基因表達的靶向調節的製作方法

2023-05-15 06:20:06 2

專利名稱：基因表達的靶向調節的製作方法
技術領域：
本發明涉及利用設計成靶向特定核酸序列的snoRNA分子或snoRNA樣分子或片段 來調節基因表達的方法。本發明還涉及用於基因表達的靶向調節的修飾的snoRNA分子和修飾的snoRNA樣 分子和片段。
背景技術：
小核仁RNAs (snoRNAs)包括存在於所有真核細胞中的核RNAs家族。snoRNAs集中 在細胞核中，特別是集中在核仁中，在核仁中它們在核糖體亞基合成過程中作用於修飾核 糖體RNA (rRNA)或另外參與rRNA的加工。存在兩種主要種類的snoRNAs，即盒C/D snoRNAs 和盒H/ACAsnoRNAs，其分別參與2 『 -0-核糖甲基化和假尿苷修飾(評論見Boisvert等人， 2007，Kiss 等人，2002 和 2006)。SnoRNAs在體內作為RNA-蛋白複合體(snoRNPs)起作用，在該情形中RNA結構部 分作用為使鹼基與rRNA前體配對的指導RNA，或者將修飾位點定向於rRNA上的特定序列 (在盒C/D與盒H/ACA snoRNAs的情形中)或作為分子伴侶來輔助新生rRNA前體的成熟 (例如 U3 snoRNA)。盒C/D snoRNAs依據在作用為一組盒C/D蛋白的結合位點的這一亞家族中常見的 RNA基序而命名，所述一組盒C/D蛋白包括N0P56，N0P58，TIP48，TIP49，15. 5K和高度保守的 蛋白纖維蛋白，所述纖維蛋白具有特異性2-0-甲基化酶活性。盒C/D snoRNA與幹II和盒 D區5'緊接的區域包含與rRNA上特定位點互補的『指導』序列，其指導纖維蛋白2' -0-甲 基酶在與指導RNA區互補的rRNA序列內所需要的核糖殘基的2' -0H位置上添加甲基。已 經表明類似的功能從酵母一直到哺乳動物細胞都起作用。由於保守的序列組件，所以可以 利用基因組DNA序列信息來預測人盒C/D snoRNA家族的成員，並通過計算分析來預測其在 rRNA上的推定2' -0-甲基化靶位點。然而，迄今為止，在人類的情形中，並不是所有這些 種類都通過直接的實驗鑑定或驗證過。除了 rRNA的修飾之外，對於某些盒C/D snoRNAs已經提議了兩種另外的功能。第 一，據認為一些家族成員針對其它非核糖體RNAs上的2' -0-核糖基團的甲基化，所述其 它非核糖體RNAs包括小核RNAs，其是核前mRNA剪接機制的亞基。這基本上是與對於rRNA 所觀察的相同的修飾反應，但是由於其所包含的指導RNA序列而針對不同的RNA底物。第 二，據報導，盒 C/D snoRNA 家族的一個成員(HBII-52) (S. Kishore 和 S. Stamm, 2006)作用 為可變剪接因子，其可以對剪接位點的選擇產生改變，影響編碼5-羥色胺受體2C的6外顯 子神經元-特異性轉錄體中的外顯子5。在這一情形中，所涉及的機制是未知的，且還不清 楚HBII-52snoRNA是否也參與rRNA的修飾或者其是否定位於核仁。對於能夠控制基因表達已經研究了很多年，並且多種技術是已知的，均具有優點 和缺點。例如，RNAi技術是本領域公知的。「RNAi"是指在動物和植物中由雙鏈RNA起 始的序列特異性轉錄後基因沉默的過程，所述雙鏈RNA與靶RNA的區域相同且引起其降 解(例如，參見 W09932619，W00129058 和 Tuschl Chem Biochem.(化學和生物化學)2 239-245(2001))。然而，存在與RNAi技術相關的問題，不僅是人們必須利用化學手段合成 所述分子的成本問題。此外，當利用遺傳方法製備RNAi分子時，可能難以適當地產生該 分子。此外，為了產生多於一種RNAi分子以靶向相同或不同的靶序列，僅僅增加了前述 問題。在獲得靶向基因的高效擊倒中，特別是在不產生其它基因的不需要的「非靶向(off target) 」擊倒中，也產生使用RNAi的問題。因此，基因沉默或表達調節的其它或備選方法將是需要的。本發明的目的是消除 和/或減輕上述缺點中的至少一種。發明概述本發明部分基於本發明人對snoRNAs的研究和下述鑑定，即，snoRNA序列的一部 分可以用靶特異性核酸序列取代，以形成修飾的snoRNA，當所述修飾的snoRNA加入細胞 時，其或其片段能夠調節包括所述靶特異性核酸序列的基因的表達。在第一方面中，提供了調節靶核酸表達的方法，所述方法包括在使snoRNA和/ 或其片段能夠與靶核酸的一部分雜交的條件下使所述核酸與snoRNA相接觸；且其中所述 snoRNA或其片段與所述核酸部分的雜交調節所述靶核酸的表達和/或功能或者對所述靶 核酸的表達和/或功能產生調節。所述snoRNA可以是天然snoRNA分子，或者其可以是修 飾的snoRNA分子，如下文進一步所述。還提供了用於調節靶核酸表達的修飾的snoRNA序列，所述修飾的snoRNA序列包 括基本上與靶核酸序列的一部分互補的核酸序列，其用於與所述靶核酸部分雜交且調節所 述核酸的表達。應該理解，所述修飾的snoRNA分子與本領域已知的天然snoRNA分子如分 子HBII-180C不同。一般說來，所述修飾的snoRNA分子基於天然snoRNA分子，如下文所討 論，但是包括特別選擇和引入到所述snoRNA分子中的核酸部分，以與靶核酸部分雜交且調 節其表達。本發明人已經觀察到本發明所述的snoRNA分子能夠下調或者減少靶RNA或蛋白 的表達/功能。不希望受到理論限制，可能的是，所述修飾的snoRNA可以在細胞內進行加 工，以便包括能夠特異性雜交所述靶序列的序列的所述snoRNA分子的片段，可以具有調節 所述靶RNA的表達/功能的作用，儘管表達可以通過結合在特定基因座的DNA進行調節也 是可能的。這樣的序列可以準確地或者高度特異性地對應於在本文所述的天然和修飾的 snoRNAs中存在的序列，其基本上與靶核酸序列如RNA或DNA序列的所述部分互補，或者取 決於所述序列的鹼基組成和G/C含量長度可以更短，如2-10個核苷酸長。原則上，所述互 補區長度將足夠長，且是這樣的序列，即其足以提供通過已知的互補鹼基配對原理特異性 結合所述靶RNA。本發明的snoRNA分子可以基於所謂的盒C/D-snoRNA或盒H/ACA-snoRNA。優選的 snoRNAs 基於盒 C/D-snoRNA。當用於本文時，短語"snoRNA"指通常在細胞的核漿中和/或核仁中合成和/或 起作用的小RNA分子。按照優選實施方案，本發明的小核RNA分子是包含盒C/D的snoRNAs。盒C/D snoRNAs的非限制性實例包括L. collosoma b2 (GenBank登記號 AF331656)，L. collosoma B3 (GenBank 登記號 AY046598)，L. collosomaB4 (GenBank 登記 號 AY046598)，L. collosoma B5 (GenBank 登記號 AY046598)，L. collosoma TS1 (GenBank 登 記號 AF331656)，L. collosomaTS2 (GenBank 登記號 AF331656)，L. collosoma g2 (GenBank登記號 AF331656)，L. collosoma snoRNA-2 (GenBank 登記號 AF050095)，T. bruceisnoRNA 92(GenBank 登記號 Z50171，L. tarentolae snoRNA 92(GenBank 登記號 AF016399)， T. brucei TBC4 snoRNA (SEQ ID NO :35)，T. brucei sno270 (GenBank 登記號 Z50171)和人 U14snoRNA (GenBank 登記號 NR_000022)。本發明的修飾的snoRNAs可以包括通常在盒C/D snoRNAs中存在的一種或 多種D/D'盒核酸序列。所述D和/或D'盒是保守核苷酸序列，並且可以由選自例 女口 5 『 -CUGA-3 『，5 『 -AUGA-3 『，5 『 -CCGA-3 『，5 『 -CAGA-3 『，5 『 -CUUA-3 『， 5' -UUGG-3'和5' -CAGC-3'的序列組成。然而，可以考慮其它的修飾和/或衍生物。本發明的修飾的snoRNAs還可以包括與28S rRNA互補的序列和/或盒C序列。所 述與28S rRNA互補的序列長度可以為5_15個核苷酸，如8_12個核苷酸，特別是10個核苷 酸，但是該rRNA互補區還可以在不妨礙活性的前提下突變且基本或完全去除與rRNA的互 補性(complentarity)。典型地，與28S rRNA互補的序列可以與28S rRNA序列的鹼基3680 處或其附近的核苷酸(編號依據 Lestrade，L.，和 Weber，M. J. (2006). snoRNA-LBME-db, a comprehensive database of human H/ACA and C/Dbox snoRNAs(snoRNA-LBME-db,人 H/ACA 和 C/D 盒 snoRNAs 的完全資料庫).Nucleic Acids Res (核酸研究)34，D158-162.) 互補，如在3670-3690附近，例如，3677-3686。所述盒C序列長度典型地為5_9個核苷酸， 如7個核苷酸，且可以包括序列AUGAUGU或其一部分。典型地，當存在時，盒C序列位於與 rRNA互補或與snoRNA的其它生理學RNA靶互補的序列的5'處，所述序列位於盒D'序列 的5'，所述盒D'序列位於基本上與所述靶核酸序列的所述部分互補的核酸序列的5'。 優選地，在盒C序列，與rRNA互補的序列、盒D'序列和/或基本上與靶核酸序列的所述部 分互補的核酸序列之間僅發現1-3個核苷酸鹼基，如1個核苷酸鹼基。與盒D'序列相同或 不同的盒D序列可以位於基本與靶RNA序列的所述部分互補的核酸序列的3'處。所述盒 D序列可以位於基本與靶核酸序列的所述部分互補的核酸序列的3'鹼基的20-30個核苷 酸3'，如24-28個核苷酸，特別是26個核苷酸的下遊處。本發明的修飾的snoRNA分子還包括至少一個能夠靶向靶核酸序列並與其雜交的 序列。基於本文所述的工作，本發明人鑑定了 snoRNA分子HB II-180C，其包括緊接盒D' 序列下遊的序列，其與由人成纖維細胞生長因子3 (FGFR3)轉錄的前mRNA的內含子17中存 在的21個核苷酸的序列高度互補。通過將該序列改變為被設計成與特定靶基因序列互補 的不同序列，所述特定靶基因可以是內含子或外顯子序列，本發明人已經能夠調節需要的 靶基因的表達。典型地，基本與靶核酸序列的所述部分互補的核酸序列長度為15-45個核苷酸， 如17-30個核苷酸，但是取決於序列和鹼基組成，所述長度可以更長。「基本」互補意指在靶 核酸序列和設計為與所述靶核酸雜交的snoRNA分子序列之間不必存在精確的互補性。然 而，應該理解，應該存在高度的同一性，所述同一性典型地大於90或95%，這足以確保依據 已知的RNA或DNA/RNA鹼基配對法則的特異性結合。因此，典型地，取決於互補區的長度和 G/C含量，可以允許在兩個序列之間存在至多僅1-3個錯配。所述靶核酸序列可以是RNA序 列，典型地為mRNA，tRNA, mi RNA或rRNA序列，或RNA病毒基因組序列或源於其的轉錄體，特 別是mRNA序列。在靶核酸序列內，所述互補區可以存在於內含子內、或外顯子內、或特別存 在於內含子-外顯子連接處，但是也可以位於5'或3'非翻譯區。
