一種促進中樞系統神經再生及功能恢復的dna疫苗的製作方法

2023-05-15 14:43:31 2

專利名稱：：一種促進中樞系統神經再生及功能恢復的dna疫苗的製作方法
技術領域：
：本發明涉及醫藥領域，具體涉及醫用配製品，特別是含抗原的醫用配製品。
背景技術：
：中樞神經系統(CentralNervousSystem,CNS)損傷後的神經再生修復是十分複雜的病理生理過程，涉及從分子、細胞、器官到整體的各個層次的變化。目前的研究表明，中樞神經軸突並非缺乏再生能力，而是中樞內環境不適合再生。CNS損傷早期，受損崩解的髓鞘(由少突膠質細胞形成)釋放大量的髓鞘相關軸突生長抑制因子，如Nogo-A、髓磷脂相關糖蛋白(myelin-associatedglycoprotein,MAG)、少突膠質細胞髓磷脂糖蛋白(oligodendrocyte-myelinglycoprotein，0Mgp)等。目前對抗軸突再生抑制性作用的方法有如下幾種1、利用單抗IN-1阻斷Nogo-A的抑制作用；在體外，IN-1能夠阻斷髓磷脂底物的軸突生長抑制效應。分泌IN-1的雜交瘤細胞移植到脊髓背側半切損傷的大鼠大腦半球中，可獲得了長距離的軸突再生，最長可達20mm。儘管使用IN-1阻斷Nogo-A是一種誘人的方法，但是髓磷脂還存在其它眾多的抑制成分，IN-1無法阻斷其他眾多的抑制性分子；2、純化髓磷脂作為免疫原免疫；有學者使用純化的髓磷脂來免疫大鼠，成功阻斷了所有的抑制因素，然而該方法必須使用佛氏不完全佐劑，並不適用於人類，且有誘發廣泛自身免疫反應的潛在危險；3、構建針對NgR的DNA疫苗或者利用原核表達的NgR蛋白作為抗原，此方法雖是對抗抑制信號通路上關鍵性受體分子，但目前研究表明存在其他抑制性信號旁路，仍不盡人意。由此可見，目前對抗軸突再生抑制性作用的方法或疫苗多是針對單一抑制因子，難以達到理想的促進中樞系統神經再生及功能恢復的效果。
發明內容本發明要解決的技術問題是提供一種針對多種軸突再生抑制因子的DNA疫苗。本發明解決上述問題的技術方案是—種促進中樞系統神經再生及功能恢復的DNA疫苗，該疫苗由抗原基因和真核表達載體構成；所述的抗原基因是由編碼LING0-1的LRR結構域的基因片段、編碼TN-R的EGFL結構域的基因片段以及編碼neurocan的1011-1271個胺基酸的基因片段依次線性連接構成的融合基因，各基因片段之間通過編碼三個丙氨酸的DNA序列連接(結構如圖1所示)。本發明所述DNA疫苗的製備方法，該方法由以下步驟組成(1)採用全基因合成的方法從含有LING0-1基因片段、TN-R基因片段和neurocan基因片段的載體中獲得編碼LING0-1的LRR結構域的基因片段、編碼TN-R的EGFL結構域的基因片段以及編碼neurocan的1011-1271個胺基酸的基因片段，並對這三個基因片段作以下改造①在編碼LING0-1的LRR結構域的基因片段的5'端引入啟動密碼子，②分別在編碼LING0-1的LRR結構域的基因片段和TN-R的EGFL結構域的基因片段的3'端分別引入編碼三個丙氨酸的DNA序列，③在編碼neurocan的1011-1271個胺基酸的基因片段的3'端引入終止密碼子；(2)將LING0-1的LRR結構域的基因片段、TN-R的EGFL結構域的基因片段以及neurocan的1011-1271個胺基酸的基因片段依次克隆到真核表達載體中。上述方法中，步驟(1)中PCR方法所用引物設計應滿足以下要求可分別特異性擴增LINGO-1的LRR結構域的基因片段、TN-R的EGFL結構域的基因片段以及neurocan的1011-1271個胺基酸的基因片段；可在各片段上引入與所選克隆位點相應的酶切位點使所述片段可克隆到真核載體；可在LINGO-1的LRR結構域的基因片段的5'端設置啟動密碼子，在LINGO-1的LRR結構域的基因片段的3'端設置終止密碼子以滿足所述DNA片段在真核宿主中表達的要求；在TN-R的EGFL結構域的基因片段以及neurocan的1011-1271個胺基酸的基因片段的5'端引入編碼三個丙氨酸的DNA序列。這些都是本領域普通技術人員熟識並可完成的技術。本發明DNA疫苗可表達LINGO-1的LRR結構域、TN-R的EGFL結構域和neurocan的第1011-1271個胺基酸的融合蛋白，其中，LRR(全稱為leucine-richr印eat)結構域是LINGO—1(全稱為Leucine—richrepeatandIgdomain-containingnogoreceptor-interactingprotein1)蛋白分子的膜外功能區的重要組成部分，是拮抗受體生理功能的最佳位點；EGFL(即表皮生長因子樣序列)結構域為TN-R(全稱為tenascin-R)蛋白分子起軸突抑制作用的功能區域。