SmCPS4蛋白及其編碼基因與應用的製作方法

2023-05-15 07:05:51 2

SmCPS4蛋白及其編碼基因與應用的製作方法
【專利摘要】本發明公開了一種SmCPS4蛋白及其編碼基因與應用。本發明公開的一種蛋白，為如下（1）或（2）所示：（1）SEQ?ID?No.3所示的蛋白；（2）將SEQ?ID?No.3所示的胺基酸序列經過一個或幾個胺基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且功能相同的蛋白質。本發明公開的SmCPS4基因與丹參中另一個SmKSL2基因聯合，介導催化形成丹參中一種新的半日花烷型二萜類化合物13-epi-manoyl?oxide，這兩個基因是首次發現的植物中能催化形成13-epi-manoyl?oxide結構類型的二萜合酶基因，該合成途徑的解析為利用合成生物學生產類似化合物，深入研究此類化合物的藥理作用提供了重要的基礎。
【專利說明】SmCPS4蛋白及其編碼基因與應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種SmCPS4蛋白及其編碼基因與應用。
【背景技術】
[0002]藥用植物丹參(Salvia miltiorrhiza Bge.)為一味常用中藥，素有「一味丹參，功同四物」的美稱，具有活血化瘀，理氣止痛的功效，是眾多複方、保健品的主要成分。其中脂溶性的松香烷型丹參酮類化合物為丹參中主要的二萜類化合物。二萜合酶基因是形成二萜類化合物的關鍵酶基因(Trapp SC, Croteau R.Genomic Organization of Plant TerpeneSynthases and Molecular Evolutionary Implications.Genetics, 2001，158:811 - 832)。在雙子葉植物中，二職類化合物大多通過兩類二職合酶:CPS (copalyl pyrophosphatesynthase)和KSL (kaurene-like synthase)連續催化來完成從直鏈前體物牛兒基物牛兒基焦磷酸(geranylgeranyl pyrophosphate, GGPP)到二職母核的環化。通過基因組序列分析(Ma, Y.M., Yuan, L.C., Wu, B., Li, X.E., Chen, S.L., and Lu.S.F.(2012).Genome-w1.de identification and characterization of novel genes involved in terpenoid biosynthesis in Salvia miltiorrhiza.J.Exp.Bot.63:2809-2823.)發現丹參基因組內存在5個CPS和2個KSL基因。其中SmCPSl和SmKSLl已被證實為參與丹參酮生物合成的關鍵酶基因(Gao, ff., Hillwig, M.L., Huang, L.Q., Cui, G.H., Wang, X.Y., Kong, J.Q., Yang,B., Peters, R.J.(2009).A functional genomics approach to tanshinonebiosynthesis provides stereochemical insights.0rg.lett.11:5170-5173.X在菊科植物 Grindelia robusta 中發現的 GrTPSl 和 GrTPS6 能催化 GGPP 形成 manoyl oxide(Zerbe,P., Hamberger, B., Yuen, Μ., Chiang, A., Sandhu, H., Madilao, L., Nguyen, A., Hamberger, B.,Bach, S.S., and Bohlmann, J.(2013).Gene Discovery of Modular Diterpene Metabolismin Nonmodel Systems.Plant Physiol.162:1073 - 1091.)。

【發明內容】

[0003]本發明的目的是提供一種SmCPS4蛋白及其編碼基因與應用。
[0004]本發明提供的一種蛋白，為如下(I)或(2)所示:
[0005](I) SEQ ID N0.3 所示的蛋白；
[0006](2)將SEQ ID N0.3所示的胺基酸序列經過一個或幾個胺基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且功能相同的蛋白質。
