子包被微孔板、轉錄因子蛋白及抗體的製備等重要生產，出產出可投入到科研、醫療等產品應用場所所能夠使用的雙鏈核酸分子包被微孔板試劑盒。質量檢測和分析表明，雙鏈核酸分子包被微孔板試劑盒可穩定可靠地用於在短時間內實現對轉錄因子蛋白的表達、活化及其與DNA相互作用的檢測分析。因此，該技術將為分子生物學、功能基因組學、蛋白質組學等領域中的轉錄因子的相關研究提供一種新的實驗技術，促進這些領域中轉錄因子相關的科學研究。
需要特別說明的是，本發明技術生產的雙鏈核酸分子包被微孔板試劑盒，將在臨床輔助診斷和生物醫學中針對轉錄因子的藥物篩選研究具有非常重要的應用價值。例如，轉錄因子p53、NF-kB的表達及活化異常，在許多疾病中發揮的重要作用，因此成為臨床診斷中觀測的重要靶點，同時也是轉錄治療和藥物篩選重要靶點。我們目前已經著手申報該產品的藥證及建立系統的轉錄治療藥物篩選體系，促進產品的商業化應用。
四
圖1雙鏈核酸分子包被的微孔板示意2核酸外切酶III消化微孔板包被特殊標記雙鏈核酸分子檢測轉錄因子實驗流程圖例a註解PBS蛋白質結合位點(Protein Binding Site)DIG地高辛(digoxigenin)PB蛋白質結合(Protein Binding)EB核酸外切酶III結合(exonucleaseIII Binding)ED核酸外切酶III降解(exonucleaseIII degrading)W洗滌(washing)ADAB鹼性磷酸酶標記的DIG抗體結合(AP-coupled DIG antibody binding)DS發展溶液(developing solution)S掃描(Scanning)圖3核酸外切酶III消化微孔板包被特殊標記雙鏈核酸分子檢測轉錄因子實驗流程圖例b註解PBS蛋白質結合位點(Protein Binding Site)BIO生物素(biotin)PB蛋白質結合(Protein Binding)EB核酸外切酶III結合(exonucleaseIII Binding)ED核酸外切酶III降解(exonucleaseIII degrading)W洗滌(washing)ASB鹼性磷酸酶標記的鏈親合素結合(AP-coupled streptavidin binding)DS發展溶液(developing solution)S掃描(Scanning)圖4核酸外切酶III消化微孔板包被特殊標記雙鏈核酸分子檢測轉錄因子結果示例圖註解行A不加轉錄因子p50、核酸外切酶III不處理的BluePhos生色檢測結果行B不加轉錄因子p50、核酸外切酶III處理的BluePhos生色檢測結果行C-D加不同量轉錄因子p50、核酸外切酶III處理的BluePhos生色檢測結果該示例圖為本說明書第五項具體實施方式
中3的實驗結果。
五具體實施例方式
此處僅以製備DIG標記的雙鏈核酸分子包被微孔板及檢測轉錄因子蛋白NF-κB的實驗，示例說明本發明專利的具體實施方式
。
1、雙鏈核酸分子的設計及化學合成NF-κB(Nuclear Factor kappaB)是一類序列特異性轉錄因子，當細胞受到炎症介質、病毒感染、氧化應激等多種物質刺激後，NF-κB在胞質內被激活，進入細胞核與病毒、細胞因子、生長因子、細胞粘附分子、急性相反應蛋白、酶等基因增強子序列結合，增強基因轉錄；因而在一系列由細胞因子、炎症介質及蛋白酶類參與的疾病的發病過程中發揮重要作用。大量研究表明NF-κB過度活化與炎症、血管疾病、腫瘤、病毒感染、腦血管疾病、阿爾茨海默病、帕金森氏病、過敏性腦炎、感染性休克、風溼性關節炎、支氣管哮喘、動脈粥樣硬化、潰瘍性結腸炎等病理過程存在非常密切的關係。目前，NF-κB已成為新藥開發的重要靶點，許多生物和生化抑制劑能夠阻斷NF-κB信號通路或抑制NF-κB/DNA結合，從而有助於NF-κB相關疾病的治療。