應該理解，多於一種設計為與靶核酸分子雜交的序列可以存在於本發明的修飾的 snoRNA分子中。當存在多於一種所述序列時，可以設計不同的「靶向」序列以靶向同一靶核 酸分子的不同部分、或不同的靶核酸分子。在另一個方面中，還提供了能夠表達本發明所述的至少一種snoRNA分子的核酸 構建體。典型地，所述核酸構建體包括至少兩個側連內含子核酸區的外顯子核酸區，所述 內含子核酸區能夠編碼本發明所述的snoRNA。最理想地，所述核酸構建體可以包括側連兩 個以上內含子序列的多個外顯子序列，所述內含子核酸區包括能夠編碼一個以上本發明所 述的snoRNAs的序列。所述構建體可以作為單一構建體形成，其在靶細胞內轉錄時引起與 所述外顯子序列對應的且剪除所述內含子序列的mRNA的產生，且隨後產生本發明所述的 snoRNA(s)。在使用多於一種內含子序列來產生多於一種本發明的snoRNA序列的情形中，可 以設計每個snoRNA靶向相同或不同的靶RNA分子。預計熟練的技術人員(addressee)非常熟悉內含子和外顯子由什麼組成，但是處 於輔助目的提供下述內含子是插入在在最終mRNA產物中表達、通常編碼蛋白的DNA區域的部分或「外 顯子」之間的真核DNA的部分。內含子和外顯子轉錄為稱為「一級轉錄體，mRNA前體」(或 「前mRNA」)的RNA。內含子必須從前mRNA去除，以便可以產生由外顯子編碼的天然蛋白 (術語"天然蛋白"用在本文中指天然存在的、野生型、突變的或功能蛋白)。內含子從前 mRNA的去除以及隨後的外顯子的連接在剪接過程中進行。剪接過程實際上是由剪接因子介導的一系列反應，其在轉錄之後但是在翻譯之前 在RNA上進行。因此，「前mRNA"是包含外顯子和內含子二者的RNA，「 mRNA"是這樣 的RNA，其中已經去除內含子且隨後外顯子連接在一起從而蛋白可以由該RNA通過核糖體 進行翻譯。內含子定義為一組「剪接組件」，其是相對較短、保守的RNA區段，其結合進行剪接 反應的多個剪接因子。因此，每個內含子定義為5'剪接位點、3'剪接位點、和位於之間的 分支點(branch site)。所述核酸構建體還可以包括通常存在於常規核酸載體中且對熟練的技術人員是 公知的常見核酸特徵。例如，所述核酸構建體可以包括用於促進對其中已經轉化或轉染了 所述核酸構建體的細胞的鑑定的選擇標記基因。優選地，所述核酸構建體包括用於促進編 碼所述snoRNA分子的核酸的表達的至少一個啟動子，如本領域已知的組成型或可控型啟 動子。適當的啟動子的實例包括CMV啟動子，T3，T7，SP6，SV40，腺病毒主要晚期啟動子和 熟練的技術人員已知的其它啟動子。所述核酸構建體還可以包括採用天然的、突變或另外標記形式的基因/RNA拷貝， 其設計成替代由所述snoRNA調節的基因/RNA拷貝。可以使用一些方法來在細胞中產生本發明的snoRNA。按照本發明的一個優選實施方案，可以通過向細胞中引入上述能夠表達snoRNA 分子的核酸構建體而產生本發明的snoRNA分子。為了在細胞中表達本發明的snoRNA，將核酸序列連接至核酸構建體中，其包括在編碼snoRNA的核酸序列上遊的啟動子。理想地，所述編碼snoRNA的序列側連在熟練的技 術人員鑑定為外顯子序列和剪接序列的核酸區的任一側，所述剪接序列在轉錄時引起編碼 snoRNA的序列的剪接。適於指導所述核酸序列在例如真核細胞中的轉錄的啟動子包括組成 型或誘導型的啟動子。適用於本發明的組成型啟動子是在大部分環境條件下和大部分細胞類型中有 活性的啟動子序列，如CMV啟動子，SV40啟動子，腺病毒主要晚期啟動子和勞氏肉瘤病毒 (Rous sarcoma virus) (RSV)啟動子。適用於本發明的誘導型啟動子包括，例如，低氧誘導 因子 1 (HIF-1)啟動子(Rapisarda, A.等人，2002. Cancer Res.(癌症研究)62 :4316_24) 和四環素誘導型啟動子(Srour，M. A.，等人，2003. Thromb. Haemost.(凝血和止血)90: 398-495)。本發明的核酸構建體通常包括使得所述構建體適合在原核生物、真核生物、或優 選在二者(例如，穿梭載體)中複製和/或整合的其它序列。典型的克隆載體包含轉錄和 翻譯起始序列(例如，啟動子，增強子)與轉錄和翻譯終止子(例如，多腺苷酸化信號)。在核酸構建體的構建中，啟動子優選位於距離異源轉錄起始位點與其距離其天然 設置的轉錄起始位點大約相同距離處。然而，如本領域已知的，在不丟失啟動子功能的條件 下，可以適應該距離的一些變化。除了已經描述的組件之外，本發明的核酸構建體可以典型地包含其它專門的組 件，其目的是增加克隆核酸的表達水平或促進攜帶重組DNA的細胞的鑑定。例如，許多動物 病毒包含促進病毒基因組在允許的細胞類型中的染色體外複製的DNA序列。攜帶這些病毒 複製子的質粒進行游離型複製，只要由所述質粒攜帶的或宿主細胞基因組具有的基因提供 適當的因子。所述核酸構建體可以或可以不包括真核複製子。如果存在真核複製子，那麼載體 可以利用適當的選擇標記在真核細胞中擴增。如果載體不包括真核複製子，則不可能進行 游離型擴增。相反，重組DNA整合到加工細胞的基因組中，在其中啟動子指導所需核酸的表 達。所述構建體還可以包括位點特異性重組位點，其被設計為使所述核酸構建體靶向細胞 基因組中的特定位點，且當在細胞中存在必需的酶時在該特定位點整合。對於本領域的技 術人員，多種位點特異性重組系統是公知的，包括Cre/Lox，Att/A整合酶，frt/Flp, y 6 解離酶，Tn3解離酶和0C231整合酶(參見Gover等人，2005，其指導熟練的讀者)。本發明的核酸構建體可以用來在哺乳動物細胞(例如，HeLa細胞，Cos細胞)，酵母 細胞(例如，AH109，HHY10，KDY80)，昆蟲細胞(例如，Sf9)，錐蟲細胞(例如，L. collosoma， L. major, T. brucei 29-13)或細菌細胞(例如，JM109, RP437, MM509, SW10)中表達本發明 的多核苷酸。優選地，通過將核酸序列連接至哺乳動物、酵母、錐蟲或細菌表達載體中而合成本 發明的多核苷酸。所述載體的實例包括，但不限於，適用於哺乳動物細胞中的PCDNA3. 1、 pBK-CMB和pCI載體，適用於酵母細胞中的pGBKT7、pLGADH2-lacZ和pBGM18載體，適用於錐 蟲細胞中的pX-neo游離型載體和適用於細菌細胞中的Pack02scKan、pMLBAD、pMLS7載體。按照優選實施方案，優選地構建本發明的核酸構建體用於真核生物表達，最優選 地，用於哺乳動物細胞表達。哺乳動物表達載體的實例包括，但不限於，可從Invitrogen獲得的pcDNA3、pcDNA3. 1(+/")、Pgl3、PzE0sv2(+/_)、pSecTag2、pDisplay、pEF/myc/cyto、pCMV/myc/cyto、 pCR3. 1、pSinR印5、DH26S、DHBB、pNMTl、pNMT41、pNMT81，可從 Promega (普洛麥格)獲得 的 pCI，可從 Stratagene 獲得的 pMbac、pPbac、pBK-RSV 和 pBK_CMV，可從 Clontech 獲得的 pTRES，以及它們的衍生物。也可以使用包含來自真核病毒如反轉錄病毒的調節元件的表達載體。SV40載體包 括pSVT7和pMT2。來源於牛乳頭瘤病毒的載體包括pBV-lMTHA，和來源於埃巴病毒的載體 包括 pHEBO，和 p205。其它示例性的載體包括 pMSG，pAV009/A+, pMT010/A+, pMAMneo_5，杆狀 病毒pDSVE，和在SV-40早期啟動子，SV-40晚期啟動子，金屬硫蛋白啟動子，鼠乳腺瘤病毒 啟動子，勞氏肉瘤病毒啟動子，多角體啟動子，或其它證明有效用於真核細胞中表達的啟動 子的指導下允許蛋白表達的任意其它載體。可以使用多種方法將本發明的核酸構建體引入哺乳動物細胞中。所述方法通常 記述在 Sambrook 等人，Molecular Cloning :A Laboratory Manual (分子克隆實驗室手 冊)，Cold Springs Harbor Laboratory (冷泉港實驗室)，紐約(1989，1992)中，在Ausubel 等人，Current Protocols in MolecularBiology (現代分子生物學方法)，John Wiley 和 Sons, Baltimore, Md. (1989)，Chang 等人，Somatic Gene Therapy (體細胞基因治療)， CRC 出版社，AnArbor, Mich. (1995)，Vega 等人，Gene Targeting(基因靶向)，CRC 出版社， Ann Arbor Mich. (1995), Vectors :A Survey of Molecular Cloning Vectors andTheir Uses (載體分子克隆載體及其應用的研究)，Butterworths，BostonMass. (1988)和Gilboa 等人.[Biotechniques (生物技術)4(6) =504-512,1986]中，並且包括，例如，穩定或瞬時轉 染、脂質轉染法、電穿孔、顯微注射、脂質體、離子電滲療法(iontophoresis)、受體介導的胞 吞作用和用重組病毒載體感染。