[0007]上述蛋白的編碼基因也屬於本發明的保護範圍。
[0008]上述編碼基因中，所述編碼基因為如下中至少一種:
[0009]I) SEQ ID N0.1 所示的 DNA 分子；
[0010]2)在嚴格條件下與I)限定的DNA分子雜交且編碼所述蛋白質的DNA分子；
[0011]3)與I)或2)限定的DNA分子具有90%以上的同一性且編碼所述蛋白質的DNA分子。[0012]含有上述任一所述編碼基因的重組載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌也屬於本發明的保護範圍。
[0013]一種蛋白組合物也屬於本發明的保護範圍，由上述蛋白和SEQ ID N0.4所示的蛋白組成。
[0014]上述蛋白在合成(13E)_8 α-hydroxylabden-15-yl diphosphate 中的應用也屬於本發明的保護範圍。
[0015]上述蛋白在催化物牛兒基物牛兒基焦磷酸合成(13Ε)-8 α-hydroxylabden-15-yldiphosphate中的應用也屬於本發明的保護範圍。
[0016](13E) -8 a -hydroxy labden-15-y I diphosphate 的化學結構式如圖 6 中的 LDPP所
/Jn ο
[0017]上述蛋白組合物在合成13-ep1-manoyl oxide中的應用也屬於本發明的保護範圍。
[0018]上述蛋白組合物在催化物牛兒基物牛兒基焦磷酸合成13-ep1-manoyl oxide中的應用也屬於本發明的保護範圍。
[0019]上述蛋白或上述蛋白組合物在丹參中合成13-ep1-manoyl oxide中的應用也屬於本發明的保護範圍。
[0020]13-ep1-manoyl oxide的化學結構式如圖6中所不。
[0021]本發明提供的SmCPS`4基因是丹參地上部分特別是花萼特異表達的基因，其與丹參中另一個SmKSL2基因聯合，介導催化形成丹參中一種新的半日花烷型二萜類化合物13-ep1-manoyl oxide,這兩個基因是首次發現的植物中能催化形成13-ep1-manoyl oxide結構類型的二職合酶基因，13-ep1-manoyl oxide的該合成途徑的解析為利用合成生物學生產類似化合物，深入研究此類化合物的藥理作用提供了重要的基礎。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0022]圖1為SmCPS4和SmKSL2與其他已知功能二萜合酶基因的分子進化樹。
[0023]圖2為丹參SmCPS4和SmKSL2基因的表達。
[0024]圖3為丹參SmCPS4重組蛋白的純化。
[0025]圖4為丹參SmCPS4重組蛋白的酶促反應結果。
[0026]圖5為丹參SmCPS4和SmKSL2重組蛋白的酶促反應和植株中13-印1-manoyloxide化合物的檢測。
[0027]圖6為SmCPS4和SmKSL2聯合催化GGPP產生13_印1-manoyl oxide的反應過程。【具體實施方式】
[0028]下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。
[0029]下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。
[0030]丹參(Salvia miltiorrhiza)在文獻「崔光紅,王學勇，馮華,趙靜雪,黃貓琦.丹參乙醯CoA醯基轉移酶基因全長克隆和SNP分析.藥學學報，2010，45 (6): 785-790)」中公開過，公眾可從中國科學院植物研究所獲得。
[0031]SMART? RACE cDNA Amplification Kit 購自 Clontech 公司。[0032]pMD19-T 載體購自 Takara 公司。
[0033]LA Taq 購自 Takara 公司。
[0034]Labdenediol購自雲南西力生物技術有限公司，產品目錄號為BBP02205，CAS號為10267-31-9。
[0035]N-Methyl-N- (trimethylsilyl) trif luoroacetamide (MSTFA)購自 sigma 公司，產品目錄號為394866，CAS號為24589-78-4。
[0036]吡啶購自sigma公司，產品目錄號為437611，CAS號為110-86-1。
[0037]實施例1、丹參SmCPS4和SmKSL2全長cDNA序列的克隆
