一種以羥甲基戊二醯輔酶a還原酶為靶點的膽固醇代謝調控藥物篩選系統及方法

2023-05-15 14:50:01

專利名稱：一種以羥甲基戊二醯輔酶a還原酶為靶點的膽固醇代謝調控藥物篩選系統及方法
技術領域：
本發明屬於生物技術領域，涉及細胞靶標篩選化合物系統，更具體的，本 發明涉及建立羥甲基戊二醯輔酶A還原酶(HMGCR)細胞耙標快速篩選調節 膽固醇藥物的系統和方法。
背景技術：
膽固醇不僅是生物膜的關鍵組成成分，還是膽汁酸、甾醇類激素等合成的 前體。然而，體內高水平膽固醇如高膽固醇血症可直接導致動脈粥樣硬化，是 中風和冠心病的主因；老年痴呆症、肥胖症、糖尿病等的發生也與膽固醇代謝 紊亂密切相關。由於高膽固醇的致病性，在心血管等疾病的治療與預防方案中 都把降膽固醇作為重要組成。
細胞內膽固醇的起始性合成是膽固醇代謝的重要組成，人體每天更新的約 1克膽固醇中，有2/3為自身合成獲得。HMGCR是膽固醇合成過程中的限速酶， 它催化羥甲基戊二醯輔酶A(HMG-CoA)還原為甲羥戊酸。
HMGCR所催化的HMG-CoA還原為甲羥戊酸是內源性膽固醇合成途徑中 的關鍵步驟，目前臨床應用最廣泛的降膽固醇藥物-他汀(Statin)類藥物，就是 HMGCR酶活性的競爭性抑制劑，它針對HMGCR的COOH端結構域，競爭性 抑制甲羥戊酸的形成，從而降低膽固醇合成，刺激低密度脂蛋白(LDL)受體表 達，增強對血漿LDL的清除，從而達到降低血液膽固醇的目的。然而，服用他 汀類藥物將使HMGCR蛋白量代償性非常顯著增多，導致患者不得不提高藥物 劑量來抑制細胞內增多的HMGCR。這就使得該類藥物在降膽固醇方面的作用， 表現為"用量上升、藥效遞減"，長期服用最後可形成嚴重不良的藥物劑量增高 依賴性。而且己有報導，服用高劑量他汀類藥物會引起肌肉毒性，嚴重者可發 生橫紋肌溶解症。
從眾多未知的化合物中篩選新的有效降膽固醇藥物已成為心腦血管疾病
藥物研發任務的重中之重。同時，尋找一種快速有效的化合物篩選系統也變得 尤為迫切。但是，傳統的方法篩選化合物普遍存在著諸如周期長，操作繁瑣， 特異性和敏感性差，不規範，不適用於大批量檢測等明顯的不足。
因此，本領域迫切需要開發一種方便快速、操作簡單且具有良好的特異性 和敏感性的篩選膽固醇藥物的系統。

發明內容
本發明的目的在於提供一種方便快速、操作簡單且具有良好的特異性和敏 感性的篩選膽固醇藥物的系統及其構建方法。
在本發明的第一方面，提供一種融合蛋白，所述的融合蛋白包括
(a) 羥甲基戊二醯輔酶A還原酶的八次跨膜結構域；
(b) 可檢測信號元件；和
(c) 任選的位於(a)和(b)之間的連接元件。
在另一優選例中，所述的羥甲基戊二醯輔酶A還原酶的八次跨膜結構域具 有SEQ ID NO: 1所示的胺基酸序列或與其同源性超過70% (優選的是同源性超 過80%;更優選的是同源性超過90%;進一步優選的是同源性超過95%)的氨
基酸序列。
在另一優選例中，所述的可檢測信號元件選自(但不限於)螢光蛋白、
螢光素酶、半乳糖苷酶、鹼性磷酸酶、抗體可識別的短肽。
在另一優選例中，所述的抗體可識別的短肽選自(但不限於)Fag、 T7、 Myc、 HA。
在另一優選例中，所述的螢光蛋白選自綠色螢光蛋白或增效的綠色螢光 蛋白。
在另一優選例中，所述的連接元件具有i-io個胺基酸。
在另一優選例中，所述的羥甲基戊二醯輔酶A還原酶的八次跨膜結構域位 於氨基端，而所述的可檢測信號元件位於羧基端。
在另一優選例中，所述的羥甲基戊二醯輔酶A還原酶的八次跨膜結構域位 於羧基端，而所述的可檢測信號元件位於氨基端。
在本發明的第二方面，提供一種核酸分子，所述的核酸分子編碼所述融合
蛋白；或與所述的核酸分子相互補。
在本發明的第三方面，提供一種載體，它含有所述的核酸分子。 在另一優選例中，所述的載體選自質粒、病毒、或人工染色體。
在本發明的第四方面，提供一種基因工程化的細胞，所述的細胞含有所述 的載體；或所述的細胞基因組中整合有所述的核酸分子。
在本發明的第五方面，提供所述的融合蛋白的用途，用於篩選調節膽固醇 的物質。
在另一優選例中，所述的調節膽固醇是降低膽固醇或提高膽固醇。
在本發明的第六方面，提供一種篩選以羥甲基戊二醯輔酶A還原酶為靶點 的調節膽固醇的潛在物質的方法，所述方法包括步驟
(a) 將候選物質與所述的細胞接觸；
(b) 觀察候選物質對細胞中可檢測信號的影響；
其中，若所述候選物質可降低(優選的是顯著降低，如降低20%;更佳地 降低40%;最佳地降低60%或更低)所述細胞中的可檢測信號的水平，則表明該 候選物質是降膽固醇的潛在物質；
若所述候選物質可提高(優選的是顯著提高，如提高20%;更佳地提高40%; 最佳地提高60%或更高(如提高200%))所述細胞中的可檢測信號的水平，則表 明該候選物質是提高膽固醇的潛在物質。
在另一優選例中，步驟(a)包括在測試組中，在所述的細胞的培養物中添 加候選物質；和/或