另外，參見美國專利號5，464，764和5，487，992的陽性-陰 性選擇方法。例如，對於在二氫葉酸還原酶缺陷的中國倉鼠卵巢(CH0 dhfr-)細胞中的穩 定轉染，本發明的表達載體還包括位於胸苷激酶啟動子控制下的二氫葉酸還原酶表達盒。還可以使用病毒載體，如本領域已知的慢病毒(lentivirus)、反轉錄病毒或腺病 毒來源的載體，將本發明的核酸構建體遞送至細胞中。在本發明的另一個方面中，提供用於產生本發明所述的snoRNA分子的核酸載體 構建體，所述構建體在5'至3'方向包括i)用於控制轉錄的啟動子序列；ii)第一外顯子序列；iii)第一內含子剪接序列；iv)用於促進編碼本發明的snoRNA的核酸序列的克隆的克隆位點或序列；v)第二內含子剪接序列；和vi)第二外顯子序列。所述snoRNA可以是天然或修飾的snoRNA分子，如本文所述。應該理解，各種元件通過轉錄連接，這是熟練的技術人員所理解的。載體可以天然 包括如上文所述的其它元件，且可以包括促進載體構建的其它克隆位點。本發明的一個特別的優點是由單一轉錄體提供多個可以靶向相同或不同的靶核 酸序列的snoRNAs的能力。作為使用核酸構建體的備選方案，應該理解，可以使用例如固相合成化學合成作為RNA寡核苷酸的本發明的snoRNA分子。在設計本發明的合成的snoRNA分子、snoRNA樣分子或其片段時，必須考慮一些需要考慮的事項。為了有效地在體內抑制基因表達，所述分子可以理想地滿足下述要求(i) 充分的與靶序列結合的特異性；(ii)在水中的溶解性；(iii)抗細胞內核酸酶和細胞外核 酸酶的穩定性；(iv)透過細胞膜的能力；和(ν)當用於治療生物體時，是低毒性的。未修飾的多核苷酸用於應用可能是不切實際的，原因在於其體內半衰期短，在該期間內其可以被核酸酶迅速降解。此外，其難以在多於毫克量級上製備。另外，所述多核苷 酸是較差的細胞膜滲透劑。為了提供半衰期以及膜滲透性，可以修飾本發明的多核苷酸的多核苷酸主鏈。可以在鹼基、糖或磷酸結構部分修飾多核苷酸。這些修飾包括，例如，使用甲 基磷酸酉旨(methylphosphonates), 一 硫代磷酸(monothiophosphates), 二 硫代磷酸 (dithiophosphates)，氛基 粦酸酉旨(phosphoramidates)， 粦酸酉旨(phosphate esters),橋連 硫代磷酸酯(bridged phosphorothioates),橋連氨基憐酸酉旨(bridged phosphoramidates), 橋連亞甲基磷酸酯(bridged methylen印hosphonates)，具有矽氧烷橋接(siloxane bridges)、碳酸酉旨橋接(carbonate bridges)、羧甲基酉旨橋接(carboxymethyl ester bridges)、碳酸酉旨橋接(carbonate bridges)、羧甲基酉旨橋接(carboxymethyl ester bridges)、乙醯胺橋接(acetamide bridges)、氨基甲酸酯橋接(carbamate bridges)、硫醚 橋接(thioether bridges)、sulfoxy橋接、sulfono橋、異頭(anomeric)橋接和硼烷衍生物 的脫磷酸核苷酸間類似物(d印hospho internucleotide analogs) (Cook, 1991,Medicinal chemistryof antisense oligonucleotides-future opportunities (反義寡核苷酸醫學 化學-未來機遇).Anti-Cancer Drug Design(抗癌藥物設計)6 :585)。優選地，為了使得 本發明的合成多核苷酸具有體內穩定性，可以將在核糖環位置2處的氧分子甲基化，形成 2' -0-甲基化RNA寡核苷酸。國際專利申請WO 89/12060公開了用於合成多核苷酸類似物的多種結構單元，以 及通過以限定順序連接所述結構單元形成的多核苷酸類似物。所述結構單元可以是「剛性 的」(即，包含環結構)或「柔性的」(即，缺少環結構)。在這兩種情形中，所述結構單元包 含羥基和巰基，據說結構單元通過它們連接形成多核苷酸類似物。在寡核苷酸類似物中的 連接結構部分選自由硫化物(-S-)，亞碸(-S0-)，和碸(-S02-)組成的組。國際專利申請WO 92/20702描述了一種包括肽主鏈的無環寡核苷酸，在所述肽主 鏈上任何選擇的化學核鹼基(nucleobase)或類似物排成一列且如同其在天然RNA中那樣 作為編碼特徵(coding characters)。這些稱為肽核酸(PNAs)的新化合物不但在細胞中比 其天然對應物更穩定，而且結合天然RNA比彼此附著的天然核酸更緊密50-100倍。可以通 過Merrifield固相肽合成法，由包含尿苷、胞苷、腺苷和鳥苷的4種被保護的單體合成PNA 低聚物。為了提高在水中的溶解性以防止聚集，賴氨酸醯胺基位於在C端區域。還可以通過在合成過程中在snoRNAs中結合3'-脫氧胸苷或2'-取代的核苷 酸(例如，用烷基取代的)，通過提供作為苯基異脲(phenylisourea)衍生物的snoRNAs，或 通過使其它分子如氨基吖啶(aminoacridine)或聚賴氨酸連接在snoRNAs的3『端，而提 高 snoRNA 的穩定性(參見，例如，Anticancer Research (抗癌研究)10 :1169_1182，1990)。本發明snoRNAs的RNA核苷酸的修飾可以在整個snoRNA中、或在選擇的區域如5'和/或 3'端存在。還可以通過將snoRNAs偶聯至親脂化合物上而修飾snoRNAs以提高其透過靶 組織的能力。可以通過本領域已知的標準方法製備本發明的snoRNAs，所述標準方法包括標 準化學合成法和編碼其的DNA的轉錄。另外，可以通過將snoRNAs偶聯至對靶細胞細胞表 面上的受體特異性的配體而使snoRNAs靶向特定的細胞。還可以通過綴合到特異性結合細 胞型特異性受體的單克隆抗體上，而使snoRNAs靶向特定的細胞類型。
本發明核酸的構建體和/或載體可以包括多於一種被設計為產生本發明所述的 修飾的snoRNA的序列。當存在多於一種序列時，所述序列可以被設計為靶向相同的靶核 酸，或不同的靶核酸。所述核酸構建體，載體或實際上編碼修飾的snoRNA的核酸本身可以被設計成表 達與本發明的snoRNA分子聯合使用的其他分子，如RNAi分子，以調節基因表達。還可能利用本發明的技術產生疾病模型，而不必產生常規轉基因動物。因此，本發 明的核酸，核酸構建體或載體可以被設計成表達snoRNA，以在宿主細胞/動物中防止或最 小化正常野生型基因/蛋白的表達，且還表達與特定疾病/病況相關的基因/蛋白的突變 形式。然後，可以向所述細胞/動物增加/實施可能的治療，以觀察所述治療能否治療或改 善突變基因/蛋白的作用。本發明的snoRNAs，核酸，核酸構建體和/或載體可以用來確定基因在細胞或生物 體中的功能，或者甚至用於調節基因在細胞或生物體中的功能。所述細胞優選地是真核細 胞或細胞系，例如，植物細胞或動物細胞，如哺乳動物細胞，例如，胚胎細胞，多能幹細胞，腫 瘤細胞，例如畸胎瘤細胞，或病毒感染的細胞。所述生物體優選地是真核生物體，例如，植物 或動物，如哺乳動物，特別是人。本發明的snoRNA分子針對的靶基因可以與病理狀況相關。例如，所述基因可以是 病原體相關基因，例如，病毒基因，腫瘤相關基因或自體免疫疾病相關基因。所述靶基因還 可以是在重組細胞或遺傳改變的生物體中表達的異源基因。通過確定或調節、特別是抑制 所述基因的功能，可以獲得農業領域或醫學或獸醫用醫學領域中的有價值的信息和治療益 處。本發明允許提供被設計為用備選形式、典型地使用單一載體來置換細胞(或病毒)蛋 白(或功能RNA)的一種形式的核酸構建體和snoRNAs。例如，這可以用來糾正在生物體或 細胞中存在的缺陷，如已知可能為疾病的致病因子的突變基因(例如在CFTR基因中的基因 突變導致發展囊性纖維化病)。相同的載體可以被設計成在同一構建體內編碼靶向以減少 突變基因表達的SnoRNA(S)，並且還編碼該基因的正確拷貝以表達正確的蛋白。所述正確的 拷貝可以由cDNA序列提供，或者備選地由側連內含子的外顯子編碼，所述內含子編碼本發 明的修飾的snoRNAs。其他實例包括置換與癌症進展相關的突變的p53基因、BRCA基因等。有利地，snoRNA和置換核酸可以位於同一轉錄體內，且由與擊倒(knock down)表 達的snoRNAs相同的啟動子表達。這具有允許使全部作為單一轉錄體表達的優點。此外， 這還具有使snoRNAs的表達水平和所表達的置換核酸平衡且共同調節(即，由相同的啟動 子調節)的優點。可以利用相似的方法來用相同RNA的修飾形式置換不編碼蛋白的被靶向的 RNA (例如，snRNA或miRNA或其他功能RNA)。這種策略不限於校正缺陷。可以利用相似的策略來置換由細胞或病毒編碼的任何蛋白(或RNA)，包括用相同基因產物的缺陷的、突變的或修飾形式置換的該蛋白(或RNA) 的野生型和/或功能形式，這對於某些應用可能是理想的，例如，評價突變體表型，或輔助 藥物篩選策略，或用於靶標驗證，或在不與已有的未標記的細胞形式競爭的條件下分析蛋 白的標記形式，或用於其它實施的應用或研究應用。還可以利用所述策略使用單一載體來 用完全或基本不同的蛋白(或RNA)置換一種類型的蛋白(或RNA)。