[0038]基因組序列分析顯示，丹參的SmCPS4和SmKSL23 』端均為完整序列(Ma, Y.M., Yuan, L.C., Wu, B., Li, X.E., Chen, S.L., and Lu.S.F.(2012).Genome-wideidentification and characterization of novel genes involved in terpenoidbiosynthesis in Salvia miltiorrhiza.J.Exp.Bot.63:2809-2823.),需要克隆 5』端形成完整 cDNA 序列。採用 SMART? RACE cDNA Amplification Kit 擴增 SmCPS4 和 SmKSL2 的 5』末端，按照說明書進行操作。
[0039]一、設計併合成如下引物
[0040]CPS4-GSP1:5』 -CCAAGCTGAAGAGCAGTGATGTGGGCTC-3』
[0041]KSL2-GSP1:5，-TTCCTGCCATGCTTGATTATGCCAGAGG-3，。
[0042]二、Trizol 法提取丹參的總 RNA，利用 SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit 試劑盒中引物5』 -Q)S primer進行反轉錄得到cDNA。
[0043]以反轉錄得到的cDNA為模板，以UPM和CPS4-GSPI為引物進行PCR擴增，得到SmCPS4基因的cDNA5』末端，目的產物為808bp，該序列包含SmCPS4基因的5』末端完整序列。
[0044]以反轉錄得到的cDNA為模板，以UPM和KSL2-GSPI為引物進行PCR擴增，得到SmKSL2基因的cDNA5』末端，目的產物為705bp，該序列包含SmKSL2基因的5』末端完整序列。
[0045]5，-CDS primer 和 UPM 引物為 SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit 自帶。
[0046]PCR 程序:94°C預變性 5min ；94V 30s，68°C 30s，72°C 3min，35 個循環；72°C延伸5min。
[0047]三、使用LA Taq採用LA-PCR方法，進行如下反應:
[0048]Trizol 法提取丹參的總 RNA，以 SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit試劑盒中引物5』 -CDS primer進行反轉錄得到cDNA為模板，CPS4F和CPS4R為引物進行PCR擴增，得到SmCPS4基因的全長cDNA序列(如SEQ ID N0.1所示)。
[0049]Trizol 法提取丹參的總 RNA，以 SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit試劑盒中引物5』 -CDS primer進行反轉錄得到cDNA為模板，KSL2F和KSL2R為引物進行PCR擴增，得到SmKSL2基因的全長cDNA序列(如SEQ ID N0.2所示)。
[0050]引物如下:
[0051]CPS4F:5』 ~GCGATATCATGTCATTTGCGTCCAACGC~3J ；
[0052]CPS4R: 5』 -TGCGGCCGCCTAGACTATTTTTTCAAACAATAC-3』。
[0053]KSL2F:5』 -GCGATATCATGGCGCTTCC TCTCTCCACTTG-3』 ；[0054]KSL2R: 5』 -GGAAAGCGGCCGCTCAACCATGAAGCTTTGATAATCC-3』。
[0055](下劃線所示序列為酶切識別位點)
[0056]PCR 程序:94°C預變性 5min ；94°C 30s，55。。30s，72。。3min，35 個循環；72°C延伸5min。
[0057]四、將SmCPS4基因的全長cDNA序列和SmKSL2基因的全長cDNA序列分別插入PMD19-T載體中得到重組質粒pMD19T-SmCPS4和pMD19T_SmKSL2，將重組質粒進行雙向測序，並用於原核表達載體的構建。
[0058]五、SmCPS4和 SmKSL2
[0059]SmCPS4基因(SEQ ID N0.1所示)，編碼776個胺基酸殘基(如SEQ ID N0.3所示)。
