檢測登革病毒及其分型的引物、探針及方法
2023-05-15 05:44:51
檢測登革病毒及其分型的引物、探針及方法
【專利摘要】本發明公開了一種檢測登革病毒及其分型的引物、探針及方法，屬於生物檢測、生物化學領域，採用的技術方案是，提供一種檢測登革Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型病毒及其分型的方法並提供該方法所用的引導登革病毒基因反轉錄的引物SEQIDNo：1-4、擴增登革病毒目的片段的引物SEQIDNo：5-12及檢測登革病毒的探針SEQIDNo：13-16。本發明的有益效果是：（1）針對不同血清型登革病毒分別設計特異性引物、探針序列，擴增效率及靈敏度、及準確性高；（2）多重反轉錄聚合酶鏈反應結合液相晶片，具有通量大，特異性及靈敏度高，結果穩定，重複性好，並且操作簡單，檢測速度快，能夠對登革病毒進行快速分型檢測。
【專利說明】檢測登革病毒及其分型的引物、探針及方法
【技術領域】
[0001]本發明屬於生物檢測、生物化學領域，具體涉及一種快速檢測登革病毒及其四種血清分型的方法，提供特異性引物和探針。
【背景技術】
[0002]登革熱是登革病毒感染引起，由蚊媒傳播的急性傳染病，是世界上分布最廣、發病最多的蟲媒病毒病。臨床表現為高熱、頭痛、肌肉、骨關節劇烈酸痛、皮疹、淋巴結腫大、白細胞計數減少等，廣泛流行於熱帶和亞熱帶地區的，以與中國接壤的東南亞國家最為嚴重。隨著境外旅遊、商務的發展，人口流動性增加，缺乏有效疫苗及治療措施，登革熱已經成為世界性的嚴重公共衛生問題。因此需要快速、靈敏的方法用於在感染過程中的早期對登革熱感染進行檢測以進行更好的進行病人管理。[0003]在對登革病毒檢測方面，目前主要有病毒分離、血清學檢測和分子生物學檢測等方法。但這些方法或多或少存在一些缺陷:病毒分離不僅對樣本有嚴格的要求，在技術上要求高，且獲得病原學診斷結果至少需要I周，無法實現早期診斷病例的目的。而用血清免疫學方法檢測病毒的特異性抗體時，不僅需分別在患者感染的急性期及恢復期採集雙份血清，並且還存在與其他黃病毒之間存在交叉反應。在核酸檢測方法方面，RT-PCR方法及螢光PCR方法等的靈敏度高，特異性好，適合於快速檢測鑑定，但大多方法基於單一血清型，在對臨床樣本進行檢測時，無法對樣本同時進行四種血清型檢測，但仍然存在通量低的缺點。
[0004]對於分子實驗室中大量樣本的常規檢測，研究者正致力於開發和建設以多重快速檢測為目標的檢測平臺，典型的高通量多重分析技術包括生物晶片、毛細電泳和質譜等，由於其能在同一反應容器中同時檢測多個核酸序列，因此在節約時間、勞動和成本方面更具有優勢，是高通量、特異、可靠、快速和經濟的核酸檢測方法。
[0005]基於微球的液相晶片技術，提供了一個新的應用面廣泛的高通量核酸檢測平臺。它包含有直徑5.6μπι的聚苯乙烯微球，其內部染有兩種可以進行光譜區分的螢光染料。精確控制兩種螢光染料的量，可獲得具有特異螢光編碼的100種不同微球組。每種微球表面都可以修飾上不同的反應物。因為可以根據微球的特異螢光編碼來區分不同的微球組，所以可以將它們混合在一起，在同一個反應容器中同時檢測高達100種不同的分析物。在報告分子上還耦合有第三種螢光用於定量分析發生於微球表面的生物分子間的相互作用。微球在高速液流中經由液相晶片分析儀的兩個獨立雷射進行分別檢測。一個635nm、10mW的紅色二極體雷射激發微球上的兩種螢光，另一個532nm、13mW的釔鋁石榴石(YAG)雷射激髮結合在微球表面的報告分子的螢光(R-藻紅蛋白，Alexa532，或Cy3)。高速數位訊號處理器根據螢光編碼地址對微球進行分類並定量微球表面的反應。每秒檢測數千個微球的能力使該分析系統可以在數秒內對同一反應容器中的每個樣品同時分析和報告高達100個不同的反應。與其它檢測方法相比，基於液相晶片技術的檢測平臺具有需標本量少、高通量檢測；高速度、低成本；靈敏度高、有重複性好、線性範圍廣、操作簡便等優點。
[0006]綜上所述，採用多重PCR技術聯合液相晶片技術，對登革病毒進行分型檢測，不失為一種直觀、準確、快速、適合早期診斷的檢測手段。然而，現有的登革熱病毒體外檢測試劑盒或提供的引物、探針，或特異性和靈敏性較低，或存在假陽性結果，或檢測步驟繁瑣、檢測條件設置複雜，因此，設計檢測步驟簡單、成本低、靈敏度及特異性高的方法及特異性及靈敏度高、且有利於實驗條件設置的引物、探針，對提高檢測登革病毒及其分型的方法的穩定性、準確性和實用性有重要意義，成為目前一直需要改進的問題之一。