圖1-3示意性顯示可以用於本發明的載體的實例。在圖1中，載體顯示為表達多 個snoRNAs，其可以被靶向以調節單一基因序列或多個基因序列的表達。圖2示意性顯示蛋 白置換載體，對其進行設計從而提供抑制靶基因X表達的SnoRNA(S)，所述靶基因X可以由 在所述載體中存在的cDNA所編碼的新蛋白所置換。圖3示意性顯示與蛋白置換載體相似 的載體，但是其用於抑制RNA，如突變RNA，且其可以用新形式/與所述載體中存在的序列不 同的形式來置換。本發明用於細胞或生物體的其他應用是分析基因表達模式和/或蛋白質組。在一 個實施方案中，可以進行關於一個或數個靶蛋白的變體或突變形式的分析，其中通過上述 外源靶核酸將所述變體或突變形式重新引入到細胞或生物體中。與使 用敲除細胞相比較， 組合外源基因的敲除和通過使用突變的例如是部分缺失的外源靶標的挽救具有優點。此 夕卜，該方法特別適用於鑑定靶蛋白的功能結構域。在另一個優選的實施方案中，例如，進行 對至少兩種細胞或生物體的基因表達模式和/或蛋白質組和/或表型特徵的比較。本發明還可以用於鑑定和/或表徵藥劑、例如，由測試物質的集合鑑定新藥劑的 方法中，和/或用於表徵已知藥劑的作用機制和/或副作用的方法中。因此，在另一個方面中，提供本發明所述的snoRNA，核酸，核酸構建體或載體，其用 於治療受試者中的疾病或病症，在所述受試者中需要調節特別是下調一種或多種靶基因的 表達。在另一個方面中，提供本發明所述的snoRNA，核酸，核酸構建體或載體，其用於制 備用於治療受試者中的疾病或病症的藥物，在所述受試者中需要調節特別是下調一種或多 種靶基因的表達。在另一個方面中，提供治療受試者中的疾病或病症的方法，在所述受試者中需要 調節特別是下調一種或多種靶基因的表達，所述方法包括對需要其的受試者施用治療有效 量的本發明所述的snoRNA、核酸、核酸構建體或載體的步驟。當用於本文時，詞語「治療」指抑制或阻止疾病、病症或病況的發展和/或在患有、 或診斷患有所述疾病、病症或病況的個體中引起疾病、病症或病況的減輕、消除、或恢復。本 領域技術人員將知曉可以用於評估疾病、病症或病況的發展的各種方法和測定法，以及類 似地，可以用於評估疾病、病症或病況的減輕、消除或恢復的各種方法和測定法。通過向個體的細胞提供本發明的分離的多核苷酸，由此下調所述個體的細胞中靶 RNA的水平，而實施本發明該方面所述的方法。提供可以通過將本發明的多核苷酸直接施用至細胞中或通過如上文所述在細胞 中表達所述多核苷酸而實施。表達可以通過用能夠表達本發明的多核苷酸的核酸構建體直 接轉染個體的細胞(即，體內轉染)、或通過用所述核酸構建體轉染由個體分離的細胞並將 所轉染的細胞施用至所述個體(即，離體轉染)而實施。因此，在另一個方面中，提供一種藥物組合物，其包括本發明所述的snoRNA，或能夠表達本發明所述的snoRNA分子的核酸構建體，以及其藥用載體。藥物製劑包括適於口服、局部(包括皮膚、口腔和舌下)、直腸或腸胃外(包括皮 下、皮內、肌內和靜脈內)、鼻和肺部施用如通過吸入的那些製劑。在適當時，所述製劑可以 方便地以離散的劑型(discrete dosage unit)存在，並且可以通過製藥領域中公知的任何 方法製備。所有方法均包括這樣的步驟使活性化合物與液體載體或細分的固體載體或二 者締合，然後如果需要，將產品定型為需要的製劑。其中載體是固體的適於口服施用的藥物製劑最優選地作為單位劑量製劑存在，如 大丸劑(boluses)，膠囊或片劑，每種包含預先確定量的活性化合物。片劑可以通過壓制或 模塑製備，任選地具有一種或多種輔助成分。壓制的片劑可以通過在適當的機器中擠壓採 用自由流動形式的活性化合物，如粉末或顆粒而製備，所述粉末或顆粒任選地與結合劑、潤 滑劑、惰性稀釋劑、滑潤劑、表面活性劑或分散劑混合。模塑的片劑可以通過用惰性液相稀 釋劑模塑活性化合物而製備。片劑可以任選地包被，並且如果未包被，可以任選地是有劃痕 的(scored)。膠囊可以通過將單獨的或與一種或多種輔助成分混合的活性化合物填充至膠 囊殼中然後以常用方式將其密封而製備。扁囊劑與膠囊類似，其中活性化合物與任意輔助 成分一起被密封在米紙封中。活性化合物還可以被配製為可分散的顆粒，其可以例如在施 用前混懸在水中，或撒在食物上。顆粒可以進行包裝，例如，包裝在小藥囊中。其中載體是 液體的適於口服施用的製劑可以作為在水性或非水性液體中的溶液或混懸液、或作為水包 油液體乳劑存在。用於口服施用的製劑包括控釋的劑型，例如，片劑，其中將活性化合物配製在適當 的控釋基質中，或者用適當的控制釋放的薄膜包被。所述製劑可以特別方便的用於預防應用。其中載體是固體的適於直腸施用的藥物製劑，最優選地作為單位劑量的栓劑存 在。適當的載體包括可可脂和本領域常用的其它物質。所述栓劑可以通過用軟化的或熔融 的載體混合活性化合物然後在模具中冷卻並塑形而方便地形成。適於腸胃外施用的藥物製劑包括活性化合物在水性或油質賦形劑中的無菌溶液 或混懸液。可注射的製劑可以適用於推注注射(bolus injection)或連續輸注。所述製劑方 便地以單位劑量存在或者存在於多劑量容器中，所述多劑量容器在引入所述製劑後密封直 至需要使用時。備選地，活性化合物可以採用粉末形式，其在使用前用適當的賦形劑如無 菌、無致熱原的水構成。活性化合物還可以配製為長久作用的長效製劑，其可以通過肌內注射或通過植入 如皮下或肌內植入而施用。長效製劑可以包括，例如，適當的聚合物或疏水物質，或離子交 換樹脂。所述長久作用的製劑特別方便地用於預防應用。存在適於通過口腔進行肺部施用的製劑，以便在接受者的支氣管樹中遞送包含活 性化合物且理想地直徑在0. 5-7微米範圍內的顆粒。作為一種可能性，所述製劑可以採用精細粉碎的粉末形式，其可以方便地存在於 可穿透的膠囊中，例如，適當的明膠膠囊中，適於用在吸入裝置中，或者備選地作為自推進 式製劑，其包括活性化合物，合適的液體或氣體推進劑和任選地其它成分如表面活性劑和/ 或固體稀釋劑。適當的液體推進劑包括丙烷和含氯氟烴，並且合適的氣體推進劑 包括二氧化碳。還可以使用這樣的自推進式製劑，其中活性化合物以溶液小滴或混懸液小滴的形式分散在其中。所述自推進式製劑與本領域已知的那些類似，且可以通過建立的方法製備。適當 地，其存在於裝備有手動操作閥或自動運行閥的容器中，所述閥具有理想的噴霧特徵；有利 地，所述閥是其每次操作遞送固定體積如25-100微升的計量形式。作為另外一種可能性，活性化合物可以採用用在噴霧器(atomizer)或霧化器 (nebuliser)中的溶液或混懸液的形式，由此利用加速氣流或超聲波攪動來產生細小的小 霧滴以用於吸入。適於鼻施用的製劑包括通常與上述用於肺施用的那些類似的製劑。當分散時，所 述製劑應該理想地具有10-200微米範圍內的顆粒直徑，以保證在鼻腔內的保留；這可以適 當地通過使用適當的粒度的粉末或選擇適當的閥實現。其它適當的製劑包括顆粒直徑在 20-500微米範圍內的粗磨粉末，用於通過由緊貼鼻部放置的容器經由鼻通路快速吸入而施 用，和滴鼻劑，其含有在水性或油性溶液或混懸液中的0. 2-5% w/v活性化合物。應該理解，除了上述載體成分之外，上述藥物製劑可以包括適當的一種或多種另 外的載體成分，如稀釋劑，緩衝劑，增香劑，結合劑，表面活性劑，增稠劑，潤滑劑，防腐劑 (包括抗氧化劑)等，以及所包含的用於使所述製劑與目的接受者的血液等滲的物質。對於本領域的技術人員，藥用載體是公知的，且包括，但不限於，0. IM且優選為 0. 05M的磷酸緩衝液或0. 8%的鹽水。另外，所述藥用載體可以是水性或非水性溶液、混懸 液和乳液。非水性溶劑的實例是丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄欖油、和可注射的有機酯如 油酸乙酯。水性載體包括水，醇/水溶液，乳液或混懸液，其包括鹽水和緩衝介質。腸胃外 賦形劑包括氯化鈉溶液、複方氯化鈉葡萄糖、葡萄糖和氯化鈉、乳酸林格氏(Ringer' s)或 不揮發性油。還可以存在防腐劑和其他添加劑，如例如，抗微生物劑、抗氧化劑、螯合劑、惰 性氣體等。例如，適於局部製劑的製劑可以作為凝膠、霜劑或藥膏提供。例如，所述製劑可以 塗在傷口或潰瘍處，直接塗敷在傷口或潰瘍的表面，或者負載在適當的支持物如繃帶、紗 布、網眼等上，所述支持物可以應用於待治療的區域且覆蓋在其上。還可以提供液體或粉末製劑，其可以直接噴霧或撒在待治療部位上，例如，傷口或 潰瘍上。備選地，可以用所述製劑噴霧或撒在載體如繃帶、紗布、網眼等上，然後施用於待治 療部位。用於獸醫用的治療製劑可以方便地採用粉末或液體濃縮液形式。按照標準的獸醫 用製劑實踐，可以在粉末中結合常規水溶性賦形劑，如乳糖或蔗糖，以提高其物理特性。因 此，本發明特別適合的粉末包括50-100% w/w且優選地60-80% w/w的活性成分和0-50% w/w且優選地20-40% w/w的常規獸醫用賦形劑。這些粉末可以添加到動物飼料中，例如， 通過中間預混合來添加，或稀釋在動物飲用水中。本發明的液體濃縮液適當地包含所述化合物或其衍生物或其鹽，且可以任選地包 括獸醫用水混溶性溶劑，例如，聚乙二醇、丙二醇、甘油、縮甲醛甘油(glycerol formal)或 與多至30% ν/ν乙醇混合的溶劑。所述液體濃縮液可以施用在動物的飲用水中。詳述現在將參考下述非限制性實施例和附圖描述本發明，所述附圖顯示
圖1 本發明所述的被設計為表達多個snoRNAs的snoRNA表達載體的示意圖；圖2 被設計為用載體編碼的蛋白替代宿主細胞蛋白的snoRNA表達載體的示意 圖；圖3 被設計為用載體編碼的RNA替代宿主細胞RNA的snoRNA表達載體的示意 圖；圖4 =Hela細胞核仁RNA文庫。(A)來自HeLa細胞核仁級分的核仁RNA的分離和克隆。左版顯示分級分離之前的完整的HeLa細胞圖像，右版顯示分離的核仁。HeLa細胞核仁利用先前所述的蔗糖梯度方法 (Andersen等人.，2005)分級，然後由核仁沉澱分離總核仁RNA。通過使用多腺苷酸化聚合 酶在3'端添加多腺苷酸而對總核仁RNA進行修飾。(B)顯示cDNA合成策略的示意圖，其利用擴增(顯示在右)和不用擴增(顯示在 左)進行。通過使用有聚腺苷酸尾的核仁RNA作為模板進行反轉錄合成核仁cDNAs。不用 擴增製備的文庫(左)主要用來檢測豐度核仁RNA種類，而我們利用擴增技術(右)製備 包括較低豐度核仁RNA種類的文庫。將這兩種文庫獨立地克隆至通用質粒載體中，並且通 過DNA測序進行分析。(C)在核仁cDNA文庫中檢測到的RNA種類的總結。我們分別分析了所述擴增的文 庫和未擴增的文庫，但是圓形分格統計圖表顯示兩種文庫的合併結果。圖 5 :HBII-180C snoRNA 和宿主基因 C19orf48 的保守性。(A)HBII-180C snoRNA 的結構。盒 C(A/G)UGAUGA)與盒 D 或 D' (CUGA)分別表示 在盒內。用於指定核糖2' -0-甲基化位點的預測的rRNA互補序列用下劃線表示。(B)預測的HB II-180C snoRNA的二級結構，顯示與FGFR3前mRNA互補的區 域。HBII-180C snoRNA 的二級結構由 mfold(http//frontend. bioinfo. rpi. edu/ applications/mfold/cgi-bin/rna-forml.cgi)(Μ.Zuker Mfold web server for nucleic acid folding and hybridization prediction(用於核酸摺疊禾口雜交予頁測的 Μ. Zuker Mfold 網絡伺服器)· Nucleic AcidsRes.