步驟(b)包括檢測測試組的細胞中的可檢測信號的水平，並與對照組比較， 其中所述的對照組是不添加所述候選物質的所述的細胞。
在另一優選例中，所述的方法還包括步驟對獲得的潛在物質進行進一步
的細胞實驗和/或動物試驗，以選出對於調節膽固醇有效的物質。
另一方面，本發明還提供一種通過所述的方法獲得的調節膽固醇的物質。
優選的，該物質是具有調節(提高或降低)細胞膽固醇合成水平的活性物質。 另一方面，本發明還提供一種藥物組合物，它包含安全有效量的所述的調 節膽固醇的物質，以及藥學上可接受的賦形劑、稀釋劑或載體。
本發明的其它方面由於本文的公開內容，對本領域的技術人員而言是顯而 易見的。


圖1顯示了 HMGCR(TMl-8)-EGFP表達質粒結構示意圖。
圖2顯示了 HMGCR (TMl-8)-EGFP融合蛋白在CHO細胞瞬時轉染系統 中，25-羥膽固醇對融合蛋白的降解調控良好。
圖3顯示了螢光顯微觀察檢測到25-羥膽固醇或羊毛甾醇對HMGCR (TMl-8)-EGFP融合蛋白降解調控良好。圖4顯示了蛋白免疫雜交方法檢測到 25-羥膽固醇對HMGCR(TMl-8)-EGFP融合蛋白降解調控良好。
圖5顯示了在瞬時轉染系統中，蛋白免疫雜交方法檢測到25-羥膽固醇對 HMGCR(TMl-8)-Luciferase融合蛋白降解調控良好。
具體實施例方式
本發明人經過廣泛而深入的研究，首次發現，將羥甲基戊二醯輔酶A還原 酶(3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A reductase,簡稱HMGCR，為膽固醇 合成的限速酶)的氨基端蛋白片段與可檢測信號元件連接，導入到細胞後，可 在細胞內表達該蛋白片段與可檢測信號元件的融合蛋白，所述融合蛋白既保留 了 HMGCR氨基端結構的功能和活性，又能夠方便地被檢出，從而可極好地用 於篩選調節(優選降解)HMGCR的物質，所述調節HMGCR的物質可作為調節 膽固醇的潛在藥物。
本發明人基於HMGCR氨基端結構域的降解可以導致內源性膽固醇合成減 少，成功構建了羥甲基戊二醯輔酶A還原酶的瞬時表達系統和穩定表達系統。 基於本發明的系統，可以快速有效地從眾多功能未知的化合物中篩選出針對 HMGCR的氨基端結構域，並有效促進該蛋白泛素化降解的活性小分子化合物， 為新藥開發提供一個便捷有利的技術平臺。重要的是，針對這一靶點的藥物， 將可能解決現有的他汀類藥物的劑量增高依賴問題及藥物毒性問題等缺陷，從 而為治療高膽固醇血症引起的嚴重疾病(如動脈粥樣硬化、冠心病等)提供更
好的治療手段。
融合蛋白
本發明提供一種融合蛋白，該融合蛋白包括HMGCR氨基端結構，和可檢 測信號元件，該分子可用於觀察候選物質對於HMGCR的影響作用，篩選調節 HMGCR的物質。
HMGCR是一種廣泛存在於哺乳動物中的、高度保守的蛋白。HMGCR蛋 白主要由兩部分組成，氨基端為八次跨膜結構域，該結構域位於細胞膜上，其 作用是調控蛋白的穩定性，當細胞內甾醇水平過高時，HMGCR的氨基端結構 域通過直接或間接與甾醇結合，起始細胞內由膜蛋白Insig介導的泛素-蛋白酶 體途徑最終導致HMGCR的降解。HMGCR蛋白的羧基端為催化結構域，行使 還原酶的功能。
本發明人在實踐中發現，全長的HMGCR難以製備並表達攜帶可檢測信號 的融合蛋白，即使在有些情況下表達成功，但穩定性和檢測效果均不夠理想， 再現性差，無法利用全長的HMGCR構建攜帶檢測信號的融合蛋白來篩選調節 HMGCR的物質。因此，本發明人選擇了多種HMGCR的片段與可檢測信號元 件融合來構建篩選系統，結果發現，採用具有HMGCR氨基端八次跨膜結構域 的蛋白片段與可檢測信號相連接，可建立極其優異的篩選系統，用於篩選調節 HMGCR的物質。
適當胺基酸替換、增加或減少的HMGCR氨基端八次跨膜結構域在本發明 中也是可用的，只要其保留了 HMGCR氨基端八次跨膜結構域的大部分生物活 性(如保留80%、 90%、 95%、 99%、或100%的活性)。適當替換胺基酸是本領 域的公知的技術， 一般來說，在該蛋白片段的非必要區域改變單個或多個氨基 酸基本上不會改變生物活性。見Watson等Molecular Biology of The Gene，第 四版，1987， The Benjamin/Cummings Pub. Co. P224。
應理解，雖然本發明的HMGCR氨基端八次跨膜結構域的編碼基因獲自倉 鼠，但是獲自其它哺乳動物的與該HMGCR氨基端八次跨膜結構域的編碼基因 高度同源(如具有70%以上，優選超過80%，更優選超過90。/。，進一步優選超過 95%的同源性)的基因也在本發明考慮的範圍之內。比對序列相同性的方法和工 具也是本領域周知的，例如BLAST。
在本發明的一種優選方式中，所述的HMGCR氨基端八次跨膜結構域具有 SEQIDNO: 1 (346aa)所示的胺基酸序列。
多種可檢測信號元件可與HMGCR氨基端八次跨膜結構域連接，從而用於 構建篩選調節HMGCR的物質的系統。