NF-κB是由RelA/p65、RelB、c-Rel、NF-κB1/p50和NF-κB2/p52五種蛋白構成的一個蛋白家族，五種蛋白間可以形成同二聚體(homodimer)或異二聚體(heterodimer)，與基因組DNA中的共同基序(consensus)DNA序列發生序列特異性識別結合，調控今音的表達。基因組中與NF-κB結合的共同基序DNA序列表達一般為5′-GGGACTTTCC-3′。因此，設計和製備用於檢測轉錄因子NF-κB的雙鏈核酸分子包被微孔板時，所準備的雙鏈核酸分子上必須含有NF-κB結合的共同基序DNA序列，此處我們使用最常見的5′-GGGACTTTCC-3′位點。
我們設計並由中國上海博亞生物技術有限公司(BIOASIA Biologic Technology Co.LTD.，Shanghai，China)合成如下兩條鹼基序列反向互補的寡核苷酸，用於包被微孔板TFexoDE-15′...TGCGATTAGAACTGGGGACTTTCCCAGCGATTGACTGAGTGGTCGTCGGCGTGTGCTTTT-NH2...3′TFexoDE-1c3′...ACGCTAATCTTGACCCCTGAAAGGGTCGCTAACTGACTCACCAG CAGCCGCACACG...5′(TdT-DIG-labeled)將寡核苷酸TFexoDE-1以100uM濃度溶解在寡核苷酸結合緩衝液(50mM Na3PO4，pH8.5，1mM EDTA)中，將寡核苷酸TFexoDE-1c以50nM濃度溶解在標準雜交液(5×SSC，0.02％SDS，0.1％N-lauroylsarcosine，1×blocking solution，其中blocking solution為Roche產品)中。
2、雙鏈核酸分子包被微孔板的製備我們選用Coming Costar公司生產的DNA-BINDTM透明聚苯乙烯96微孔板(DNA-BINDTMclear96 well polystyrene microplate，Cat.No.2505，Coming Costar)來製備雙鏈核酸分子包被的微孔板。該類聚苯乙烯96微孔板表面已經包備了一層反應性N-氧琥珀醯亞胺酯(N-oxysuccinimide esters，NOS groups)基團，即NOS基團。NOS基團被共價連接在聚苯乙烯微孔板表面，可與α-氨基(primary amino)等親核基團發生反應，從而將氨基末端修飾的DNA分子共價連接到聚苯乙烯微孔板表面。其反應程式如下具體操作中，將100μM濃度溶解在寡核苷酸結合緩衝液中的寡核苷酸TFexoDE-1再用寡核苷酸結合緩衝液稀釋到DNA濃度為1pmol/ul，再將稀釋後的DNA溶液以每孔100μl的體積加入DNA-BINDTM聚苯乙烯96微孔板中。將微孔板在4℃冰箱孵育過夜。
次日從4℃冰箱中取出微孔板，吸去DNA溶液，用馬萊酸緩衝液(100mM maleate，150mMNaCl，pH7.5)洗滌微孔板3次，除去未藕聯(coupled)的DNA。
向微孔板中加入200μl含有3％BSA的寡核苷酸結合緩衝液，37℃孵育30分鐘，再吸乾溶液。該步處理的目的在於封閉微孔板表面未反應的活性基團。
微孔板封閉處理後，每孔內加入100μl溶解在標準雜交液中的寡核苷酸TFexoDE-1c，65℃孵育60分鐘。吸乾雜交液，用56℃預熱的2×SSC，0.1％SDS溶液洗滌微孔板兩次，並浸泡5分鐘，吸乾溶液。
至此，則製備好了可用於檢測轉錄因子NF-κB的雙鏈核酸分子包被微孔板。包被好的微孔板應密閉保存在4℃冰箱。