(核酸研究)31 (13)，3406-15，(2003) 禾口 D. H. Mathews, J. Sabina, M. Zuker 與 D. H. Turner Expanded Sequence Dependence of ThermodynamicParameters Improves Prediction of RNA Secondary Structure (Turner 擴大的熱動力學參數的序列依賴性提高RNA 二級結構的預測)J. Mol. Biol.(分子生物學雜 志)288，911-940(1999)(左)計算。盒C與盒D與D'分別顯示在盒內。rRNA互補序列 (虛線)和FGFR3互補序列(實線)用條線表示。FGFR3前mRNA的互補區顯示在右側，其 顯示潛在的鹼基配對相對作用。(C)人C19orf48基因的結構。外顯子顯示為具有羅馬數字的條紋盒。預測的蛋白 編碼區用黑色顯示。內含子-編碼的snoRNAs HBII-180A，HBII-180B和HBII-180C以實心 灰色盒顯示。(D)C19orf48基因的保守區。該圖來源於UCSC人類基因組瀏覽程序的C19orf48 染fe體<立置(http //genome ucsc. edu/cgi-bin/hgGateway KentffJ, Sugnet Cff, Furey TS, Roskin KM,Pringle ΤΗ,Zahler AM,Haussler D :The human genome browser at UCSC(UCSC 的人類基因組瀏覽程序).Genome Res (基因組研究)2002，12 (6) =996-1006) 0脊椎動物 Multiz比對和保守性結果以黑色盒和線條表示。17種脊椎動物物種之間的保守區以條形顯示(保守性)。三個最保守的區域準確對應三種檢測的HBIIsnoRNAs。圖6 :HBII-180C的FGFR3互補區的序列特異件作用。
(A)通過RNA印跡(左版)和通過半定量RT-PCR(右版)分析的HBII-180C表達 水平。左版顯示使用HBII-180C特異性探針進行的RNA印跡分析的結果。印跡分析了相同 量的來自人原代細胞系WI38(WI38)和HeLa細胞(HeLa)的總核仁RNA(核仁)，或總細胞 RNA(細胞)。右版顯示使用HBII-180C特異性引物組進行的半定量RT-PCR的結果。使用 相同量的來自WI38和HeLa細胞的總核仁RNA或總細胞RNA作為模板。(B)用於野生型和突變 HBII-180C snoRNAs 的 HBII-180C 表達質粒。HBII-180C 中與FGFR3前mRNA互補的序列由GAGG改變為ATAA (藍色，mutl)。(C) WI38細胞中表達野生型或mutl HBII-180C snoRNAs的效果比較。圖像顯示在 用空質粒pcDNA3(pcDNA3)，HBII-180C野生型表達質粒(WT)或HBII-180C突變體表達質粒 (mutl)轉染WI38細胞後三天的細胞的代表性實例。紅色箭頭指示將死細胞塊或死亡細胞塊。(D)顯示在用上述質粒表達後三天的死亡細胞的百分數的圖表。與野生型相比較， FGFR3前mRNA互補區的突變清楚地降低細胞死亡水平。圖7 :HBII-180C snoRNA的FGFR3-互補區與可變的FGFR3翦接同種型樽式相關。(A)用於野生型和突變體的FGFR3內含子17表達質粒，其被設計為抑制內源 HBII180-C snoRNA的表達/活性。對於突變體構建體，FGFR3的互補區由CCTC改變為 TTAT (藍色，FRm)。(B)FGFR3剪接的mRNA同種型在WI38和HeLa細胞兩種細胞中的內源性表達模 式。凝膠(左圖)顯示RT-PCR分析結果，以檢測可變剪接的FGFR3mRNA同種型。右圖顯示 FGFR3mRNA特異性引物組的位置。外顯子顯示為具有羅馬數字的盒。用於PCR的引物以箭 頭顯不。(C)通過過量表達FGFR3小基因而改變FGFR3可變剪接的mRNA同種型模式。凝膠 圖像顯示沒有進行轉染的(No，泳道1)，轉染了空質粒pcDNA3. 1 (pC，泳道2)，轉染了 FGFR3 內含子17的野生型小基因(FR3W，泳道3)和突變體小基因(FRm，泳道4)的RT-PCR結果。圖8 使用修飾的snoRNA表達載體對GFP和YFP的靶向抑制。(A)GFP和YFP共有的嵌合體表達質粒靶向序列。WT HB II-180CsnoRNA 中與 FGFR3 前 mRNA 互補的序列由 5 『 -CACCCCAGAGGACACAGTGCA-3 『 改變為5 『 -GACTTGAAGAAGTCGTGCTGC-3 『(藍色，嵌合體1)或改變為 5 『 -ACCTTGATGCCGTTCTTCTGC-3 『(藍色，嵌合體2)。將所得到的嵌合體1和2snoRNAs亞 克隆到表達mCherry螢光蛋白cDNA的載體的3'區。(B)該圖顯示靶向GFP的兩個單獨區域的嵌合體1和嵌合體2的互補區，所述兩個 單獨區域也存在於相關的YFP基因中。(C)在僅表達未融合的GFP的HeLa-穩定細胞系中，嵌合體構建體對 GFP表達的作用。該圖顯示在HeLaepp穩定細胞系中轉染空的mCherry表達質粒 mCherry-Cl (mCherry-Cl)，表達質粒HBII-180C嵌合體1或表達質粒HBII-180C嵌合體2 的作用。左版顯示未轉染的HeLaGFP穩定細胞系的活細胞圖像(DIC圖像)。上版顯示由固 定的細胞記錄的圖像的GFP螢光信號(綠色)。下版顯示組合GFP (綠色)和mCherry (紅色)信號的合併圖像。箭頭指示轉染細胞，箭頭狀物指示未轉染的細胞。注意到特別是在 用編碼HBII-180C嵌合體1或2的表達質粒轉染的細胞中GFP表達的清楚的減少。
(D)在表達融合在纖維蛋白的氨基端的YFP的HeLaYFp- ·穩定細胞系中嵌合體 構建體對YFP表達的作用(Leung等人.，2004)。該附圖顯示在HeLaYFP_糹·穩定細胞系中 使用空的mCherry表達質粒mCherry-Cl (mCherry-Cl)，表達質粒HBII-180C嵌合體1或表 達質粒HBII-180C嵌合體2對轉染的作用。左版顯示未轉染的HeLaYFP_■■穩定細胞系的 活細胞圖像(DIC圖像)。上版顯示由固定的細胞記錄的圖像的YFP螢光信號(綠色)。下 版是組合YFP (綠色)，mCherry (紅色)和DAPI信號(藍色)的合併圖像。箭頭指示轉染 的細胞，而箭頭狀物指示未轉染的細胞。注意到特別在用編碼HBII-180C嵌合體1或2的 表達質粒轉染的細胞中YFP-纖維蛋白表達的清楚減少。在一些細胞中，YFP信號幾乎被完 全消除，這表明所述嵌合的snoRNA構建體對YFP-纖維蛋白的有效抑制。圖9 由蛋白質印跡和RNA印跡檢測的靶向的snoRNA對GFP和YFP的抑制。(A)在用空的mCherry表達質粒mCherry-Cl (對照泳道1)，表達質粒HBII-180C 嵌合體1 (泳道2)或表達質粒HBII-180C嵌合體2 (泳道3)轉染HeLaGFP和HeLawp糹·5自穩 定細胞系後，檢測GFP(上圖)和YFP-纖維蛋白(下圖)的蛋白水平。每一泳道加載等量 的HeLa提取物，且蛋白通過SDS PAGE分離，電印跡且用單克隆抗-GFP抗體和用作為加載對 照的抗-微管蛋白探測。注意到，特別是使用編碼HB II-180C嵌合體1或2的表達質粒， GFP和YFP-纖維蛋白水平而不是微管蛋白水平的減少。(B)該圖顯示三次獨立的實驗的平均信號強度和標準差。GFP信號比率根據微管 蛋白信號標準化。注意到，特別是使用編碼HB II-180C嵌合體1或2的表達質粒，GFP和 YFP-纖維蛋白水平而不是微管蛋白水平的減少。(C)在用空mCherry表達質粒mCherry-Cl (對照泳道1)，表達質粒HBII-180C嵌 合體1 (泳道2)或表達質粒HB II-180C嵌合體2 (泳道3)轉染HeLawp-糹·穩定細胞系後 檢測YFP-纖維蛋白的RNA水平。每一泳道加載等量的HeLa細胞總RNA，且RNA通過6. 5 % 甲醛-0. 8%瓊脂糖凝膠分離，電印跡，且用放射標記的抗-YFP低聚物和用作為加載對照的 抗-18S rRNA進行探測。該圖顯示三次獨立實驗的平均信號強度和標準差。YFP-纖維蛋白 信號比率針對18S rRNA信號進行標準化。(D)嵌合體snoRNA質粒的轉染效率。通過RT-PCR定量mcherrymRNA。HeLa細胞 總RNA分離自瞬時轉染的mCherry質粒(對照)和嵌合體snoRNAs。該圖顯示三次獨立實 驗的平均信號強度。mCherry細胞比率針對GAPDH信號標準化。S 10 嵌合體1禾Π 2講行的基因擊倍丨的另一個實例。其實驗設計與圖8C和D所示的實驗設計相同，不同在於此處用穩定細胞系 HeLaGFP_SMN。mCherry-HBII-180C為另一種陰性對照，其在mCherry cDNA的3'區具有野生 SHBII-ISOC snoRNA序列。箭頭指示轉染的細胞，而箭頭狀物指示未轉染的細胞。注意到， 特別在用編碼HBII-180C嵌合體1或2的表達質粒轉染的細胞中，GFP表達的清楚減少。圖11 使用三聯嵌合體(triplet chimera) snoRNA質粒的靶向基因擊倒。(A)三聯嵌合體snoRNA構建體的結構和靶向GFP/YFP擊倒的示意圖。(B) (C)實驗設計與圖8C和D所用的實驗設計相同，但是此處使用嵌合體三聯質粒 進行轉染。Mcherry-triple-HBII-180C是另一種陰性對照，其在mCherry cDNA的3'區具有3個野生型HB II-180C snoRNA序列的重複。箭頭轉染的，箭頭狀物未轉染的。(D)通過蛋白質印跡(泳道1-5)檢測靶向GFP/YFP的每種嵌合體質粒的擊倒效 率。用mCherry和野生型HBII-180C表達質粒mCherry-HBII-180C(對照泳道1)，表達質 粒嵌合體1 (泳道2)，嵌合體2 (泳道3)，嵌合體3 (泳道4)，HBII-180C三聯嵌合體(泳道 5)轉染HeLaYFp-··穩定細胞系後，檢測YFP-纖維蛋白的蛋白水平。每一泳道加載等量 的HeLa提取物，且通過SDS PAGE分離蛋白，進行電印跡，且用單克隆抗-GFP抗體和作為加 載對照的抗-B23進行探測。該圖顯示由B23信號標準化的YFP-纖維蛋白信號強度。注意 至IJ，特別是用編碼嵌合體1，2和3的表達質粒時，YFP-纖維蛋白水平而不是B23水平的降 低。使用三聯嵌合體質粒已經增加了降低YFP-纖維蛋白表達水平的效率。