所述的可檢測信號元件包括但不限於螢光蛋白、螢光素酶、半乳糖苷 酶、鹼性磷酸酶、抗體可識別的短肽。適用於本發明的可檢測信號元件通常 具有6-1000個胺基酸，較佳地具有10-700個胺基酸；更佳地具有10-400個 胺基酸。然而，不在6-1000個胺基酸範圍內的其它長度的可檢測信號元件也 被包含在本發明中，只要其能夠與HMGCR氨基端八次跨膜結構域良好地連 接且基本上不影響HMGCR氨基端八次跨膜結構域的功能、活性、摺疊或空 間構象。作為本發明的最優選的方式，所述的可檢測信號元件是螢光蛋白或 螢光素酶。
所述的抗體可識別的短肽包括但不限於Flag、 T7、 Myc、 HA。
在本發明的一種最優選的方式，所述的螢光蛋白是綠色螢光蛋白(GFP) 或增效的綠色螢光蛋白(EGFP)。綠色螢光蛋白是指一種標記蛋白，其內源螢光 基團在受到紫外光或藍光激發時可高效發射清晰可見的綠光，且見光不易淬 滅。所述的綠色螢光蛋白還包括各種在野生型綠色螢光蛋白基礎上進行改進的 蛋白，比如進行基因優化；或通過胺基酸替換提高GFP脫輔基蛋白在高溫(如 37℃)條件下的正確摺疊，以及改變GFP光譜特性等。"增效的綠色螢光蛋白" 為對綠色螢光蛋白進行改進後的蛋白，例如，可克隆自質粒pEGFP-Nl或 pEGFP-N3 (購自Clontech)。本發明人在試驗中發現，HMGCR氨基端八次跨膜 結構域與綠色螢光蛋白的融合蛋白表達系統能夠最靈敏地反映候選物質對於 HMGCR的調控作用，提示綠色螢光蛋白與HMGCR氨基端八次跨膜結構域的 融合對於HMGCR氨基端八次跨膜結構域的空間結構影響或其它方面幹擾最 小。此外，應用綠色螢光蛋白的另一優點是成本低廉，通過螢光分析即可體現 結果，較之免疫雜交等方法更直觀、更靈敏、更方便。
所述的HMGCR氨基端八次跨膜結構域和可檢測信號元件可直接連接，或 通過多肽連接元件連接，從而形成融合蛋白。
連接元件的長度沒有特別限制，通常為l-10個胺基酸。連接元件不影響或
不顯著影響HMGCR氨基端八次跨膜結構域和可檢測信號元件胺基酸序列形成
正確的摺疊和空間構象。
一些連接元件的例子例如多克隆位點所編碼的氨基
酸序列。
所述的HMGCR氨基端八次跨膜結構域可以位於融合蛋白的氨基端(N端)， 而可檢測信號元件位於融合蛋白的羧基端(C端)。或者，也可互換兩種蛋白片 段所處的位置，也即所述的HMGCR氨基端八次跨膜結構域位於融合蛋白的 羧基端，而可檢測信號元件位於融合蛋白的氨基端。或者，可檢測信號元件插 入於HMGCR氨基端八次跨膜結構域中間，優選的是將可檢測信號元件插入到 跨膜區與跨膜區之間的區域。作為本發明的一種優選的方式，所述的HMGCR 氨基端八次跨膜結構域位於融合蛋白的氨基端(N端)；所述的可檢測信號元件 位於融合蛋白的羧基端(C端)。
另一方面，本發明還提供了編碼所述含有HMGCR氨基端八次跨膜結構域 和可檢測信號元件的融合蛋白的核酸，也可以是其互補鏈。
任何編碼HMGCR氨基端八次跨膜結構域的合適的DNA結構都適用於本 發明。任何編碼可檢測信號元件的合適的DNA結構也適用於本發明。
並且，本發明還提供了一種重組載體，該載體包含編碼所述融合蛋白的核 酸分子的載體。所述的載體還可包含與所述核酸分子的序列操作性相連的表達 調控序列，以便於所述融合蛋白的表達。
任何合適的載體都可用於製備所述的重組載體，比如一些用於細菌、真菌、 酵母和哺乳動物細胞的克隆和表達的載體，如Pouwds等，克隆載體實驗室
手冊(Elsevier最新版)中所描述的。在本發明的優選方式中，所述的載體選自 質粒、病毒、或人工染色體。
表達載體包括連接有合適的轉錄和翻譯調節序列的融合蛋白DNA序列， 如哺乳動物、微生物、病毒或昆蟲基因。調節序列包括轉錄啟動子、操縱子、 增強子、核糖體結合位點或控制轉錄和翻譯起始和終止的合適序列。在融合蛋 白序列需要調節序列功能的時候，則連接合適的調節序列。這樣，啟動子序列 被連接在編碼融合蛋白DNA序列前端。在宿主細胞內的複製的能力通常由復 制起始點控制。用於轉化株識別的篩選基因也可加入表達載體。
含有編碼所述融合蛋白的核酸序列的重組細胞也包括在本發明中。所述的 重組細胞可以是瞬時轉染了所述重組載體的宿主細胞，可以是穩定表達所述重 組載體的宿主細胞，也可以是同源重組的轉基因細胞，或是原代培養的細胞，
或是永生化的細胞。利用所述重組細胞進行以HMGCR為靶點的調節膽固醇藥 物的篩選。
篩選系統和篩選方法
技術領域：
本發明的含有HMGCR氨基端結構和可檢測信號元件的融合蛋白可用於構 建篩選調節HMGCR的物質的體系，所述調節HMGCR的物質可進一步用作調 節(如升高或降低，優選降低)膽固醇的藥物。
所述的篩選系統是一種重組細胞體系，所述細胞中被導入了攜帶所述融合 蛋白的編碼基因的載體。在該細胞體系中，所述的融合蛋白被表達。因此，可 通過在細胞培養物中加入候選物質，觀察候選物質對融合蛋白是否有調節作 用，從而篩選潛在的可調節HMGCR的物質。由於融合蛋白中含有可檢測信號 元件，從而為調節作用的觀察提供了便利途徑。