3、用雙鏈核酸分子包被微孔板檢測轉錄因子NF-κB(純蛋白)向上面製備的雙鏈核酸分子包被微孔板中加入200μl 1×blocking溶液(Cat.No.1096176，Roche)。37℃孵育30分鐘，再吸乾溶液。
將轉錄因子NF-κB蛋白[rhNF-κB(p50)，E3770，Promega)]以不同的濃度稀釋在DNA結合緩衝液(10mM HEPES pH7.9，50mM KCl，2.5mM DTT，0.1mM EDTA，0.05％NP-40，10％Glycerol，5％fetal bovine serum)中，37℃孵育10分鐘後，以每孔100μl的體積加入雙鏈核酸分子包被微孔板中，37℃繼續孵育50分鐘。吸乾DNA結合緩衝液，用含0.3％Tween 20的馬萊酸緩衝液洗滌微孔板2次，每次10分鐘。
將核酸外切酶III(Fermentas Life Science)反應液(1U/μl ExonucleaseIII，66mM Tris-HCl，pH8.0 at 30℃，0.66mM MgCl2)以每孔100ul的體積加入微孔板中，37℃孵育10分鐘。吸乾核酸外切酶III反應液，用含0.3％Tween20的馬萊酸緩衝液洗滌微孔板2次，每次10分鐘。
將鹼性磷酸酶標記的DIG抗體(Anti-Digoxigenin-AP，Fab fragments，Cat.No.1093274，Roche)以1∶10000的濃度稀釋在1×blocking溶液(Cat.No.1096176，Roche)中，以每孔100μl的體積加入核酸外切酶III處理的微孔板中，37℃孵育30分鐘。吸乾抗體溶液，用含0.3％Tween20的馬萊酸緩衝液洗滌微孔板2次，每次10分鐘。
將鹼性磷酸酶化學生色底物(BluePhosMicrowell Phosphatase Substrate System，Cat.No.50-88-00，KPL)室溫預熱(SolutionA，SolutionB)，按實驗所需量等量混合SolutionA和SolutionB，混勻後以每孔100μl的體積加入二抗結合過的微孔板中，室溫孵育適宜時間。加入100μl2.5％的EDTA溶液，終止顯色反應。
將終止顯色反應的微孔板置入SUNRISE酶標儀(TECAN)，在602nm波長下讀取吸光值。依據蛋白梯度和吸光值製作標準曲線。
4、用雙鏈核酸分子包被微孔板檢測轉錄因子NF-κB(核抽提物)向上面製備的雙鏈核酸分子包被微孔板中加入200μl 1×blocking溶液(Cat.No.1096176，Roche)。37℃孵育30分鐘，再吸乾溶液。
將5-10μg含有轉錄因子NF-κB蛋白的核抽提物(HeLa Nuclear Extract，TNF-α-stimulated，20min)稀釋在DNA結合緩衝液[10mM HEPES pH7.9，50mM KCl，2.5mM DTT，0.1mM EDTA，0.05％NP-40，10％Glycerol，5％fetal bovine serum，0.05mg/ml poly(dI-dC)]中，37℃孵育10分鐘後，以每孔100μl的體積加入雙鏈核酸分子包被微孔板中，37℃繼續孵育50分鐘。吸乾DNA結合緩衝液，用含0.3％Tween20的馬萊酸緩衝液洗滌微孔板2次，每次10分鐘。
將核酸外切酶III(Fermentas Life Science)反應液(1U/μl Exonuclease III，66mM Tris-HCl，pH8.0 at 30℃，0.66mM MgCl2)以每孔100μl的體積加入微孔板中，37℃孵育10分鐘。吸乾核酸外切酶III反應液，用含0.3％Tween 20的馬萊酸緩衝液洗滌微孔板2次，每次10分鐘。