(E)實驗設計與圖IlB和C的實驗設計相同，但是此處使用嵌合體穩定細胞系 HeLaGFp-sw0還使用GFP-SMN融合蛋白的另一種穩定細胞系檢測由所述三聯嵌合體質粒介導 的靶向基因表達的減少。箭頭轉染的，箭頭狀物未轉染的。B 12 鑑定來自嵌合體三聯質粒的嵌合體SnoRNAs0(A)原位雜交的螢光顯示野生型HBII-180C和嵌合體snoRNAs (Cy3)的核仁定位。 用DAPI染色DNA。線條是10 μ Μ。三聯嵌合體snoRNA構建體的結構顯示在上版中。箭頭 指示核仁。(B)HB II-180C和嵌合體snoRNAs的表徵。RNA印跡顯示HB II-180C和嵌合體 snoRNAs的亞細胞分布。通過使用特異性探針的northern RNA印跡分析，用瞬時轉染的野 生型或嵌合體snoRNA表達小基因比較等量的HeLa細胞總RNA (泳道1)，細胞質RNA (泳道 2)，核漿RNA(泳道3)和核仁RNA(泳道4)。使用tRNA_IIe特異性探針(下版)檢測級分質量。圖13 分析HBII-180C和嵌合體snoRNA突變。(A)顯示snORNAHBII-180C的序列，其中8個分開的三核苷酸AAA突變的位置顯示 為ml-m8 (在所述序列上顯示)。盒C，D和D'用盒顯示。與28S rRNA互補的預測的指導 序列用下劃線表示，如在snoRNABase (L. Lestrade等人，2006)中所示。M盒區由粗體下劃 線表示。HeLa細胞瞬時轉染了空質粒載體(泳道2)，或表達野生型HB II-180C的質粒載 體(泳道3)或HB II-180C snoRNA突變體ml-8(泳道4-11)。每個泳道加載等量的總HeLa 細胞RNA (Ctrl 未轉染)。條帶顯示高靈敏性RNA印跡的結果，其使用放射標記的寡核苷酸 探針來分別檢測HBII-180C snoRNA,和tRNA。通過半定量RT-PCR使用C19 orf48和GAPDH 特異性引物組(C19orf48和GAPDH)驗證轉染效率。*C19orf48引物檢測內源性C19orf48 轉錄體和HBII-180C小基因之間共有的區域。(B)將野生型質粒(CM2WT)和突變質粒(CM2ml&m7)瞬時轉染至單獨的GFp的穩定 細胞(HeLa^)或GFP-SMN融合蛋白穩定細胞系(HeLa )中。箭頭轉染的，箭頭狀物 未轉染的。注意，對於在嵌合體2質粒上作為HBII-180C snoRNA(圖13A)的盒C(CM2ml) 和盒D (CM2m7)的核心區域的突變對GFP和GFP-SMN表達水平沒有表現出擊倒作用。(C)將突變質粒(CM2m2-l，m2-2和m3)瞬時轉染至GFP-SMN融合蛋白穩定細胞系 (HeLaGFp-sw)中。箭頭轉染的，箭頭狀物未轉染的。注意破壞28S rRNA互補序列的突變 質粒(CMm2-l和m2-2)存在明顯的擊倒作用。(D)將在M盒具有增加與GFP的互補性的插入的突變體質粒(CM2In_l至_3)和在M盒中具有缺失的突變體質粒(CM2Del-l至-3)瞬時轉染至GFP-SMN融合蛋白穩定細胞系(HeLaGFp-sw)中。箭頭轉染的，箭頭狀物未轉染的。(E)將在M盒中具有點突變的突變體質粒(CM2X-1至-6)瞬時轉染至GFP-SMN融 合蛋白穩定細胞系(HeLam-s )中。箭頭轉染的，箭頭狀物未轉染的。(F)嵌合體2誘變結果總結。左版顯示HBII-180C snoRNA的基序和每種質粒的突 變區(質粒名稱和突變位置在表格中)。表格顯示顯微鏡分析(圖13B-E)的結果。擊倒效 率顯示當通過計數30個隨機選擇的轉染細胞判斷時，表現出對GFP-SMN水平的抑制的細胞 數目(+++ 多於 16，++ =13-16, + :9-12，- :5_8，—少於 5)。圖14 結合組合的snoRNA主鏈突變的嵌合體三聯質粒(tripleDlasmid)能夠介 導靶向基因的表汰的擊倒。(A)突變體m2，m4和m5序列均組合且結合在嵌合體三聯snoRNA (snoMENvl)中。 使用Cy3標記的嵌合體snoRNAs特異性探針(Cy3)的原位雜交螢光顯示核仁定位。用DAPI 染色DNA。線條是15 μ m。箭頭指示核仁。(B)這是與圖IlE所示的實驗設計相同的實驗設計，不同的是轉染三聯嵌合體 snoMENvl質粒。注意到snoMENvl質粒表現出與野生型嵌合體三聯質粒相似的靶基因的減 少水平。圖15 內源件SIINl蛋白的靶蛋白置換。(A)被靶向的內源性S^l基因擊倒質粒(SMNls noMENvl)和S^l蛋白置換質粒 (GFP-SMN1 snoMENvl-PR)的結構。這些構建體具有與三聯嵌合體snoMENvl (圖14A)相似 的三聯snoMEN序列，不同的是M盒序列具有針對內源性SilNl前mRNA特異性序列的互補序 列(見材料和方法)。(B)將被靶向的內源性SMNl質粒(SMN1 snoMENvl)和蛋白置換質粒(GFP-S^l snoMENvl-PR)轉染至HeLa細胞中。還將表達GFP cDNA和mcherry-三聯嵌合體質粒 的EGFP-Cl (圖14A)瞬時轉染到HeLa細胞中作為對照(GFP和三聯嵌合體)。注意， SMNl snoMENvl表現出對照沒有表現出的細胞毒性表型。該細胞毒性作用通過使用 GFP-SMNlsnoMENvl-PR質粒進行GFP-SMNl融合蛋白的表達而得以挽救。箭頭轉染的細胞， 箭頭狀物細胞毒性表型細胞。(C)在用mCherry三聯嵌合體(對照泳道1)和SilNl snoMENvl (泳道2)轉染 HeLa細胞後檢測內源性SMNl的蛋白水平。每個泳道加載等量的HeLa提取物，且通過SDS PAGE分離蛋白，進行電印跡並用單克隆抗-SMNl抗體和作為加載對照的抗-B23探測。該圖 顯示具有針對B23信號標準化的SMNl信號強度。圖16 具有本發明的snoRNA分子的慢病毒(Lentiviral)系統。這是與圖IlB中所進行和所述相同的實驗設計，不同的是在該情形中，表達載體 用慢病毒載體系統(Lenti-X Clontech)轉染。mCherry-三聯-HBII-180C是陰性對照， 其在mCherry cDNA的3'區具有3個野生型HBII-180C snoRNA序列的重複。箭頭轉染 的細胞，箭頭狀物未轉染的細胞。縮寫snoRNA 小核仁 RNAsnRNA:小核 RNA
rRNA:核糖體 RNAtRNA:轉運 RNAFGFR3 成纖維細胞生長因子受體3mRNA:信使 RNA前-mRNA 前體信使RNAGAPDH 磷酸甘油醛脫氫酶HBII-180C 人腦 snoRNA II-180CCIP:牛小腸磷酸酶PCR:聚合酶鏈式反應CMV:巨細胞病毒材料和方法構建核仁cDNA文庫。如先前所述(Andersen等人.，2005)，使用蔗糖梯度純化 HeLa細胞核仁。通過具有DNA酶I處理的TRIzol法按照供應商(Invitrogen)的使用說 明，由純化的核仁分離核仁RNA。使用多腺苷酸化聚合酶(Irwitrogen)，在3'末端加入 20_30mer聚腺嘌呤序列(poly adeninesequence)來修飾核仁RNA。在未擴增的文庫的情 形中(圖4B左圖)，通過使用寡dT引物進行反轉錄，由IOyg加多腺苷酸尾的核仁RNA合 成cDNA。通過使用Super Script質粒合成試劑盒按照供應商(Invitrogen)所述進行的 切口平移置換技術合成第二鏈cDNA。在用T4 DNA聚合酶產生平端後，將雙鏈cDNA克隆至 pBluescript載體中。在擴增的文庫的情形中(圖4B右圖)，使用GeneRacer試劑盒不經CIP 步驟(Invitrogen)製備核仁cDNA。通過使用銜接體特異性引物按照供應商(Invitrogen) 所述進行的短時PCR擴增(例如，5秒的聚合酶反應)，擴增小尺寸的雙鏈cDNA。按照供應 商的使用說明，將擴增的cDNA克隆至Τ0Ρ0 TA克隆載體中。RNA印跡分析和RT-PCR。通過具有DNA酶I處理的TRIzol法按照供應商 (Invitrogen)的使用說明，由HeLa細胞核仁和HeLa細胞或人成纖維原代細胞系WI38細胞 分離核仁RNA和總細胞RNA。通過在TBE緩衝液中的8M尿素聚丙烯醯胺變性凝膠分離等量 的RNA。通過電印跡將RNA轉移至尼龍膜(Hybond-N ;Amersham)上。在UV交聯後，使用標 準方法，將印跡的膜用32P標記的特異性探針(U3 5' -CACTCAGACCGCGTTCTCTCCCTCTCACTCCCCAATACGG-3'，HBII-180C 5 『 -AAAGGTCCTGGGGTGCACTGTGTCCTCAGGGGTGATCAGA-3『 . HBI1-85 5 『 -ACGACGGTATGAGTTCTCACTCATTTTGTTCAGCTTTTCC-3 『)雜交。還進 行RT-PCR來驗證每種snoRNA的表達水平。使用Superscript —步RT-PCR試劑 盒(Invitrogen)，使用基因特異性引物(U3 5 『 -AGAGGTAGCGTTTTCTCCTGAGCG-3 『 和 5 『 -ACCACTCAGACCGCGTTCTC-3 『，HBII-180C :5 『 -CTCCCATGATGTCCAGCACT-3 『和 5' -CTCAGACCCCCAGGTGTCAA-3『 , HBII-85 5' -GATCGATGATGAGTCCCCCATAAAAAC-3『和 5 『-GACCTCAGTTCTGATGAGAACGACGG-3 『)進行反轉錄和PCR。為了決定線性循環，我們使用 Superscript III Platinum SYBR Green一步qRT-PCR試劑盒(Invitrogen)和Rotor-Gene RG-3000系統(CorbettResearch)進行實時PCR。將等量的RNA作為模板用於RT-PCR反應。 每一實驗分別重複三次。質粒構建和轉染。將來自C19orf48基因外顯子2至3的序列插入到pcDNA3. 1哺乳動物表達質粒的CMV啟動子的3'區，產生HBII-180C表達載體。