因此，本發明還提供一種以HMGCR為靶點的篩選調節膽固醇的潛在物質 的方法，所述方法包括步驟
(a) 在測試組中，在所述的重組細胞中添加候選物質；
(b) 檢測測試組的重組細胞中的可檢測信號的水平，並與對照組比較，其 中所述的對照組是不添加所述候選物質的所述的重組細胞；
其中，若所述候選物質可降低(優選的是顯著降低，如降低20%;更佳地 降低40%;最佳地降低60%)所述細胞中的可檢測信號的水平，則表明該候選物 質是降膽固醇的潛在物質；若所述候選物質可提高(優選的是顯著提高，如提高 20%;更佳地提高40%;最佳地提高60%或更高(如提高200%))所述細胞中的 可檢測信號的水平，則表明該候選物質是提高膽固醇的潛在物質。
作為本發明的優選方式，本發明人將攜帶所述融合蛋白的編碼序列的重組 載體瞬時轉染哺乳動物細胞或者構建穩定表達該重組蛋白的細胞株，通過檢測
HMGCR融合蛋白的表達調控和降解調控，篩選調節膽固醇藥物。為了實現上 述目的，本發明人採用了以下技術HMGCR融合蛋白表達載體的構建；HMGCR 融合蛋白表達載體瞬時轉染系統的構建，HMGCR融合蛋白穩定表達系統的構 建。利用功能己知的化合物檢測HMGCR融合蛋白瞬時表達系統和穩定表達系 統的有效性及靈敏性。
通過上述方法初步篩選出的物質可構成一個篩選庫，以便於人們最終可以 從中選擇到對於調節膽固醇有用的藥物。
因此，本發明還提供了利用所述的方法獲得的可調節HMGCR的物質，作 為膽固醇調節的潛在藥物。
本發明還提供了一種組合物，所述的組合物包含安全有效量的所述的調節 膽固醇的物質，以及藥學上或食品學上可接受的賦形劑、稀釋劑或載體。所述 的組合物可以是藥物組合物、食物組合物或保健品組合物。所述的"藥學上可 接受的"或"食品學上可接受的"的成分是適用於人和/或動物而無過度不良副 反應(如毒性、刺激和變態反應)的，即具有合理的效益/風險比的物質。所述的 "有效量"是指可對人和/或動物產生功能或活性的且可被人和/或動物所接受 的量。
本發明的主要優點在於
(1) 首次提供一種可表達HMGCR氨基端結構和可檢測信號融合蛋白的系 統，其中的融合蛋白既保留了 HMGCR氨基端結構的功能和活性，又能夠方便 地被檢出，從而為篩選調節HMGCR的物質、進而獲得調節膽固醇的藥物提供 了良好的途徑。
(2) 本發明構建的篩選系統具有良好的敏感性和準確性。
(3) 本發明的方法提供了一種便捷有效的檢測各類化合物的調節膽固醇效 應的實驗手段，該方法不僅可以應用於實驗室對膽固醇代謝調控的理論基礎研 究，還可應用於藥物開發的前沿，用於建立一種化合物規模篩選的技術平臺。
(4) 本發明可同時進行高通量的化合物篩選；篩藥機理明確，速度快，作 用效果直觀。並且，本發明的方法通用性強，實驗系統穩定，重複性好。
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件如Sambrook等人，分子克隆實驗室指南(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照製造廠商所建 議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數按重量計算。
除非另行定義，文中所使用的所有專業與科學用語與本領域熟練人員所熟 悉的意義相同。此外，任何與所記載內容相似或均等的方法及材料皆可應用於 本發明中。文中所述的較佳實施方法與材料僅作示範之用。
實施例1
HMGCR(TMl-8)-EGFP融合表達載體的構建
已知HMGCR氨基端為八次跨膜結構域，其功能是調控蛋白的穩定性， 當細胞內甾醇水平過高時，該結構域通過直接或間接與甾醇結合，引起細胞 內由泛素-蛋白酶體介導的HMGCR的降解。本發明將編碼倉鼠HMGCR氨基 端八次跨膜結構域的基因片段克隆進綠螢光蛋白表達載體。該重組載體中HMGCR (TMl-8)-EGFP融合蛋白的表達和降解受甾醇調控。重組載體的構建 過程如下
採用常規的方法，提取倉鼠的基因組RNA。採用常規的方法，以該基因組 RNA為模板，逆轉錄PCR擴增獲得倉鼠的基因組cDNA。
以前述獲得的倉鼠基因組cDNA為模板，以下列引物對為引物，
上遊引物5'ATCGGATCCATGTTGTCACGACTTTTC 3'(SEQ ID NO: 2 ， 其中下劃線為BamHI酶切位點)；
下遊引物5'ATCGGATCCGGACTCTGTCTCTGCTTG 3'(SEQ ID NO: 3，其中下劃線為BamHI酶切位點)；
利用PCR技術擴增得到編碼倉鼠HMGCR的氨基端八次跨膜結構域 (HMGCR (TM1-8)， l-346aa)的基因序列；
PCR擴增的體系如下
上下遊引物 各0.5 μl;
10x KOD PCR反應緩衝液 2.0 μl;
dNTP 2.0μl
倉鼠cDNA 1.0μl