CSPGs(全稱為chondroitinsulphat印roteoglycans)也是膠質瘢痕中有抑制軸突再生作用最重要的細胞外基質之一，neurocan(即神經粘蛋白)為CSPGs核心蛋白的一種，特異存在於CNS，對軸突再生有明顯抑制作用，本發明所選編碼neurocan第1011-1271個胺基酸的基因片段是表達EGF、EGF_CA、CLECT_CSPGs和CCP結構域的部分，該結構域亦是neurocan蛋白分子軸突抑制作用的功能區域。本發明選擇編碼與抑制軸突再生相關蛋白質關鍵結構域的DNA片段作為抗原基因，其表達產物不僅可達到理想的免疫效果，還可避免整個蛋白分子有可能產生的非特異性免疫反應。將編碼上述結構域的片段以融合基因的形式克隆到真核表達載體中，然後通過肌肉注射真核表達載體即可將所述融合基因轉染至宿主體細胞中；當融合基因在宿主體內成功表達後，其表達產物即為LINGO-l、TN-R和CSPGs各相關結構域的融合蛋白，可作為抗原剌激宿主產生相應軸突生長抑制因子的抗體，這些抗體可對抗多種軸突生長抑制因子的活性，為中樞系統神經再生和功能恢復提供良好的微環境。融合蛋白中各片段之間通過三個丙氨酸連接，保證了DNA疫苗表達融合蛋白的各個結構域的空間結構不發生相互影響。圖1是本發明DNA疫苗結構示意圖；其中，,表示啟動密碼子，n表示編碼LINGO-1的LRR的基因片段，藝表示編碼TN-R的EGFL結構域的基因片段，歸表示編碼neurocan的1011-1271個胺基酸的基因片段，表示編碼三個丙氨酸的DNA序列，O表示終止密碼子。圖2為本發明DNA疫苗pCDNA3.l-LINGO-l-TN-R-neurocan的酶切鑑定結果的電泳圖，其中lanel為DNAMarkerl，lane2為DNAMarker2，lane3為BamHI和XhoI的酶切產物。圖3為本發明DNA疫苗pCDNA3.l-LINGO-l-TN-R-neurocan表達產物的Westernblot檢測結果電泳圖，其中lanel為proteinMarker,lane2為陰性對照，lane3為本發明DNA疫苗的表達產物。圖4為檢測本發明DNA疫苗pCDNA3.l-LINGO-l-TN-R-neurocan在大鼠體內表達情況的免疫組織化學染色照片，其中A為免疫小鼠中LING0-1的表達情況，C為免疫小鼠中neurocan的表達情況，B、D均為陰性對照。圖5為經本發明DNA疫苗pCDNA3.l-LINGO-l-TN-R-neurocan免疫的小鼠血清削弱MAG-Fc對背根神經節神經元軸突生長的抑制作用的效果柱形圖，其中口表示PLL處理的陰性對照，図表示PLL+MAG-Fc處理，圓表示表示PLL+MAG-Fc+抗血清處理。圖6為本發明DNA疫苗對RhoA抑制信號影響的檢測結果的柱形圖。圖7為本發明DNA疫苗的神經保護性作用的檢測結果的柱形圖。圖8為本發明DNA疫苗促進大鼠SCI後軸突再生的統計圖。圖9為本發明DNA疫苗促進大鼠運動功能恢復的統計結果曲線圖，其中i表示對照組，A表示實驗組。圖10為本發明DNA疫苗促進大鼠運動功能恢復的統計結果柱形圖，其中口表示對照組，B表示實驗組。具體實施例方式為了更好地理解本發明，下面將通過具體的例子詳細介紹本發明DNA疫苗的製備過程及其所具有的技術效果。1、本發明DNA疫苗構建及鑑定所需試劑LING0-1基因購自0penbiosystem公司(CatalogNumber:MHS1010-73556，載體為pCMV-SP0RT6);TN-R及neurocan各結構域由上海invitrogen公司全基因合成並連接於pMD-18T載體，設計的特異性引物也由該公司合成(因各片段不長，為了節約時間及防止常規釣取基因時不必要的鹼基突變，我們採用全基因合成方法)；PCRAmplificationKit、DNAMarker(DL2000，DL15000)、蛋白Marker和DAB顯色底物購自TaKaRa公司；PCR純化試劑盒、T4DNA連接酶及瓊脂糖凝膠回收試劑盒購自Promega公司；限制性核酸內切酶購自NEB公司，pcDNA3.1(+)、質粒大量提取試劑盒ProFilterPlasmidMaxiPr印Kits、Lipofectamine2000、羊抗LING0-1多克隆抗體購自invitrogen公司；pMD-18T、EB、感受態細菌JM109及DH-5a源於本室保存；瓊脂糖購自Sigma公司；質粒小量提取試劑盒購自天根生化科技有限公司；蛋白定量檢測試劑盒(BCAProteinAssayKit)購自Pierce公司；重組大鼠MAG-Fc蛋白購於R&D公司；Lewis大鼠購於北京維通利華實驗動物技術有限公司。