將鹼性磷酸酶標記的DIG抗體(Anti-Digoxigenin-AP，Fab fragments，Cat.No.1093274，Roche)以1∶10000的濃度稀釋在1×blocking溶液(Cat.No.1096176，Roche)中，以每孔100μl的體積加入核酸外切酶III處理的微孔板中，37℃孵育30分鐘。吸乾抗體溶液，用含0.3％Tween20的馬萊酸緩衝液洗滌微孔板2次，每次10分鐘。
將鹼性磷酸酶化學生色底物(BluePhosMicrowell Phosphatase Substrate System，Cat.No.50-88-00，KPL)室溫預熱(SolutionA，SolutionB)，按實驗所需量等量混合SolutionA和SolutionB，混勻後以每孔100μl的體積加入二抗結合過的微孔板中，室溫孵育適宜時間。加入100μl2.5％的EDTA溶液，終止顯色反應。
將終止顯色反應的微孔板置入SUNRISE酶標儀(TECAN)，在602nm波長下讀取吸光值。依據蛋白標準曲線進行定量。
權利要求
1.核酸外切酶III消化包被在微孔板上的含有特殊標記的雙鏈核酸分子檢測轉錄因子蛋白，提出了一種檢測轉錄因子表達和活化水平的新方法，其特徵在於運用該方法檢測轉錄因子蛋白表達和活化水平包括如下步驟a)準備含有特殊標記的核酸分子；b)將含有特殊標記的核酸分子連接固定到微孔板孔內；c)將轉錄因子蛋白與微孔板孵育；d)將核酸外切酶III反應液與微孔板與孵育；e)將核酸分子上特殊標記的特異性結合物與微孔板孵育；f)對特異性結合物進行檢測分析，反映轉錄因子蛋白表達和活化水平。
2.根據權利要求1所述的核酸外切酶III消化包被在微孔板上的含有特殊標記的雙鏈核酸分子檢測轉錄因子蛋白，其特徵在於步驟(a)中準備的核酸分子，包括化學合成的寡核苷酸、通過聚合酶鏈式反應製備的核酸分子及來自生物基因組的核酸分子；
3.根據權利要求1所述的核酸外切酶III消化包被在微孔板上的含有特殊標記的雙鏈核酸分子檢測轉錄因子蛋白，其特徵在於步驟(a)中準備的核酸分子，為兩條具有特殊結構特徵的單鏈核酸分子A和B復性後形成的雙鏈核酸分子；
4.根據權利要求3所述的核酸分子A和B，其特徵在於核酸分子A和B是兩條鹼基序列反向互補的單鏈核酸分子；
5.根據權利要求3所述的核酸分子A和B，其特徵在於核酸分子A的3′末端依據微孔板表面的化學基團進行了相應的化學修飾，以便將核酸分子通過化學反應連接固定到微孔板表面；
6.根據權利要求3所述的核酸分子A和B，其特徵在於核酸分子A和B退火後，核酸分子B的3′末端與核酸分子A的5′末端或平齊、或凹進、或突出1到4個核苷酸，以便外切核酸酶III作用於A和B復性後形成的雙鏈核酸分子時，能從核酸分子B的3′末端降解B；
7.根據權利要求3所述的核酸分子A和B，其特徵在於在核酸分子B的5′末端或靠近5′末端含有特殊標記耦連的核苷酸；
8.根據權利要求3所述的核酸分子A和B，其特徵在於核酸分子B含有特殊標記耦連的核苷酸，特殊標記為地高辛、生物素、螢光素等可依靠其化學特性進行檢測分析的化學分子；
9.根據權利要求3所述的核酸分子A和B，其特徵在於核酸分子A和B退火後形成的雙鏈核酸分子上，含有轉錄因子蛋白可識別並與之結合的核苷酸序列；
10.根據權利要求3所述的核酸分子A和B，其特徵在於核酸分子B的轉錄因子蛋白結合序列位於特殊標記耦連的核苷酸和3′末端之間；
11.根據權利要求1所述的核酸外切酶III消化包被在微孔板上的含有特殊標記的雙鏈核酸分子檢測轉錄因子蛋白，其特徵在於步驟(b)中所用於連接固定核酸分子的微孔板，包括各種類型和材料的微孔板，並且為便於將核酸分子連接固定到微孔板孔內，對微孔板進行了物理或化學處理，使微孔板表面帶有某種化學基團；