KOD Hot Start DNA聚合酶0.5 μl;
去離子水補至 25μ1。
PCR擴增程序如下首先，94 ℃預變性5分鐘；之後開始循環94 ℃30 秒，60℃30秒，72℃45秒，重複31個循環；然後，72℃5分鐘。
瓊脂糖凝膠(1%電泳鑑定PCR產物；利用TIANGEN瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收PCR電泳產物。
將獲得的PCR產物連接入pEGFP-N3載體(購自Clontech)的BamHI酶切位點內，構建成倉鼠HMGCR跨膜結構域綠螢光蛋白融合表達質粒pHMGCR (TMl-8)-EGFP。
連接體系如下
經BamHI酶切的pEGFP-N3載體 (0.3 μg/μl) 0.5 μl
經膠回收的PCR產物 8.3 μl
T4DNA連接酶(NEB) 400,000U/ml 0.2μl
10x緩衝液 1μl
室溫條件下，連接過夜。
將前述獲得的連接產物轉化大腸桿菌DH12S(購自INVITROGEN)。挑選被轉化的大腸桿菌單克隆，提取質粒，經BamHI酶切及Invitrogen公司DNA 序列測定驗證，最終得到正確的倉鼠HMGCR跨膜結構域-綠螢光蛋白融合表達質粒pHMGCR (TMl-8)-EGFP。
實施例2
HMGCR (TMl-8)-EGFP融合蛋白表達載體瞬時轉染系統的構建和藥物篩選
本發明構建了 HMGCR(TM 1 -8)-EGFP融合蛋白表達載體瞬時轉染系統。將 HMGCR(TMl-8)-EGFP融合蛋白重組載體瞬時轉染CHO細胞系，通過螢光顯微鏡觀察，確定HMGCR(TMl-8)-EGFP融合蛋白在該瞬時轉染系統中有較高的表達水平，進一步利用25-羥膽固醇處理細胞，藉助螢光顯微鏡技術，確定 HMGCR(TM 1 -8)-EGFP融合蛋白在該系統中有良好的降解調控。
構建過程如下
(1) 轉染細胞前一天，CHO細胞以5X104加入60-mm細胞培養皿，加入 4ml含5%胎牛血清的DMEM/F12完全培養基，培養過夜。
(2) 轉染時，將6plFuGENE6轉染試劑加入到194^1無血清無抗生素的 DMEM/F12培養基中，小心混勻，室溫靜置5分鐘；然後將含有1 pg HMGCR (TMl-8)-EGFP融合蛋白表達質粒的2嗎質粒DNA(用1 pg pcDNA3.0表達質 粒補平到2(igDNA)加入該靜置後的混合物中，小心混勻，室溫靜置15-45分 鍾；最後，按照185pl轉染試劑/培養皿的量將混合物以逐滴加入的方式均勻 的加入細胞中。
(3) 細胞與質粒在培養箱中以5%C02， 37°C條件下轉染8小時。
(4) 轉染8小時後，吸去細胞培養液，用PBS緩衝液(2 ml)洗兩遍，注 意不要移動細胞，給細胞換上新鮮培養液，細胞在培養箱中以5%C02， 37 °C條 件下培養16小時。
(5) 培養16小時後，吸去細胞培養液，用PBS緩衝液(2 ml)洗兩遍，注 意不要移動細胞，給細胞換上新鮮培養液，用乙醇(對照)或1 ng/ml25-羥膽固 醇以及10mM甲戊二羥酸(Mevalonate)處理。細胞在培養箱中以5%C02， 37 °C條件下培養5小時。
培養5小時後的細胞被分為兩組， 一組加入終濃度1 pg/mL的25-羥膽固 醇(25-HC)處理；另一組不加(對照)。在螢光顯微鏡的40倍物鏡下觀察觀察加 入25-羥膽固醇處理後的細胞與未加該化合物處理的細胞的綠色螢光的強度變 化，確定小鼠HMGCR(TMl-8)-EGFP融合蛋白在CHO細胞株中的表達水平及 其降解是否受到25-羥膽固醇的調控。
結果見圖2，對照的細胞產生明顯的螢光信號，而在加入25-羥膽固醇後熒 光信號明顯減弱，說明存在靈敏的降解調控，也說明HMGCR(TMl-8)-EGFP 融合蛋白表達載體在瞬時轉染到CHO細胞株後，其生物學活性良好。
該瞬時轉染系統可以進一步用於檢測其它化合物對 HMGCR(TMl-8)-EGFP融合蛋白的表達調控和降解調控，從而最終獲得對於降 膽固醇有用的藥物。
實施例3
HMGCR(TMl-8)-EGFP融合蛋白穩定表達系統的構建
本發明構建了 HMGCR(TMl-8)-EGFP融合蛋白穩定表達系統。將 HMGCR(TMl-8)-EGFP融合蛋白重組載體轉染CHO細胞系，細胞在含有5%胎 牛血清1 mg/ml G418的DMEM/F12的培養液中培養IO天后，得到單克隆細胞 株；通過螢光顯微鏡觀察，確定HMGCR(TMl-8)-EGFP融合蛋白在單克隆細胞 株中有較高的表達水平，進一步利用活性化合物處理細胞，藉助螢光顯微鏡技 術和蛋白免疫雜交技術，確定HMGCR (TMl-8)-EGFP融合蛋白在單克隆細胞 株中有良好的降解調控。
構建過程如下
(1) 轉染細胞前一天，CHO細胞以5X104加入100-mm細胞培養皿，加 入9ml含5%胎牛血清的DMEM/F12完全培養基。