2、本發明DNA疫苗構建(1)用序列為SEQNO.1和SEQNO.2的引物從含有LINGO-1基因的載體中擴增LRR5結構域的基因片段；PCR的反應程序為先升溫至9fC反應5分鐘，然後在下述條件下反應30個循環94°C30秒，55t:30秒，72。C1分鐘；最後在72。C下保持10分鐘；擴增產物的大小為763bp;用序列為SEQNO.3和SEQNO.4的引物從含有TN-R基因的載體中擴增編碼TN-R的EGFL結構域的基因片段；PCR的反應程序為先升溫至94t:反應5分鐘，然後在下述條件下反應30個循環94。C30秒，59°C30秒，72°C1分鐘，最後在72。C下保持10分鐘；擴增產物大小為630bp;用序列為SEQNO.5和SEQNO.6的引物從含有neurocan基因的載體中擴增編碼neurocan的1011-1271個胺基酸的基因片段；PCR的反應程序為先升溫至94。C反應5分鐘，然後在下述條件下反應30個循環94°C30秒、53t:30秒、72。C1分鐘，最後在72。C下保持10分鐘；擴增產物大小為801bp。(2)將步驟(1)所得的三個基因片段分別克隆到pMD-18T載體中，得到pMD-18T-LING0-l載體、pMD-18T-TN-R載體和pMD-18T-neurocan載體。重組pMD-18T載體的鑑定用BamHI和SacII酶切pMD-18T-LING0-l，用SacII和Notl酶切pMD-18T-TN-R，用Notl和Xhol酶切pMD-18T-neurocan，所得酶切產物分別電泳檢測，結果顯示酶切產物的小片段大小為763bp、630bp和801bp，與預期結果相符。(3)用BamHI和SacII酶切pMD-18T-LING0-l獲得LING0-1的LRR基因片段，用SacII和Notl酶切pMD-18T-TN-R載體獲得TN-R的EGFL基因片段，混合後用T4DNALigase連接入預先用BamHI和Notl酶切過的pCDNA3.1載體中，獲得pCDNA3.l-LINGO-l-TN-R載體；用Notl禾PXhol酶切pMD-18T-neurocan載體獲得neurocan片段，用T4DNALigase連接入預先用Notl和Xhol酶切過的pcDNA3.l-LINGO-l-TN-R載體中，獲得pcDNA3.l-LINGO-l-TN-R-neurocan載體，即本發明DNA疫苗，該疫苗中的抗原基因序列如SEQNO.7所示，編碼序列如SEQNO.8所示的融合蛋白。3、本發明DNA疫苗的鑑定(1)酶切及測序鑑定用BamHI和XhoI酶切pCDNA3.l-LINGO-l-TN-R-neurocan，酶切產物經電泳檢測，顯示所得酶切產物大小分別為5.4kb和2181bp，與設計相符，如圖2所示。2181bp的DNA片段由SEQNO.7所示的2151個鹼基和在SEQNO.7兩端增加的酶切識別序列的30個鹼基(即在SEQNO.7的5端添加了如下序列——GGATCCAAGGAGATACTTAAC，在3'端添加了TGACTCGAG)組成，與設計相符。[OO41](2)Hela細胞系瞬時表達用Lipofectamine2000將pcDNA3.l-LINGO-l-TN-R-neurocan質粒直接轉染入Hela細胞系進行瞬時表達，免疫沉澱法獲得重組蛋白，Westernblot檢測結果顯示所得重組蛋白大小約為80kD(如圖3所示)，與設計相符。4、本發明DNA疫苗的效果實驗(1)體內驗證重組蛋白表達以Lewis大鼠為研究對象(n=3)，於脛骨前肌注射100ug本發明DNA疫苗，對照組注射等量的空質粒。注射疫苗48小時後取脛骨肌肉注射部位肌肉組織行免疫組織化學染色，檢測體內重組蛋白表達情況。試驗方法如下(1)4%多聚甲醛常規灌注固定，取材並置20%蔗糖溶液(4°C)中過夜。蠟塊製作。切片，貼片。0.01MKPBS清洗5minX3後；(2)加入配好的O.3%的過氧化氫甲醇溶液(甲醇80ml+0.01MKPBS100ml+30X過氧化氫)30min，以消除內源性過氧化物酶的影響，0.01MPBS清洗5minX3;(3)加入配好的O.3%TritonX100(30%TritonXlOO+0.OIMKPBS100ml)30min，以增加細胞的通透性，0.OIMKPBS清洗5minX3;(4)加入用血清稀釋液(牛血清白蛋白1.00g+0.OIMPBS100ml+疊氮納0.08g)稀釋的一抗(LINGO-1多抗)，4。