【發明內容】
[0007]本發明要解決的技術問題是提供檢測登革病毒及其分型的引物、探針及方法，利用聚合酶鏈反應(PCR)結合核酸雜交技術，進一步利用多重反轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)結合液相晶片技術對登革病毒及其分型進行特異性檢測。
[0008]為解決上述問題，本發明首先提供用於引導登革病毒基因反轉錄的引物，所述引物至少包括如下一條:
用於引導登革I型病毒基因反轉錄的引物DV1-RTP，其序列為SEQ ID No:l所示； 用於引導登革II型病毒基因反轉錄的引物DV2-RTP，其序列為SEQ ID No:2所示； 用於引導登革III型病毒基因反轉錄的引物DV3-RTP，其序列為SEQ ID No:3所示； 用於引導登革IV型病毒基因反轉錄的引物DV4-RTP，其序列為SEQ ID No:4所示。
[0009]第二，本發明還提供用於擴增登革病毒目的片段的引物，所述引物至少包括如下一對:
用於擴增登革I型病毒目的片段的引物對DVl-F和DV1-R，其序列分別為SEQ ID No:5 和 SEQ ID No:6 ；
用於擴增登革II型病毒目的片段的引物對DV2-F和DV2-R，其序列分別為SEQ ID No:7 和 SEQ ID No:8 ；
用於擴增登革III型病毒目的片段的引物對DV3-F和DV3-R，其序列分別為SEQ ID No:
9和 SEQ ID No:10 ；
用於擴增登革IV型病毒目的片段的引物對DV4-F和DV4-R，其序列分別為SEQ ID No:11 和 SEQ ID No:12 ；
第三，本發明還提供用於檢測登革病毒分型的探針，所述探針包括如下1:至$中的至少一種:
Φ用於檢測登革I型病毒的探針，其序列為SEQ ID NO:13所示；:S用於檢測登革II型病毒的探針，其序列為SEQ ID NO:14所示；
%用於檢測登革III型病毒的探針，其序列為SEQ ID NO:15所示；
Φ用於檢測登革IV型病毒的探針，其序列為SEQ ID NO: 16所示。
[0010]最後，本發明還提供一種檢測登革病毒及其分型的方法，所述方法包括如下步驟:
1)合成上述用於擴增登革病毒目的片段的引物和用於檢測登革病毒的探針，並對探針分別標記；
2)提取待測樣品RNA，反轉錄形成cDNA模板；
3)以步驟I)所述引物對cDNA模板進行PCR擴增，得PCR擴增產物；4)將PCR擴增產物與步驟I)中合成的探針雜交，得雜交產物；
5)檢測雜交信號並分析結果。
[0011]優選的，所述步驟I)合成引物後，對每對引物中的下遊引物在5』端進行生物素標記；所述對探針的標記為對所有探針在5』端進行胺基化修飾，連接C12鄰接臂序列，並與相應螢光編碼的微球偶聯，然後將偶聯有不同探針的微球混合，製成探針微球組；所述步驟4)PCR擴增產物與探針雜交後，對雜交產物進行抗鏈黴素藻紅蛋白(英文全稱Streptavidin-R-phycoerythrin,縮寫SA-PE)標記，得微球-探針-PCR產物-生物素-SA-PE的複合物；所述步驟5)對雜交信號的檢測採用液相晶片系統。
[0012]更優選的，所述步驟I)探針微球組中偶聯有不同探針的微球個數相等。
[0013]所述步驟5)對雜交信號的檢測採用Bio-Plex? 200檢測系統。
[0014]另外，步驟2)反轉錄形成cDNA時優選採用SEQ ID NO:1-4所示的用於引導登革病毒基因反轉錄的引物。
[0015]所述步驟3) PCR擴增採用不對稱擴增，PCR體系中下遊引物濃度為上遊引物濃度的3-6倍。