(2) 轉染時，將6)LdFuGENE6轉染試劑加入到194jal無血清無抗生素的 DMEM/F12培養基中，小心混勻，室溫靜置5分鐘；然後將含有1 pg HMGCR (TMl-8)-EGFP融合蛋白表達質粒的2 (ig質粒DNA (用1 (ig pcDNA3.0表達質 粒補平到2)agDNA)再加入該靜置後的混合物中，小心混勻，室溫靜置15-45 分鐘；最後，按照185)al轉染試劑/培養皿的量將混合物以逐滴加入的方式均 勻的加入細胞中。
(3) 細胞與質粒在培養箱中以5%C02， 37 °C條件下轉染24小時。
(4) 培養24小時後，吸去細胞培養液，用PBS緩衝液(2ml)洗兩遍，注 意不要移動細胞，給細胞換上含有5%胎牛血清，1 mg/ml G418的新鮮培養液， 並定時觀察細胞的生長狀態。
(5) 用含有5%胎牛血清，1 mg/mlG418的培養基處理細胞IO天左右後， 細胞生長形成集落，並在培養皿中穩定生長，用胰酶消化的方法將單克隆轉移 到48孔板中繼續用含有5%胎牛血清，1 mg/mlG418的培養液培養細胞，當 單克隆長到90%密度時，將一部分細胞保種，另一部分進一步擴大培養，以備 鑑定用。
(6) 通過螢光顯微鏡直接觀察的方法從細胞單克隆中選出螢光強度均一且 亮度較佳的細胞株。
然後，對選出的細胞的HMGCR(TMl-8)-EGFP融合蛋白的表達調控進行鑑 定。步驟如下
藉助螢光顯微觀察方法的單克隆細胞株鑑定
處理前一天將細胞以合適的密度鋪在12孔板中，每一株細胞需要3個孔位。
培養24小時後，細胞密度達到60%左右，吸去細胞培養液，用PBS緩衝 液(2ml)洗兩遍，注意不要移動細胞，給細胞換上新鮮培養液。
培養16小時後，吸去細胞培養液，用PBS緩衝液(2ml)洗兩遍，注意不 要移動細胞，給細胞換上新鮮培養基，採用的新鮮培養基有3種 一種含有乙 醇(對照)；另一種含有1 pg/ml25-羥膽固醇；第三種含有3 (ig/ml羊毛甾醇， 細胞在培養箱中以5%C02， 37℃條件下培養5小時，螢光顯微鏡鏡檢，其中 用25-羥膽固醇和羊毛甾醇處理5小時後的細胞，與未加化合物處理的細胞熒 光強度進行比較，綠螢光強度均大大減弱的細胞株說明其HMGCR (TMl-8)-EGFP融合蛋白的表達調控良好。
圖3為螢光顯微鏡觀察其中一株細胞在3種培養基中的細胞螢光情況，與 對照相比，25-羥膽固醇和羊毛甾醇的加入使得綠螢光強度大大減弱。
該穩定表達系統可以進一步用於檢測其它化合物對 HMGCR(TMl-8)-EGFP融合蛋白的表達調控和降解調控，從而選出對於降膽固 醇有用的藥物。
藉助蛋白免疫雜交方法的細胞株鑑定
處理前一天將細胞以4X1S接入60-mm細胞培養皿，每一株細胞需要兩 個平行。
培養24小時後，細胞密度達到70%左右，吸去細胞培養液，用PBS緩衝 液(2ml)洗兩遍，注意不要移動細胞，給細胞換上新鮮培養液。細胞在培養箱 中以5%CO2， 37 ℃條件下培養16小時。
培養16小時後，吸去細胞培養液，用PBS緩衝液(2ml)洗兩遍，注意不 要移動細胞，給細胞換上新鮮培養液，此時新鮮培養基有2種 一種含有乙醇 (對照)；另一種含有1 )ig/ml25-羥膽固醇，10 mM甲戊二羥酸。細胞在培養箱中以5%<:02， 37°C條件下培養5小時，收集細胞，採用RIPA裂解液破碎細 胞，最終獲得細胞全蛋白，用抗HMGCR抗體(購自Upstate)和抗綠螢光蛋白抗 體(購自Delta Biolabs)檢測25-羥膽固醇對細胞穩定表達的小鼠HMGCR綠螢光 蛋白的降解調控情況。蛋白表達水平高且有顯著降解調控的細胞株即可用於作 為HMGCR細胞耙標。
圖4為一株細胞在對照培養基和25-羥膽固醇培養基中的HMGCR和EGFP 表達情況，與對照組相比，25-羥膽固醇試驗組中HMGCR和EGFP表達量均大
大降低。
通過上述方法和途徑最終得到穩定表達高水平HMGCR(TMl-8)-EGFP融
合蛋白且其表達和降解調控系統靈敏的細胞。
實施例4
HMGCR(TMl-8)-Luciferase融合表達載體的構建
本實施例中，製備攜帶HMGCR(TMl-8)與螢光素酶(Luciferase)融合基因 的融合表達載體。構建方法如下
以pGL3-Basic質粒(購自Promega)為模板，PCR擴增得到編碼螢光素酶 蛋白(2-550aa)的核苷酸序列，經BamHI和Xbal連接進入pcDNA3.0;以獲得 pCMV-Luciferase質粒。
擴增螢光素酶胺基酸序列所用的引物序列如下
上遊引物(SEQIDN0:4，其中下劃線為BamHI酶切位點)
5，ATCGGATCCGAAGACGCCAAAAACATAAAGAAAGG 3，；
下遊引物(SEQIDNO:5，其中下劃線為Xbal酶切位點
5，GCCCCGACTCTAGAATTACACGGC 3，。
PCR擴增的體系如下
上下遊引物各 2.0μl;
10x Pfu PCR反應緩衝液 5.0 μl
dNTP 4.0 μl
pGL3-Basic質粒 1.0μl
PfuDNA聚合酶 1ul；