C存放24-48h;吸去抗體，O.OIMKPBS洗5minX3;(5)加入0.OIMKPBS稀釋的的二抗，室溫孵育2h。0.OIMKPBS洗5minX3;(6)加入ABC複合物的二抗，室溫孵育2h，0.OIMKPBS洗5minX3;蒸餾水迅速衝三次；(7)加入顯色液，進行免疫組織化學顯色，時間一般不超過30min，可不時在顯微鏡下進行觀察，待細胞著色而背底顏色較淡時馬上吸去顯色液，用蒸餾水迅速衝三次後加入0.OIMKPBS終止反應；(8)梯度酒精脫水之後，封片，拍照。結果接種DNA疫苗的大鼠脛骨前肌可檢測出重組蛋白的表達，而對照組(空載體組)的大鼠結果為陰性(如圖4所示)。證明重組質粒可在體內正確表達重組蛋白，為剌激機體的後續免疫反應提供了必要條件。(2)抗體檢測LING01、TN-R和neurocan的蛋白的製備方法如下按本例DNA疫苗製備方法中步驟(1)所述的反轉錄PCR方法獲得獲得編碼LINGO-1的LRR結構域的基因片段、編碼TN-R的EGFL結構域的基因片段和編碼neurocan的第1011-1271個胺基酸的基因片段，然後將所得的三個片段分別pET30a(+)表達載體連接，連接後轉化E.coliBL21感受態細胞，用化學裂解法提取包涵體，獲得His-LINGO-l、His-TN-R和His-CSPGs的融合蛋白，以備檢測用。以Lewis大鼠為研究對象(n=7)，其中6隻每周於脛骨前肌注射100ug本發明DNA疫苗。分別標記為Rati6，另一隻正常飼養，作為陰性對照，記為Rat7。第6周抽血，取血清進行ELISA檢測各Lewis大鼠的抗體水平。ELISA檢測其抗體水平的方法如下1)包被抗原將純化的His-LINGO-l蛋白(或者His-TNR、His-neurocan)用碳酸_碳酸鈉緩衝液稀釋至1Pg/ml，每孔加入10037°C環境孵育2小時。2)洗板倒掉包被液，用PBST液洗孔3次，拍幹。3)封閉酶標板每孔加入5X脫脂奶/PBS200iil，37t:封閉1小時。也可4。C封閉過夜。4)洗板倒掉封閉液，用PBST洗液洗孔3次，拍幹。5)每孔加100ii1抗體稀釋液，加入待測樣品(對照血清及抗血清)，做倍比稀釋為i:50、i:ioo、i:200及i:400，37t:環境孵育i小時。6)洗板在洗板機上，用PBST洗液洗孔6次。7)加入酶結合物拍乾洗液，每孔加入稀釋的HRP標記的羊二抗100iU，37t:環境孵育1小時。8)洗板在洗板機上，用PBST洗液洗孔6次。9)加顯色液拍乾洗液，每孔加入100iU顯色液，置37t:避光顯色15-30分鐘。10)終止反應當陽性對照出現明顯顏色變化後而陰性孔沒有顏色反應時，每孔加入終止液50iU，20分鐘內測定結果。11)酶標儀測定結果讀0D490nm。12)結果判斷以陰性孔OD值為標準，若抗血清樣品的OD值比陰性孔相應稀釋度OD值的比值大於2.1時，即定為陽性反應。結果如表1所示，第6周時，接種DNA疫苗的大鼠體內均可檢測出針對不同靶滴度不一的相應抗體。表1Elisa法檢測大鼠血清抗體滴度的結果LINGO-1TN-RNeurocantableseeoriginaldocumentpage8(3)體外實驗評價免疫後動物血清生物學效用以出生後7-9天大鼠背根神經節神經元為軸突再生評價實驗的研究對象。採用100iig/ml多聚賴氨酸(PLL)包被24孔板，清洗後備用。PBS或者100ngMAG-Fc塗布於孔板中。分離出的背根神經節神經元在添加或者未添加抗血清的培養基重懸後，以105細胞/ml的密度接種於已包被PLL或者PLL+MAG-Fc的24孔板中。細胞培養24h後，4%多聚甲醛固定，使用Neulucida系統測量不同幹預條件下100個神經元的再生軸突的長度。該體外實驗重複3次，每個幹預條件設立2復孔。上述實驗中，所述抗血清是指經本發明DNA疫苗免疫過的小鼠的血清。