通過位點定向誘變由野 生型構建體建立突變體構建體(mutl，圖6B)。建立FGFR3內含子17表達小基因以抑制內源 的HBII-180C功能。將FGFR3序列的外顯子17-18插入到pcDNA3. 1哺乳動物表達質粒(圖 7A)的CMV啟動子的3'區。通過位點定向誘變由野生型構建體建立突變體構建體(Frm， 圖4A)。通過位點定向誘變由野生型HBII-180C表達構建體建立抗-GFP/YFP HB II-180C 構建體(嵌合體1和2，圖8A)。如圖8A所示，將突變的插入物亞克隆至哺乳動物表達質粒 mCherry-Cl的mCherry cDNA的3'區中。使用磷酸鈣法將所述質粒轉染WI38細胞，且對 於HeLa細胞及其他HeLa穩定細胞系使用「effectine 「轉染試劑(QIAGEN)。磷酸鈣法如 下文所述進行。死細胞計數。將WI38細胞塗布在IOcm的培養皿上。在附著細胞的同時轉染所述 質粒。在3天後計數死細胞百分數5次，每次隨機選擇100個細胞進行計數。然後以5次 獨立計數的平均數計算平均死細胞百分數。每次實驗獨立地重複3次(圖8D)。 FGFR3剪接的mRNA變體檢測。使用基因特異性引物組(FGFR3 5 『 -TGGACGTGCTGGAGCGCTCCCCGC-3'和 5『 -CCCAGGGTCAGCCGGGCCCGAGACAG-3『，GAPDH 5 『 -CGCATCTTCTTTTGCGTCGCCAG-3 『和 5 『 -GGTCAATGAAGGGGTCATTGATGGC-3 『)(圖 7B 和C)通過一步RT-PCR檢測FGFR3 mRNA的剪接變體。將FGFR3內含子17表達質粒轉染 至HeLa細胞中。48小時後，通過具有DNA酶I處理的TRIzol方法中供應商的使用說明 (Invitrogen)，由HeLa細胞、轉染的HeLa細胞和WI38細胞分離總RNA。將等量RNA用作上 述每次RT-PCR (RNA印跡分析和RT-PCR)的模板。細胞成像。使用Deltavision Spectris 螢光顯微鏡(Deltavision Spectrisfluorescence microscope) (Applied Precision)記錄所有的細胞圖像。按先 前所示(Andersen 等人，2005，Trinkle-Mulcahy 等人，2006，http //www. lamondlab. com/ f7protocols.htm)準備WI38，HeLa YFP-FIB細胞和HeLa GFP細胞的活細胞圖像。細胞使 用60X(NA 1.4)平面高度消色透鏡物鏡(Plan Apochromat objective)成像。每個視野和 每次曝光記錄間隔0. 5 μ m的12個光切面(SoftffoRx圖像處理軟體，Aplied Precision) (圖4A，圖6C，圖8C和D)。使用下述先前所述的方法準備WI38,HeLaYFP-FIB細胞和HeLa GFP細胞的固定的細胞圖像。將細胞用3. 8%低聚甲醛固定。在通過tritonX-100滲透後，用DAPI染色細 胞。結果部分本發明人已經進行了關於由哺乳動物細胞系分離的核仁的大規模的純化和蛋白 質組研究(Andersen等人.，2002，2005，Lam等人，2007)。他們已經詳細地表徵了人核仁蛋 白質組(Leung 等人，2003，還參見;http://www. lamondlab. com/NOPdb/)。他們還分析了由 HeLa細胞分離的核仁的RNA組成。由高度富集的分離自HeLa細胞的核仁製備物純化RNAs， 在短時擴增反應後進行大小分級分離，亞克隆(見圖4中的方法)並且測序。該分析鑑定 了 589個snoRNA克隆，包括562個先前已知的soRNAs和7個新的snoRNAs。將3個檢測到的已知的稱為HBII-180A, HBII-180B和HBII-180C的盒C/D snoRNAs分別在稱為C19orf48的轉錄體的獨立的內含子內編碼(圖5C和D)，C19orf48先 前據報導在多重耐藥性癌細胞中擴增(Zhou等人，2002)。三個HBII-180snoRNAs中的每一個靶向28S rRNA核苷酸位置3680處的同一 2' -0-核糖甲基化位點(圖5A和B)。編碼 這些snoRNAs的基因位於染色體19上的位置ql3. 33。C19orf48基因序列的進化比較表明 主要保守性對應於內含子編碼的snoRNAs而不是各自的外顯子序列。這表明C19orf48基 因的主要功能可能是編碼snoRNAs而不是蛋白(圖5)。出乎意料地，HB II-180C snoRNA的序列分析揭示其具有21個核苷酸區，位於28S rRNA甲基化指導序列的3'，其中21個核苷酸中有19個與由人成纖維細胞生長因子受體 3 (FGFR3)基因轉錄的前mRNA的內含子17內的區域互補(圖5A和B)。HBII-180C snoRNA 表達水平的比較表明其在HeLa細胞中高度表達，而在原代成纖維細胞(WI38細胞)中僅以 低水平存在(圖6A)。本發明人利用CMV啟動子驅動轉錄，通過用HBII-180C小基因瞬時轉染質粒載體， 而在WI38細胞中外源性過量表達HBII-180C snoRNA(圖6B)。這導致所轉染的WI38細胞 的細胞程序性死亡。然而，當本發明人瞬時表達HB II-180C的突變體時，其在與FGFR3的內 含子17互補的區域內具有3個核苷酸的序列改變(即，減少與FGFR3前-mRNA的互補性)， 這不再在WI38細胞中引起細胞程序性死亡(圖6，B-D)。在HeLa細胞中，由質粒載體過 量表達與內源性HB II-180C snoRNA互補的靶FGFR3內含子17序列，導致所表達的FGFR3 mRNA同種型的比率的明顯變化(圖7A和B)。這在HeLa細胞中引起FGFR3 mRNA的短同種 型的增加，導致與通常在WI38細胞中表達的相似的FGFR3mRNA同種型模式(圖7C)。這些數據表明HBII-180C snoRNA的表達水平可以影響FGFR3mRNA的表達水平。此 外，該數據表明這一作用取決於在HBII-180CsnoRNA中存在與FGFR3前mRNA內含子17中 的區域互補的序列。本發明人接著通過修飾HBII-180C的結構以用與一個或多個靶RNAs互補的序列 置換FGFR3互補序列區來檢測snoRNA HB II-180C調節FGFR3RNA表達的能力是否可以適於 調節特定靶RNAs的表達。因此，構建如圖5A和B所示的載體，稱為嵌合體1和2，其具有包含 HBII-180C內含子的小基因，其包括由CMV啟動子表達的HBII-180C snoRNA主鏈。所述載體 還編碼由CMV啟動子表達的mCherry螢光蛋白，以允許包含所述載體的轉染細胞的即時檢 測。HBII-180C中的FGFR3互補區用與GFP RNA互補的序列置換(見圖8，A和B)。插入的序列 為 5 『 -GACTTGAAGAAGTCGTGCTGC-3 『(嵌合體 1)和 5 『 -ACCTTGATGCCGTTCTTCTGC-3 『(嵌 合體 2)，其置換 Wt HBII-180C 中的序列 5『 -CACCCCTGAGGACACAGTGCA3『。嵌合體表達載體和僅表達mCherry的等價載體(mCherry-Cl)，分別瞬時轉染至a/ 僅穩定表達不融合的GFP的HeLa細胞系，或b/穩定表達與纖維蛋白融合的YFP的HeLa細 胞系中(圖8，C和D)。細胞在轉染後48小時固定，並且通過螢光顯微鏡分析GFP/YFP的 水平和mCherry表達。這表明，在轉染了被改造從而在HBII-180C snoRNA主鏈內包含與 GFP互補的序列的載體的那些細胞中，在各自的HeLa穩定細胞系中的GFP螢光的水平特異 性減少。這一減少僅在表達mCherry的細胞中觀察到，驗證了其特異性發生在轉染的細胞 中。相反，轉染了缺少snoRNA的mCherry載體的細胞不表現出GFP螢光的顯著減少，或在 表達mCherry的細胞和不表達mCherry的那些細胞之間的GFP水平的變化(圖8C&D)。所 述數據表明，單獨的GFP的表達，或由緊密相關的YFP和細胞蛋白(纖維蛋白)形成的融合 蛋白的表達，均可以通過特異性靶向的、改造的snoRNA表達載體的表達而進行調節。這些數據表明本發明人已經產生的snoRNA表達載體的序列和結構可以進行改造以靶向選擇的特定RNA靶標且由此調節其表達。其他材料和方法RNA和高靈敏性RNA印跡分析。按前述，使用蔗糖梯度分級分離HeLa細胞提取 物。使用具有DNA酶I處理的TRIzol法，按照供應商的使用說明(Invitrogen)，分離總 HeLa細胞RNA和來自分離的細胞質、核漿和核仁級分的RNA。將來自每種樣品的等量RNA 通過在lxTBE緩衝液中的8M尿素聚丙烯醯胺變性凝膠電泳分離，且通過電印跡將RNA轉移 至尼龍膜(Hybond-N ;Amersham)上。在UV交聯後，所述膜用對下述RNA種類(HBII-180A， HBII-180B，HBII-180C和tRNA)特異的32P 5'末端標記的寡核糖核苷酸探針雜交。按先前 所述製備高靈敏性RNA印跡(G. S. Pall等人，2007)。二級結構所有RNA 的二級結構通過 RNA 結構 4. 5 (RNAstructure 4. 5) (D. H. Mathews 等人， 2004)預測，且用 RnaViz 2. 0 (P. De Rijk 等人，2003)進行註解。質粒構建和轉染將來自C19 orf48基因外顯子2-3的序列插入到pcDNA3. 1哺乳動物表達質粒 (Invitrogen)的CMV啟動子的3'，產生HBII-180C表達載體。通過位點定向誘變，由野 生型HBII-180C表達小基因構建體建立HBII-180A，B和HBII-180C的突變體構建體。使 用〃 effectine"轉染試劑(QIAGEN)將所述質粒轉染至HeLa細胞中。細胞成像所有細胞圖像使用Deltavision Spectris 螢光顯微鏡(Applied Precision)記 錄。按先前所示(L. Trinkle-Mulcahy 等人，2006 和 K. L. Leung 等人 ，2004) (http //www. lamondlab. com/f7protocols. htm)準備 HeLaYFp-纖維se細胞和 HeLaGFP 細胞的活細胞圖像。 細胞使用60X(NA 1.4)平面高度消色透鏡物鏡成像。對於每個視野和每次曝光記錄間隔 0. 