去離子水補至 50ul。
PCR擴增程序如下首先，94 °C預變性4分鐘；然後開始循環，94 °C 30 秒，60 °C 30秒，72 °C 2分鐘，重複31循環；最後72 °C 10分鐘。
瓊脂糖凝膠(1%)電泳鑑定PCR產物，然後利用瓊脂糖凝膠快速回收 (TIANGEN瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒)。
將具有上述PCR擴增產物在利用BamHI和Xbal酶切後連接入pcDNA3.0 載體的BamHI和Xbal中，構建成螢光素酶表達質粒。
連接體系如下
經BamHI和Xbal酶切的pcDNA3.0載體(0.3 (ig/|il) 0.8 (il; 經膠回收的PCR產物 8.0|ul; T4 DNA Ligase (NEB) 400,000U/ml 0.2 fil;
lOxBuffer for T4 DNA Ligase 1,0 (il;
室溫條件下，連接過夜。
將上述獲得的連接產物轉化大腸桿菌DH12S。挑選大腸桿菌單克隆，提 取質粒，經BamHI和Xbal酶切及Invitrogen公司DNA序列測定實驗，結果得 到正確的螢光素酶表達質粒pCMV-Luciferase。
用BamHI酶切實施例1獲得的HMGCR(TMl-8)-EGFP融合表達載體，得 到其中編碼倉鼠HMGCRN端八次跨膜結構域(l-346aa)的核苷酸序列，連接進 入經BamHI酶切的pCMV-Luciferase質粒中；得到HMGCR-Luciferase融合表
達質粒。
實施例5
HMGCR(TMl-8)-EGFP融合蛋白表達載體瞬時轉染系統的構建和藥物篩
選
本實施例中，構建HMGC(TMl-8)-Luciferase融合蛋白瞬時表達系統，進 一步利用25-羥膽固醇處理細胞，藉助蛋白免疫雜交技術，以確定HMGCR-Luciferase融合蛋白在該系統中有好的降解調控。
操作過程如下
1) 轉染細胞前一天，CHO細胞(購自ATCC)以4X105進60-mm細胞培 養皿，加入4ml含5%胎牛血清的DMEM/F12完全培養基，培養過夜。
2) 轉染時，將6inlFuGENE6轉染試劑加入到194fil無血清無抗生素的 DMEM/F12培養基中，小心混勻，室溫靜置5分鐘；然後將1 pg HMGCR(TMl-8)-Luciferase融合表達質粒和100 ng人Insig-l表達質粒 pCMV-Insig-l(構建如下以常規方法獲得的人基因組cDNA為模板，以 5，ATCGGATCCAATGCCCAGATTGCACGACCA 3， (SEQ ID NO: 6);
5'ATCGGATCCtcaatcactatggggcttttcaggaa 3， (SEQ ID NO: 7)為引物PCR擴增 獲得編碼人Insig-l全長的基因序列，以BamHI酶切後連接入pcDNA3.0載體 的BamHI酶切位點內，構建成人Insig-l表達質粒pCMV-Insig-1)加入該靜置 後的混合物中，小心混勻，室溫靜置15-45分鐘；最後，按照185)a1轉染試劑 /培養皿的量將混合物以逐滴加入的方式均勻的加入細胞中。
3) 細胞與質粒在培養箱中以5%C02， 37 °C條件下轉染8小時。
4) 培養8小時後，吸去細胞培養液，用PBS緩衝液(2ml)洗兩遍，注意 不要移動細胞，給細胞換上新鮮培養液，細胞在培養箱中以5%C02， 37 °C條 件下培養16小時。
5) 培養16小時後，吸去細胞培養液，用PBS緩衝液(2 ml)洗兩遍，注 意不要移動細胞，給細胞換上新鮮培養液，用乙醇(對照)或1 Mg/ml25-羥膽固 醇以及10mM甲戊二羥酸處理。細胞在培養箱中以5%C02， 37 °C條件下培 養5小時。
6) 培養5小時後，收集細胞，採用RIPA裂解液破碎細胞，最終獲得細胞全 蛋白，用抗螢光素酶抗體(購自ABCAM)檢測25-羥膽固醇對細胞瞬時表達的 HMGCR(TMl-8)-Luciferase蛋白的降解調控情況，結果表明該融合蛋白在瞬時 轉染系統中正常表達且25-羥膽固醇對其有顯著降解調控。
圖5為細胞在對照培養基和25-羥膽固醇培養基中的HMGCR(TMl-8) —Luciferase蛋白水平，與對照相比，25-羥膽固醇中HMGCR(TM1-8) —Luciferase
蛋白量有明顯降低。20
該瞬時轉染系統可以進一步用於檢測其它化合物對HMGCR(TMl-8)-Luciferase融合蛋白的表達調控和降解調控，從而選出對於降 膽固醇有用的藥物。
綜上，HMGCR(TMl-8)-EGFP融合蛋白表達系統與HMGCR(TMl-8)-EGFP融合蛋白表達系統均能夠較好地反映候選物質對於HMGCR的降解調控作用； 並且，HMGCR(TMl-8)-EGFP融合蛋白的效果最佳、最靈敏，且更易於實驗操作和觀察。