[0060]SmKSL2基因(SEQ ID N0.2所示)，編碼807個胺基酸殘基(如SEQ ID N0.4所示)。[0061 ] 實施例2、SmCPS4和SmKSL2的基因表達譜
[0062]為進一步探索SmCPS4和SmKSL2的功能，利用半定量RT-PCR對來源於丹參花期的13個組織(依次為花期的木栓層，皮層，木質部，莖，葉，小花(花瓣短於花萼)，待開放花(花瓣長於花萼，但未開放)，盛開花，花瓣，花萼，雄蕊，雌蕊，未成熟種子，編號依次為1-13)和發芽第三天的幼根(編號為14)和幼葉(編號為15)進行基因表達譜的研究。編號對應的組織示意圖如圖2A所示,半定量RT-PCR結果如圖2B所示。
[0063]利用Trizol法提取各組織的總RNA,利用反轉錄試劑盒TranscriptFirst-strand cDNA Synthesis Super Mix (購自北京全式金生物技術有限公司)反轉錄得到 cDNAo`[0064]以cDNA為模板，以CPS4-F1和CPS4-R1為引物進行PCR擴增，鑑定SmCPS4基因；
[0065]以cDNA為模板，以KSL2-F1和KSL2-R1為引物進行PCR擴增，鑑定SmKSL2基因；
[0066]同時以cDNA為模板，以actin-F和actin-R為引物進行PCR擴增，鑑定actin基因，作為內參。
[0067]引物如下:
[0068]CPS4-F1:5，-CGGCTGGCTTGGGCTACAACAATA-3，；
[0069]CPS4-R1:5』 -TCCCTGGTGACCTCCTCCTTCCCA-3』 ；
[0070]KSL2-F1:5 』 -TTAGTTTTGGAGGGCAAGAAGAGTGT-3 』 ；
[0071 ] KSL2-R1:5，-CTCCTGTTTGGTCGTTGAGAAGAATA-3，；
[0072]actin-F:5，-AGGAACCACCGATCCAGACA-3，；
[0073]actin-R: 5，-GGTGCCCTGAGGTCCTGTT-3，。
[0074]圖2B 中，CPS4 和 KSL2 分別代表 SmCPS4 和 SmKSL2。
[0075]圖2B表明，SmCPS4基因在莖、葉以及花中均有表達，特別是花萼中有強烈表達。在發芽3天的幼葉中也有明顯表達，而在幼根及花期植物根中均無表達。SmKSL2基因在不同組織中均有表達，沒有顯著的組織表達特異性。揭示SmCPS4基因為丹參地上部分特異表達的基因，其有可能具有新的功能。
[0076]實施例3、SmCPS4和和SmKSL2的功能分析
[0077]—、大腸桿菌表達載體的構建
[0078]EcoRV和 NotI 雙酶切 pMD19T_SmCPS4，得到基因片段；EcoRV和 NotI 雙酶切 pET32a( + )，得到載體大片段；將基因片段與載體大片段連接，得到重組質粒pET-SmCPS4 ；[0079]EcoRV和 NotI 雙酶切 pMD19T_SmKSL2，得到基因片段；EcoRV和 NotI 雙酶切 pET32a( + )，得到載體大片段；將基因片段與載體大片段連接，得到重組質粒pET-SmKSL2 ；
[0080]將pET-SmCPS4 和 pET_SmKSL2 送測序，結果正確。
[0081]測序結果表明，pET-SmCPS4在EcoRV和NotI酶切位點間插入了 SEQ ID N0.1所示的DNA分子；pET-SmKSL2在EcoRV和NotI酶切位點間插入了 SEQ ID N0.2所示的DNA分子。
[0082]將pET-SmCPS4和pET-SmKSL2分別導入大腸桿菌表達菌株Tuner (DE3)(購自Novagen公司)中，得到pET_SmCPS4重組菌和pET_SmKSL2重組菌。
[0083]同時用不含目的基因的pET32a ( + )空載體轉化大腸桿菌表達菌株Tuner (DE3)作為對照菌。
[0084]二、蛋白的誘導表達
[0085]挑取pET-SmCPS4重組菌、pET_SmKSL2重組菌和對照菌分別接種於2mL的LB液體培養基(含羧苄青黴素50mg/L)中，於37°C振蕩培養過夜。次日按體積比1:100稀釋加入到200mL LB液體培養基(含羧苄青黴素50mg/L)中，37°C振蕩培養至0D600為0.6時轉入16°C振搖lh，然後加入IPTG至終濃度0.5mM,繼續於16°C搖床培養10小時誘導目標蛋白表達。將菌液用1000Orpm離心5分鐘，棄上清，收集pET_SmCPS4重組菌、pET_SmKSL2重組菌和對照菌菌體。將各菌體用20mL磷酸鹽緩衝液(50mM磷酸鹽緩衝液，含有IOOmM KCl, IOmMMgCl2，體積百分含量10%甘油，2mM DTT)溶解，在冰浴條件下用超聲波處理，12000rpm,4°C離心15分鐘，分別得到SmCPS4、SmKSL2和對照上清備用。