[0016]上述方法中，I)首先根據檢測目的合成SEQ ID NO:5_12所示引物中的一對或多對及SEQ ID NO:13-16所示探針中的一個或多個，即如要檢測登革I型病毒，則合成用於擴增登革I型病毒目的片段的引物對DVl-F和DV1-R，其序列為SEQ ID No:5和SEQ ID No:6，同時對應合成用於檢測登革I型病毒的探針，其序列為SEQ ID NO: 13所示；如要檢測登革II型及登革III型病毒，則合成用於擴增登革II型及登革III型病毒目的片段的引物對DV2-F和 DV2-R、DV3-F 和 DV3-R，其序列分別為 SEQ ID No:7 和 SEQ ID No:8、SEQ ID No:9 和 SEQID No: 10，同時對應合成用於檢測登革II型及登革III型病毒的探針，其序列為SEQ ID NO:14和SEQ ID NO: 15所示，其他合成方式類似上述，合成完畢後對不同種類探針進行標記以便於區分和檢測；2)提取待測樣品RNA採用本領域常用技術手段，加入引物使所提取的RNA序列反轉錄形成cDNA模板。其中，反轉錄弓丨物優選的採用本發明提供的引物，其序列為SEQ IDNO:1-4所示，可特異性引導登革病毒基因反轉錄的引物從而進行多重反轉錄反應；3)對應選取上述用於PCR擴增的引物以cDNA為模板進行擴增，得PCR擴增產物；4)將PCR擴增產物與探針在設定條件下進行雜交反應；5)根據探針標記檢測雜交結果並分析。
[0017]基於上述方法，本發明優選多重不對稱PCR擴增結合液相晶片技術以檢測登革病毒及其分型。以檢測登革病毒的四個分型為例，具體步驟如下:1)合成SEQ ID No:1-4所示的用於引導登革病毒基因反轉錄的引物、SEQ ID No:5-12所示擴增登革病毒目的片段的引物、及SEQ ID No:13-16所示用於檢測登革病毒分型的探針，其中，用於PCR擴增反應的所有下遊引物序列在5』端進行生物素標記以利於後期信號標記，所有探針在5』端均進行胺基化修飾且連接C12鄰接臂序列，然後與相應螢光編碼的微球偶聯，將偶聯有不同探針的微球等個數混合製成探針微球組；2)提取待測樣本RNA，以SEQ ID No:1_4所示引物進行多重反轉錄反應，得cDNA模板；3)以步驟I)中用於PCR擴增的引物對cDNA模板進行多重不對稱PCR擴增反應，得PCR擴增產物；優選的，擴增體系中所加入下遊引物的濃度為上遊引物濃度的3-6倍，以增加目的片段的產量；4)將步驟3)所得PCR擴增產物與探針微球組在設定條件下進行雜交反應，得雜交產物，進一步對雜交產物進行抗鏈黴素藻紅蛋白(英文全稱Streptavidin-R-phycoerythrin,縮寫SA-PE)標記,形成微球-探針-PCR產物-生物素-SA-PE的複合物；上述所稱的雜交是指PCR產物變性後與偶聯有不同探針的微球組充分混合，並在一定的溫度條件下進行核酸單鏈間互補配對雜交的過程；5)取微球-探針-PCR產物-生物素-SA-PE複合物以液相晶片系統優選Bio-Plex? 200檢測其雜交信號，並根據本發明所提供標準進行結果分析及判定。本發明所述的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法，所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。
[0018]本發明的有益效果是:(I)針對四種血清型登革病毒，對RNA特異基因進行特異性反轉錄反應，增加了病毒檢測的特異性，減少了後期PCR擴增中非特異序列對擴增的影響，提1?擴增效率，具有較1?的靈敏度；(2)用於PCR擴增的特異基因序列的引物，都有很1?的靈敏度，提高了檢測的準確性；(3)針對不同血清型別登革病毒的特異性探針序列，鹼基成分合理，具有比較均一的Tm值，探針與PCR產物的雜交溫度條件基本一致，有利於同一溫度下雜交的同步性，提高檢測的準確性；(4)本發明的方法利用多重反轉錄聚合酶鏈反應結合液相晶片，具有通量大，特異性及靈敏度高，結果穩定，重複性好，並且操作簡單，檢測速度快，能夠對登革病毒進行快速分型檢測。
【具體實施方式】
[0019]下面結合具體實施例詳細說明本發明，但不以任何形式限制本發明。實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。所用的材料、試劑、及所合成的引物和探針序列等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。
[0020]實施例1:引物、探針序列的設計及合成