12.根據權利要求1所述的核酸外切酶III消化包被在微孔板上的含有特殊標記的雙鏈核酸分子檢測轉錄因子蛋白，其特徵在於步驟(b)中將核酸分子連接固定到微孔板孔內的過程，是核酸分子末端所修飾的化學基團與微孔板表面修飾的化學基團間發生化學反應，從而將核酸分子牢固地固定到微孔板表面的過程；
13.根據權利要求1所述的核酸外切酶III消化包被在微孔板上的含有特殊標記的雙鏈核酸分子檢測轉錄因子蛋白，其特徵在於步驟(c)中與微孔板孵育的轉錄因子蛋白，為各種來源的轉錄因子蛋白，包括人工表達製備的轉錄因子蛋白、從細胞或組織裂解物中分離純化的轉錄因子蛋白、含有轉錄因子蛋白的細胞或組織抽提物；
14.根據權利要求1所述的核酸外切酶III消化包被在微孔板上的含有特殊標記的雙鏈核酸分子檢測轉錄因子蛋白，其特徵在於步驟(c)中轉錄因子蛋白與微孔板的孵育，是轉錄因子蛋白與微孔板表面固定的核酸分子間特異性識別並結合的過程；
15.根據權利要求1所述的核酸外切酶III消化包被在微孔板上的含有特殊標記的雙鏈核酸分子檢測轉錄因子蛋白，其特徵在於步驟(d)中核酸外切酶III反應液與微孔板的孵育，是將含有核酸外切酶III的反應溶液加入微孔板內，使核酸外切酶III對微孔板上包被的核酸分子產生酶切反應的過程；
16.根據權利要求1所述的核酸外切酶III消化包被在微孔板上的含有特殊標記的雙鏈核酸分子檢測轉錄因子蛋白，其特徵在於步驟(e)中核酸分子上特殊標記的特異性結合物，是依靠其特殊的化學性質，可與核酸分子上特殊標記發生特異性結合反應的化學物質，包括抗體、親合素、鏈親合素等化學物質；
17.根據權利要求1所述的核酸外切酶III消化包被在微孔板上的含有特殊標記的雙鏈核酸分子檢測轉錄因子蛋白，其特徵在於步驟(e)中核酸分子上特殊標記的特異性結合物，為便於對其檢測分析，可進行化學修飾、標記等處理，包括放射性同位素標記、螢光染料標記、鹼性磷酸酶、過氧化物酶等酶標、膠體金等金屬顆粒標記；
18.根據權利要求1所述的核酸外切酶III消化包被在微孔板上的含有特殊標記的雙鏈核酸分子檢測轉錄因子蛋白，其特徵在於步驟(e)中核酸分子上特殊標記的特異性結合物與微孔板孵育，是特異性結合物與微孔板表面核酸分子上的特殊標記間發生特異性識別並結合的過程；
19.根據權利要求1所述的核酸外切酶III消化包被在微孔板上的含有特殊標記的雙鏈核酸分子檢測轉錄因子蛋白，其特徵在於步驟(f)中對特異性結合物的檢測分析，是依據特異性結合物本身的物理或化學性質直接對其進行檢測分析，或依據特異性結合物的化學修飾及標記的物理或化學性質進行檢測分析；特異性結合物的檢測分析結果間接地反映轉錄因子蛋白表達和活化水平。
全文摘要
轉錄因子是一類負責基因表達調控的重要蛋白質，是基因表達調控通路及網絡的樞紐，是功能基因組和蛋白質組研究的重要對象，也是轉錄治療和藥物研究的重要靶點。本專利提出了一種檢測轉錄因子表達和活化水平的新方法「核酸外切酶III消化微孔板包被特殊標記雙鏈核酸分子檢測轉錄因子蛋白」。運用該方法分析轉錄因子表達和活化水平包括如下步驟(a)準備核酸分子；(b)核酸分子連接固定到微孔板孔內；(c)含轉錄因子細胞或組織抽提物與微孔板孵育；(d)核酸外切酶III反應液與微孔板與孵育；(e)核酸分子上特殊標記的特異性結合物與微孔板孵育；(f)對特異性結合物進行檢測分析，反映轉錄因子蛋白表達和活化水平。
文檔編號C12Q1/68GK1721547SQ20041004140
公開日2006年1月18日 申請日期2004年7月16日 優先權日2004年7月16日
發明者王進科 申請人:王進科, 南京新益華集團有限公司