[0086]三、重組蛋白SmCPS4的純化
[0087]在SmCPS4上清中加入咪唑至終濃度為20mM。上清液使用0.45 μ m濾膜過濾。濾液經 HisTrap HP (ImL)純化柱(購自 GE Healthcare 公司)，用 12mL Washing buffer(50mmoI.L 1Na2HPO4JOOmmol.L 1NaCl, IOOmmol.L 1 咪唑,IOmmol.L 1MgCl2, pH7.4)梯度漂洗，用 3mL Elution buffer (50mmoI.Tr1Na2HPO4, 300mmo1.L-1NaCUOOmmol.L-1 咪唑，pH7.4)洗脫，得到洗脫液，將洗脫液用PD-1O柱(購自GEHealthcare公司)進行脫鹽處理，將緩衝液置換為50mM磷酸鹽緩衝液(pH7.4，體積百分含量10%甘油，2mM DTT, IOmM MgCl2),將脫鹽處理的洗脫液經Bradford法進行蛋白定量，得到濃度為280ng.uL—1的純化重組蛋白 SmCPS4。
[0088]將對照上清、SmCPS4上清和純化的SmCPS4進行SDS-PAGE，結果如圖3所示。圖3中，CPS4 代表 SmCPS4。
[0089]圖3表明，純化後的SmCPS4大小約為95KD，大小與預期相符。
[0090]四、SmCPS4的酶促活性分析
[0091 ](一)取步驟三純化的SmCPS4和空載體對照進行酶促反應
[0092]實驗組未脫磷反應:酶促反應總體系為400uL，其中濃度為280ng.uL—1的SmCPS4重組蛋白200uL，底物為1078ug.mL—1濃度的櫳牛兒基櫳牛兒基焦磷酸(GGPP) 5uL，餘量為195uL50mM磷酸鹽緩衝液(pH7.4，體積百分含量10%甘油，2mM DTT, IOmM MgCl2)，將體系在30°C放置3h後用正己烷萃取3次，合併正己烷層並用氮氣吹乾待用。
[0093]空載體對照未脫磷反應:實驗同上述的實驗組未脫磷反應，將SmCPS4重組蛋白替換為步驟二製備的對照上清。[0094]實驗組脫磷反應:將上述實驗組未脫磷反應體系的水相(水相是指酶促反應總體系為400uL，其中濃度為280ng.uL—1的SmCPS4重組蛋白200uL，底物為1078ug.mL—1濃度的櫳牛兒基櫳牛兒基焦磷酸(GGPP) 5uL，餘量為195uL50mM磷酸鹽緩衝液(pH7.4，體積百分含量10%甘油，2mM DTT, IOmM MgCl2)，將體系在30°C放置3h後)按照95uL水相加入5uL鹼性磷酸酶的比例進行脫磷處理。37°C放置過夜後，用正己烷萃取3次，合併正己烷層用氮氣吹乾，待用。
[0095]空載體對照脫磷反應:實驗同上述的實驗組脫磷反應，將SmCPS4重組蛋白替換為步驟二製備的對照上清。
[0096]將上述各組的提取物在上樣檢測前用80 μ L體積百分含量為98.5%的N-Methyl-N- (trimethylsilyl) trif luoroacetamide (MSTFA)和 8μ L 體積百分含量為 98%的吡啶在80°C衍生化40min，得到衍生後的產物。
[0097]同時以Labdenediol為標準品，進行上述衍生實驗。
[0098](二)利用串聯四極杆質譜GC-QqQ-MS進行目標化合物的檢測
[0099]GC-QqQ-MS 分析系統為 Agilent7890A GC 配備 Agilent7000B triple quadrupleMS系統。衍生後的各組反應產物進樣量lyL，splitless模式。氣相色譜柱為DB-5ms (30mx0.25mm 1.d., 0.25-μ m film thickness, Agilent J&ff Scientiffc, USA).氦氣流速 1.0ml.min—1。進樣口溫度280°C。升溫程序為50°C min,程序升溫20°C min—1到200°C，然後以5°C min—1到300°C。質譜接口溫度280°C。
[0100]GC-QqQ-MS分析結果如圖4所示。
[0101]圖4A為各組酶促反應的GC圖譜。
[0102]圖4A中，空載體對照(脫磷前)代表空載體對照未脫磷反應；空載體對照(脫磷後)代表空載體對照脫磷反應；Sm-CPS4-(脫磷前)代表實驗組未脫磷反應；Sm-CPS4-(脫磷後)代表實驗組脫磷反應。