從Genebank中搜索登革病毒祀基因nonstructural protein NS5的序列，運用相關生物信息學軟體進行同源性分析和序列比對分析，篩出高度保守區域，針對保守序列釆用引物設計軟體Primer Premier 5進行引物及探針的設計；引物及探針設計完畢後使用NCBI BLAST進行特異性的檢驗，並使用Primer premier 5檢測是否有髮夾結構或者二聚體形成，結果表明設計探針滿足特異性要求，且不會形成髮夾結構或者二聚體。所設計的引物、探針序列見表1。
[0021 ] 表1檢測登革病毒及其分型的引物、探針 _
【權利要求】
1.用於引導登革病毒基因反轉錄的引物，其特徵在於所述引物至少包括如下一條: 用於引導登革I型病毒基因反轉錄的引物DV1-RTP，其序列為SEQ ID No:1所示； 用於引導登革II型病毒基因反轉錄的引物DV2-RTP，其序列為SEQ ID No:2所示； 用於引導登革III型病毒基因反轉錄的引物DV3-RTP，其序列為SEQ ID No:3所示； 用於引導登革IV型病毒基因反轉錄的引物DV4-RTP，其序列為SEQ ID No:4所示。
2.用於擴增登革病毒目的片段的引物，其特徵在於所述引物至少包括如下一對: 用於擴增登革I型病毒目的片段的引物對DVl-F和DV1-R，其序列分別為SEQ ID No:5 和 SEQ ID No:6 ； 用於擴增登革II型病毒目的片段的引物對DV2-F和DV2-R，其序列分別為SEQ ID No:7 和 SEQ ID No:8 ； 用於擴增登革III型病毒目的片段的引物對DV3-F和DV3-R，其序列分別為SEQ ID No:9 和 SEQ ID No:10 ； 用於擴增登革IV型病毒目的片段的引物對DV4-F和DV4-R，其序列分別為SEQ ID No:11和 SEQ ID No:12o
3.用於檢測登革病毒分型的探針，其特徵在於所述探針包括如下Φ至i中的至少一種: I用於檢測登革I型病毒的探針，其序列為SEQ ID NO:13所示； %用於檢測登革II型病毒的探針，其序列為SEQ ID NO:14所示； I用於檢測登革III型病毒的探針，其序列為SEQ ID NO: 15所示； I用於檢測登革IV型病毒的探針，其序列為SEQ ID NO: 16所示。
4.一種檢測登革病毒及其分型的方法，其特徵在於所述方法包括如下步驟: 1)合成權利要求2所述引物及權利要求3所述探針，並對探針分別標記； 2)提取待測樣品RNA，反轉錄形成cDNA模板； 3)以步驟I)所述引物對cDNA模板進行PCR擴增，得PCR擴增產物； 4)將PCR擴增產物與步驟I)中合成的探針雜交，得雜交產物； 5)檢測雜交信號並分析結果。
5.根據權利要求4所述的一種檢測登革病毒及其分型的方法，其特徵在於: 所述步驟1)合成引物後，對每對引物中的下遊引物在5』端進行生物素標記；所述對探針的標記為對所有探針在5』端進行胺基化修飾，連接C12鄰接臂序列，並與相應螢光編碼的微球偶聯，然後將偶聯有不同探針的微球混合，製成探針微球組； 所述步驟4) PCR擴增產物與探針雜交後，對雜交產物進行SA-PE標記，得微球-探針-PCR產物-生物素-SA-PE的複合物； 所述步驟5)對雜交信號的檢測採用液相晶片系統。
6.根據權利要求5所述的一種檢測登革病毒及其分型的方法，其特徵在於:所述步驟I)探針微球組中偶聯不同探針的微球個數相等。
7.根據權利要求5所述的一種檢測登革病毒及其分型的方法，其特徵在於:所述步驟5)對雜交信號的檢測採用Bio-Plex? 200檢測系統。
8.根據權利要求4或5所述的一種檢測登革病毒及其分型的方法，其特徵在於:步驟2)反轉錄形成cDNA時採用權利要求1所述的引物。
9.根據權利要求4或5所述的一種檢測登革病毒及其分型的方法，其特徵在於:所述步驟3) PCR擴增採用不對稱擴增，PCR體系中下遊引物濃度為上遊引物濃度的3-6倍。
10.根據權利要求4所述的一種檢測登革病毒及其分型的方法，其特徵在於:所述步驟4)雜交反應的條件為96°C變性5 分鐘，55°C雜交30分鐘。
【文檔編號】C12Q1/70GK103898240SQ201410131592
【公開日】2014年7月2日 申請日期:2014年4月3日 優先權日:2014年4月3日
【發明者】韓偉, 史玲莉, 閆冀煥, 李雲, 滑娜, 沈軍, 吳志茹, 蘭景, 李薇, 付曉昀 申請人:河北國際旅行衛生保健中心