結果如圖5所示，與接種於多聚賴氨酸基質(PLL)相比較，接種於MAG-Fc的背根神經節神經元軸突生長被顯著抑制(12.64±1.28iimVS28.53±1.53ym，P<0.01)，而培養基中添加抗血清可部分削弱MAG-Fc對背根神經節神經元軸突生長的抑制作用(18.32±1.14iimVS28.53±1.53iim，P8〈170>PatentInversion3.3〈210>1〈211>45〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>1cgggatcc朋ggagatectt朋catgctggaccteggc朋g朋cc〈210>2〈211>29〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>2tccccgcggccaccagctggatctcctgc〈210>3〈211>29〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>3tccccgcggcatgtccatgtgccagttea4〈211>28〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>4ttgcggccgctggaggggcaactgctga28〈210>5〈211〉31〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>5ttgcggccgcaccctgtgagaacaacccttg31〈210>632〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>6gcctcgagtcagcagacaatttggggcctgtc32〈210>7〈211>2151〈212〉DNA〈213〉人工序列〈220〉〈221>CDS〈222>(1)..(2151)〈400>7atgctggacetaggcaagaaccgcateaaaacgetcaaccaggacgag48MetLeuAspLeuGlyLysAsnArglieLysThrLeuAsnGinAspGlu151015ttcgccagettcccgC3Cctggaggagctggagetc朋cgag朋cate96PheAlaSerPheProHisLeuGluGluLeuGluLeuAsnGluAsnlie202530gtgagegccgtggagcccggcgccttcetcttcaacetcegg144ValSerAlaValGluProGlyAlaPheAsnAsnLeuPheAsnLeuArg354045acgctgggtetccgcage朋ccgcctgaagetcateccgcteggcgtc192ThrLeuGlyLeuArgSerAsnArgLeuLysLeulieProLeuGlyVal505560ttcactggcetcage朋cctg3CC朋gctggacateagegag朋c朋g240Phe／hrGlyLeuSetAShLeu／hrLysLeuAspIleSetGluAShLysatCgttatCCtactggactaCatgtttcaggacctgtaCaaCCtCaag288IleValIleLeuLeuAsp／yrMetPheGlnAspLeu／yrAShLeuLys859095tCactggaggttggcgacaatgacCtCgtctaCatCtCtCaCcgcgcc336SetLeuGluValGlyAspAShAspLeuVal／yrIleSetHiSArgAla100105110ttCagcggcCtCaaCagcctggagcagctgacgctggagaaatgcaaC384PheSetGlyLeuAShSetLeuGluGlnLeu／hrLeuGluLysCysASh115120125Leu／hrSetIlePro／hrGluAlaLeuSetHiSLeuHiSGlyLeuIle130135140gtcctgaggCtCcggCaCCtCaaCatCaatgccatCcgggactaCtCC480ValLeuArgLeuArgHiSLeuAShIleAShAlaIleArgAsp／yrSet145150155160ttCaagaggctgtaCcgaCtCaaggtcttggagatCtCCCaCtggCCC528PheLysArgLeu／yrArgLeuLysValLeuGluIleSetHiS／rioPro165170175taCttggacaCCatgaCaCCCaaCtgcCtCtaCggcCtCaaCctgacg576180185190tCCctgtCCatCaCaCaCtgcaatctgaCCgctgtgCCCtaCctggcc624SetLeuSetIle／hrHiSCysAShLeu／hrAlaValPro／yrLeuAla195200205gtccgcCaCCtagtctatCtCcgcttCCtCaaCCtCtCCtaCaaCCCC672ValArgHiSLeuVal／yrLeuArgPheLeuAShLeuSet／yrAShPro2lo215220atCagcaCCattgagggctCCatgttgCatgagctgCtCcggctgcag720IleSet／hrIleGluGlySetMetLeuHiSGluLeuLeuArgLeuGlngagatCcagctggtggccgcggcatgtCCatgtgccagttCagcccag768GluIleGlnLeuValAlaAlaAlaCysProCysAlaSetSetAlaGln245250255gtgctgcaggagctgctgagccggatCgagatgctggagagggaggtg816ValLeuGlnGluLeuLeuSetArgIleGluMetLeuGluArgGluVal260265270tcggtgctgcgagaccagtgcaaCgccaaCtgctgcCaagaaagtgct864SerValLeuArgAspGinCysAsnAlaAsnCysCysGinGluSerAla275280285gccc朋ctgg￡lCtatatecctcactgcagtggccacggcaac912AlaThrGlyGinLeuAspTyrlieProHisCysSerGlyHisGlyAsn290295300tttagetttgagtectgtggctgcatetgcaacgaaggctggtttggc960PheSerPheGluSerCysGlyCyslieCysAsnGluGlyTrpPheGly305310315320朋g朋ttgctcggagccctactgcccgctgggttgctecageeggggg1008LysAsnCysSerGluProTyrCysProLeuGlyCysSerSerArgGly325330335gtgtgtgtggatggcCElgtgcatetgtgacagegaatecageggggat1056ValCysValAspGlyGinCyslieCysAspSerGluTyrSerGlyAsp340345350g￡lCtgttecg朋etceggtgcCC3acagactgcagetecegggggetc1104AspCysSerGluLeuArgCysProThrAspCysSerSerArgGlyLeu355360365tgcgtgg￡lCggggagtgtgtctgtgaagagccctecactggcgaggac1152CysValAspGlyGluCysValCysGluGluProTyrThrGlyGluAsp370375380tgc￡lggg朋ctg￡iggtgccctggggactgttcggggaagggg卿tgt1200CysArgGluLeuArgCysProGlyAspCysSerGlyLysGlyArgCys385390395400gcc朋cggt3CCtgtttatgcgaggagggctecgttggtgaggactgc1248AlaAsnGlyThrCysLeuCysGluGluGlyTy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編碼LINGO-l的LRR結構域的基因片段的5'端引入啟動密碼子，②分別在編碼LINGO-l的LRR結構域的基因片段和TN-R的EGFL結構域的基因片段的3'端分別引入編碼三個丙氨酸的DNA序列，③在編碼neurocan的1011-1271個胺基酸的基因片段的3'端引入終止密碼子；(2)將經步驟(1)改造的LINGO-l的LRR結構域的基因片段、TN-R的EGFL結構域的基因片段以及neurocan的1011-1271個胺基酸的基因片段依次克隆到真核表達載體中。全文摘要本發明提供了一種促進中樞系統神經再生及功能恢復的DNA疫苗，該疫苗由抗原基因和真核表達載體構成；所述的抗原基因是由編碼LINGO-1的LRR結構域的基因片段、編碼TN-R的EGFL結構域的基因片段以及編碼neurocan的1011-1271個胺基酸的基因片段依次線性連接構成的融合基因，各基因片段之間通過編碼三個丙氨酸的DNA序列連接。本發明DNA疫苗可表達LINGO-1的LRR結構域、TN-R的EGFL結構域和neurocan的第1011-1271個胺基酸的融合蛋白，可刺激人體產生多種神經再生抑制因子的抗體，對抗軸突生長抑制因子的活性，為中樞系統神經再生和功能恢復提供良好的微環境。文檔編號A61K39/00GK101716338SQ200910224889公開日2010年6月2日申請日期2009年11月26日優先權日2009年11月26日發明者呂俊,姜曉丹,張世忠,徐如祥,柯以銓,段傳志,王清華申請人:南方醫科大學