[0103]圖4B為圖4A中實驗組脫磷反應產物中的峰I與標準品Iabdenediol加衍生化試劑後的EI質譜圖。
[0104]圖4B表明，經GC-QqQ-MS分析，SmCPS4與GGPP反應後，在脫磷條件下產生一個已知化合物 labdenediol ((13E)-labda-8 α，15-diol)。Labdenediol 被認為是以 GGPP 為底物產生的反應產物(13E) _8 α-hydroxylabden-15-yl diphosphate (LDPP)的脫憐產物(Schalk, M., Pastore, L., Mirata, M.A., Khim, S., Schouwey, M., Deguerry, F., Pineda, V., Rocci, L., and Daviet, L.(2012).Toward a biosynthetic route to sclareol and amberodorants.Journal of the American Chemical Society, 134 (46): 18900-18903.)。而實驗組未脫磷反應以及空載體對照反應中均無此化合物，結果表明SmCPS4催化GGPP形成了LDPP。
[0105]SmCPS4催化GGPP形成LDPP這一功能與已鑑定的菸草中NtCPS2(Sallaud, C., Giacalone, C., Topfer, R., Goepfert, S., Bakaher, N., Rosti, S., andTissier,A.(2012).Characterization of two genes for the biosynthesisof the labdane di terpene Z-abienol in tobacco(Nicotiana tabacum)glandular trichomes.Plant J.72:1-17.),南歐丹參 salvia sclarea 中的 SsLPS(Schalk, Μ., Pastore, L., Mirata, M.A., Khim, S., Schouwey, M., Deguerry, F., Pineda, V., Rocci, L., and Daviet, L.(2012).Toward a biosynthetic route to sclareol and amberodorants.Journal of the American Chemical Society, 134(46): 18900-18903.)和菊科植物 Grindelia robusta 中發現的 GrTPSl (Zerbe, P., Hamberger, B., Yuen, M., Chiang, A., Sandhu, H., Madilao, L., Nguyen, A., Hamberger, B., Bach, S.S., and Bohlmann, J.(2013).Gene Discovery of Modular Diterpene Metabolism in Nonmodel Systems.PlantPhysiol.162:1073 - 1091.)功能相同。
[0106](三)SmCPS4和 SmKSL2 聯合產生 13-ep1-manoyl oxide (13_epi_ 淚柏醚)
[0107]實驗組:在步驟(一)的實驗組未脫磷反應體系中加入300uL濃度200ng ?uL-1的步驟二製備的SmKSL2上清液後，將該體系30°C反應3h後，用正己烷萃取3次，合併正己烷層並用氮氣吹乾，得到反應物(不需衍生化)。利用步驟(二)的GC-QqQ-MS條件分析反應產物。
[0108]對照組:用步驟二製備的對照上清代替上述實驗組中的SmKSL2上清液，進行同樣反應作為陰性對照。
[0109]圖5A為實驗組和對照組的酶促反應產物的GC圖譜，可見SmCPS4和SmKSL2聯合反應生成兩個產物，其中峰2為主產物。
[0110]圖5C中從上到下第一個和第二個圖分別為酶促反應產物中峰I和峰2的E1-MS圖譜，其中主要產物峰2與文獻報導的13-ep1-manoyl oxide質譜圖一致，另一個微量產物是其異構體manoyl oxide，兩者最主要質譜圖區別是離子275和257的豐度比例不同(Demetzos, C., Kolocouris, A., and Anastasaki, T.(2002).A simple and rapid methodfor the differentiation of C_13manoyl oxide epimers in biologically importantsamples using GC - MS analysis supported with NMR spectroscopy and computationalchemistry results.Bioorg.Med.Chem.Lett.12:3605 - 3609.)，根據此特點可以得到準確的鑑別。`
[0111]實施例4、植物材料中13-ep1-淚柏醚(13-ep1-manoyl oxide)的檢測
[0112]取花期丹參植株的根、莖、葉、花萼和花瓣進行13-ep1-manoyl oxide化合的檢測。具體步驟如下:將新鮮材料凍幹48h後，研磨成粉，取各組織的粉末lOOmg，加入2mL正己烷進行提取，同時加入內標正~ 十四燒0.8ug/mL。超聲提取30min後，尚心，取各上清液用於GC-QqQ-MS檢測(檢測前不需衍生化)。GC-QqQ-MS檢測方法與實施例3中步驟四的(二)方法相同。
[0113]結果如圖5B和5C中從上到下第三個圖所示。
[0114]圖5B表明，經GC-QqQ-MS檢測，在丹參植株花萼，花瓣，葉和莖中均檢出13-ep1-manoyl oxide,其花萼中的 13-ep1-manoyl oxide (花萼中峰 2)的 EI 質譜圖(圖5C中從上到下第三個圖)與酶促反應體系(實施例3步驟四的(三)實驗組)中的峰2完全一致。其中花萼中13-ep1-manoyl oxide含量最高,相對含量0.17ug.g—1 ;葉和花瓣中均為
0.03ug.g'莖中為0.02ug.g—1，而根中沒有檢測到。該結果與實施例2的SmCPS4的基因表達結果相吻合。表明該成分在丹參地上部分特別是花萼中特異積累。同時在丹參已報導的80多種萜類化合物中，還沒有半日花烷型二萜的報導。因此，該化合物為通過基因功能挖掘而發現的丹參中含有的新化合物，通過體外酶促和植株體內化合物的檢測，證實丹參植物體內的確存在一條半日花烷型二萜的合成途徑。[0115]SmCPS4與二萜類共同底物物牛兒基物牛兒基焦磷酸(GGPP)反應的產物為(13E) -8 a -hydroxy labden-15-y I diphosphate (LDPP ),隨後 SmKSL2 將其催化產生13-ep1-manoyl oxide, 13-ep1-manoyl oxide為半日花焼型二胳類化合物，反應如圖6所示，圖6中，CPS4和KSL2分 別代表SmCPS4和SmKSL20
【權利要求】
1.一種蛋白，為如下(I)或(2)所示: Cl) SEQ ID N0.3所示的蛋白； (2)將SEQ ID N0.3所示的胺基酸序列經過一個或幾個胺基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且功能相同的蛋白質。
2.權利要求1所述蛋白的編碼基因。
3.根據權利要求2所述的編碼基因，其特徵在於:所述編碼基因為如下中至少一種: 1)SEQ ID N0.1所示的DNA分子； 2)在嚴格條件下與I)限定的DNA分子雜交且編碼權利要求1所述蛋白質的DNA分子； 3)與I)或2)限定的DNA分子具有90%以上的同一性且編碼權利要求1所述蛋白質的DNA分子。
4.含有權利要求2或3所述編碼基因的重組載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌。
5.一種蛋白組合物，由權利要求1所述的蛋白和SEQ ID N0.4所示的蛋白組成。
6.權利要求1所述的蛋白在合成(13E)_8 α-hydroxylabden-15-yl diphosphate中的應用。
7.權利要求1所述的蛋白在催化櫳牛兒基櫳牛兒基焦磷酸合成(13E) -8 a -hydroxylabden-15-yI diphosphate 中的應用。
8.權利要求5所述的蛋白組合物`在合成13-ep1-manoyloxide中的應用。
9.權利要求5所述的蛋白組合物在催化物牛兒基物牛兒基焦磷酸合成13-ep1-manoyloxide中的應用。
10.權利要求1所述的蛋白或權利要求5所述的蛋白組合物在丹參中合成13-ep1-manoyl oxide 中的應用。
【文檔編號】C12P17/06GK103849614SQ201410085600
【公開日】2014年6月11日 申請日期:2014年3月10日 優先權日:2014年3月10日
【發明者】漆小泉, 崔光紅, 靳保龍 申請人:中國科學院植物研究所