在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻 被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之後，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落於本申 請所附權利要求書所限定的範圍。
序列表
中國科學院上海生命科學研究院
<120〉 一種以羥甲基戊二醯輔酶A還原SI為耙點的膽固醇代謝調控藥物篩選系統及方法 073424 <160〉 7
<170〉 Patentln version 3.3
<210〉1
346
<212〉 PRT
<213〉倉鼠
1
see original document page 22
see original document page 23<210〉 2 <211〉 27 <212〉, <213〉 人T序列

<221〉 misc一feature <223〉 引物
<400〉 2
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<210〉 3
<211〉 27
DNA 人工序列
<400〉 3
see original document page 23
<210〉 4
〈211〉 35
<212〉 DNA
<213〉 人工序列
〈220〉
<221〉 misc—feature 引物
<400〉 4
see original document page 23<210〉 5
<211〉 24
<212〉 DNA
人T序列
<220〉
see original document page 23
<221〉 misc一feature
<223〉 引物
〈400〉 5
gccccgactc tagaattaca cggc 24
<210〉 6
30
<212〉 DNA <213〉人工序列
<220〉
<221〉 misc—feature
<223〉 引物
<400〉 6
atcggatcca atgcccagat tgcacgacca 30
<210〉 7
<211〉 35
<212〉 DNA
<213〉 人工序列
<220〉
<221〉 misc—feature
<223〉 引物
<400〉 7
atcggatcct caatcactat ggggcttttc aggaa3權利要求
1.一種融合蛋白，其特徵在於，所述的融合蛋白包括(a)羥甲基戊二醯輔酶A還原酶的八次跨膜結構域；(b)可檢測信號元件；和(c)任選的位於(a)和(b)之間的連接元件。
2. 如權利要求1所述的融合蛋白，其特徵在於，所述的羥甲基戊二醯輔酶 A還原酶的八次跨膜結構域具有SEQ ID NO: 1所示的胺基酸序列或與SEQ ID NO: 1所示的胺基酸序列同源性超過70%。
3. 如權利要求1所述的融合蛋白，其特徵在於，所述的可檢測信號元件選 自螢光蛋白、螢光素酶、半乳糖苷酶、鹼性磷酸酶、抗體可識別的短肽。
4. 一種核酸分子，其特徵在於，(i) 所述的核酸分子編碼權利要求1所述融合蛋白；或(ii) 所述的核酸分子與(i)所述的核酸分子相互補。
5. —種載體，其特徵在於，它含有權利要求4所述的核酸分子。
6. —種基因工程化的細胞，其特徵在於，所述的細胞含有權利要求5所述 的載體；或所述的細胞基因組中整合有權利要求4所述的核酸分子。
7. 權利要求l所述的融合蛋白的用途，其特徵在於，用於篩選調節膽固醇 的物質。
8. —種篩選以羥甲基戊二醯輔酶A還原酶為靶點的調節膽固醇的潛在物質 的方法，其特徵在於，所述方法包括步驟(a)將候選物質與權利要求6所述的細胞接觸；(b)觀察候選物質對細胞中可檢測信號的影響；其中，若所述候選物質可降低所述細胞中的可檢測信號的水平，則表明該候 選物質是降膽固醇的潛在物質；若所述候選物質可提高所述細胞中的可檢測信號的水平，則表明該候選物質 是提高膽固醇的潛在物質。
9. 如權利要求8所述的方法，其特徵在於，步驟(a)包括在測試組中，在權利要求6所述的細胞的培養物中添加候選 物質；禾口/或步驟(b)包括檢測測試組的細胞中的可檢測信號的水平，並與對照組比較， 其中所述的對照組是不添加所述候選物質的權利要求6所述的細胞。
10. 如權利要求8所述的方法，其特徵在於，所述的方法還包括步驟對獲 得的潛在物質進行進一步的細胞實驗和/或動物試驗，以選出對於調節膽固醇 有效的物質。
全文摘要
本發明公開了一種以羥甲基戊二醯輔酶A還原酶為靶點的調節膽固醇藥物的篩選系統，所述系統是細胞系統，是通過將羥甲基戊二醯輔酶A還原酶的氨基端蛋白片段與可檢測信號元件連接並導入到細胞，使細胞表達融合蛋白構成的。所述系統可用於篩選以羥甲基戊二醯輔酶A還原酶為靶點的調節膽固醇的物質。
文檔編號G01N33/68GK101343326SQ200710043800
公開日2009年1月14日 申請日期2007年7月13日 優先權日2007年7月13日
發明者唐靜潔, 宋保亮 申請人:中國科學院上海生命科學研究院