5 ii m 的 12 個光切面(SoftffoRx 圖像處理軟體，Applied Precision)。結果部分修飾的snoRNA對被靶向的蛋白和/或mRNA表達水平的作用RNA印跡分析表明瞬時轉染靶向G/YFP mRNA序列的嵌合體snoRNA抑制G/YFP mRNA水平(圖9C和D)。這一結果表明嵌合體snoRNA可以影響靶mRNA表達水平，如前所 述(圖1和2)。多個修飾的snoRNAs可以在一個轉錄體中表達以增加其效率。如在圖11A中建立三聯嵌合體snoRNA構建體。該質粒(三聯嵌合體)編碼三個 位於在本文用作轉染標記的mCherry螢光蛋白cDNA的3 『的修飾的snoRNAs，其靶向G/ YFP mRNA序列中的不同位置(圖11A)。使用該三聯嵌合體質粒的瞬時轉染實驗表明與用 單嵌合體質粒相似的對G/YFP和G/YFP-融合蛋白的抑制作用，這通過螢光顯微鏡判斷(圖 11B，C，E)。蛋白質印跡分析表明三聯嵌合體構建體的抑制效率強於單嵌合體snoRNAs (圖 11D)。FISH分析和對每種嵌合體snoRNA使用特異性探針的分級的RNA印跡分析表明所述 三聯嵌合體質粒產生與用野生型HBII-180C觀察到的每個修飾的嵌合體1-3 snoRNAs (圖 12A和B)。這些結果表明所修飾的snoRNA可以通過在一個轉錄體中表達多個snoRNAs (多 重(multiplexing))增加靶向的擊倒的效率。此外，所述三聯嵌合體質粒表達mCherry紅 色螢光蛋白而不是G/YFP和G/YFP融合蛋白(圖11B，C，E)。這些結果還表明我們可以通 過使用修飾的snoRNA用mCherry置換G/YFP和G/YFP融合蛋白，由此證明「蛋白置換」或「蛋白敲入」作用。對於修飾的snoRNA及其擊倒能力的詳細結構分析。修飾的snoRNA的擊倒能力可能由加工的snoRNA產生，或者備選地可能不依賴於snoRNA加工而直接由C19orf48前mRNA形成(圖5C)。後一種可能性由最近的不依賴於 Drosha加工的內含子-編碼的微RNAs的報導所提議。為了區分這些可能性，將一系列三鹼 基突變引入到HBII-180C小基因的8個獨立區域中，且在野生型和突變形式的HB II-180C 之間比較全長snoRNA的表達(圖13A)。WT HBII-180C小基因載體的表達升高全長HB II-180C snoRNA的水平高於內源水平，但是空載體沒有升高全長HB II-180C snoRNA的水 平(圖13A，比較泳道1與泳道2&3)。包括在保守的C或D盒的任一個內的序列改變的多 個突變，減少或者消除外源性全長HBII-180C snoRNA的表達，僅有內源性snoRNA水平存在 (圖13A，泳道4-11)。在HB II-180C表達水平減少的每種情形中，存在修飾的snoRNA嵌合 體_2的擊倒能力水平的相應減少(圖13A，比較泳道3與泳道4和10，和圖13B ml和m7， 圖13F)。這表明修飾的snoRNA的擊倒能力取決於在前的snoRNA加工，且證明對於直接來 自C19orf48前mRNA轉錄體的擊倒能力不可能存在不依賴snoRNA的途徑。HBII-180C中的 m2突變，其破壞在snoRNA指導序列中針對28S rRNA的互補性，不阻止snoRNA形成和修飾 的snoRNA的擊倒效率(圖13A，泳道5，圖13C和F m2-l，m2_2)。因此，修飾snoRNA擊倒靶 基因表達的能力不依賴於snoRNA結合rRNA和使rRNA甲基化的能力。HBII-180C中的m3 突變，其破壞盒D'，略微減少防止snoRNA形成和擊倒效率(圖13A，C，F)。這表明我們可 能通過突變在M盒外部的區域而改變修飾的snoRNA的擊倒能力。建立在修飾的snoRNA嵌合體_2中的M盒序列的插入和缺失突變體，以檢測擊倒 能力和M盒序列長度之間的相關性(圖13D & F)。所有三種提高與G/YFP mRNA的序列互 補性的插入突變體表現出與野生型嵌合體-2質粒相似的擊倒活性(圖13D&F Inl-3)。顯 著地，具有針對G/YFPmRNA的另外的8鹼基互補序列的插入突變體CM2In_3表現出提高的 擊倒效率(圖13F)。M盒中2和3個鹼基的缺失突變體(CM2Del-l &_2)也表現出擊倒能 力，但是其不如野生型嵌合體-2有效(圖13F)。與野生型嵌合體_2相比較，7鹼基缺失突 變體CM2Del-3不表現出顯著的擊倒活性(圖13F)。還建立M盒中的6點突變體，來檢測 擊倒能力和M盒中鹼基對錯配之間的相關性(圖13E&F)。M盒中的1-3鹼基錯配突變體 (CM2X-1至-3)也表現出擊倒能力，但是其不如野生型嵌合體_2有效(圖13F)。與野生型 嵌合體_2相比較，M盒中的4-6鹼基錯配突變體(CM2X-4至-6)不表現出有效的擊倒活性 (圖13F)。這些結果表明修飾的snoRNA調節基因擊倒的能力與M盒互補性和靶mRNA序列 之間的雜交親和性相關。結合預計不影響修飾的snoRNA擊倒能力的m2 (28S rRNA互補區)，m4和m5的每 個突變體的組合snoRNA (圖13A&C，圖14A)表現出與野生型三聯嵌合體質粒相似的擊倒能 力，這通過螢光顯微鏡判斷(圖14B)。使用嵌合體-1，-2，-3特異性探針的FISH分析表現 出該組合突變體質粒(三聯嵌合體snoMENvl)如也用野生型三聯嵌合體質粒觀察到的那 樣表達每一個所編碼的嵌合體修飾的snoRNAs (圖12A&14A)。這些突變體分析表明所修飾 的snoRNAs的擊倒能力可以通過位於與snoRNA結合靶RNA相關的序列外部的突變和位於 snoRNA與靶序列之間結合所需要的互補序列(即，M盒)內部的突變進行調節。修飾的snoRNA載體可以通過蛋白置換而挽救致死性基因表達擊倒作用。由三聯嵌合體snoMENvl建立兩種靶向內源性SMNl (運動神經元存活)前mRNA的修飾的snoRNA質粒(圖15A)。質粒S^l snoMENvl編碼GFP cDNA和3個分別靶向內源性 SMNl前mRNA內不同位置的修飾的snoRNAs (圖15A)。另一種質粒GFP-SMNl snoMENvl-PR 編碼GFP-SMNl融合蛋白cDNA和3個相同的具有分別靶向內源性SMNl前mRNA內部不同位 置的SMNl snoMENvl的修飾的snoRNAs (圖15A)。瞬時轉染分析表明單獨的GFP和mCherry 三聯嵌合體質粒對HeLa細胞沒有有害作用。然而，SilNl snoMENvl質粒在轉染至細胞內時 表現出細胞毒性作用(圖15B，箭頭)。蛋白質印跡分析表明內源性SMNl水平通過轉染SilNl snoMENvl被抑制(圖15C)。預測這一結果是因為已知SMNl敲除小鼠的表型是胚胎致死 性的(Hsieh等人，Nature Genetics (自然遺傳學)2000)。另一方面，瞬時轉染GFP-SMN1 snoMENvl-PR質粒表現出如在HeLaGF 穩定細胞系中觀察到的正確的定位模式(圖10)， 且重要地，不表現出如使用SilNl snoMENvl所觀察到的細胞毒性作用(圖15B)。這些結果 表明，內源性SMNl被靶向SMNl前mRNA的修飾的snoRNAs抑制，且其細胞毒性作用通過表 達GFP-SMNl融合蛋白得到挽救。當由病毒載體系統表達時的修飾的snoRNA功能。
將三聯嵌合體修飾的snoRNAdenti-三聯嵌合體)和野生型三聯HBII-180C snoRNA(lenti-三聯HBII-180C)分別亞克隆至 lenti-Χ病毒載體(Clontech)中。Ienti-三 聯嵌合體表現出與使用相對應的質粒載體三聯嵌合體觀察到的相同的擊倒作用(比較圖 IlB和圖16)。這一結果表明，修飾的snoRNA擊倒靶向的基因的能力不依賴於單一轉染系 統，且可以使用質粒和病毒載體系統遞送。參考文獻1. T. Kiss, Cell (細胞)109，145 (2002)。2. Τ. Kiss 等人，Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 71，407-17 (2006)。3. F-M. Boisvert 等人，Nat Rev Mol Cell Biol.(自然分子細胞生物學綜述)8， 574-585(2007)。4. Α. K. L.，Leung 等人，Biochem. J.(生物化學雜誌)376，553-569 (2003)。5. S. Kishore 和 S. Stamm, Science (科學)，311，230 (2006)。6. JS. Andersen 等人，Curr Biol (現代生物學)，12，1-11 (2002)。7. JS. Andersen 等人，Nature (自然)，433，77-83 (2005)。8. Yff. Lam 等人，Curr. Biol.(現代生物學)17，749-60 (2007)。9. XD. Zhou 等人 Ai zheng (癌症)4，341-5 (2002)。10. L. Trinkle-Mulcahy 等人，J. Cell Biol. ( M 胞生物學雜誌)172， 679-92(2006)。11. A. K. L.，Leung 等人，J. Cell Biol.(細胞生物學雜誌)166，787-800 (2004)。12G. S. Pall 等人，Nucleic Acids Res.(核酸研究)35 (8)，e60 (2007)。13D. H. Mathews 等人，Proc. Natl Acad. Sci USA(美國國家科學院學 報)101(19)，7287-92 (2004)。14P. De Rijk 等人，Bioinformatics (生物信息學)19 (2)，299-300 (2003)。15 L. Trinkle-Mulcahy 等人，J. Cell Biol.(細胞生物學雜誌)172， 679-92(2006)。16K. L. Leung 等人，J. Cell Biol.(細胞生物學雜誌)166，787-800 (2004)。17L. Lestrade 等人，Nucleic Acids Res.(核酸研究)34，D158-162 (2006)。
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權利要求
調節靶核酸表達的方法，所述方法包括在使snoRNA或修飾的snoRNA和/或其片段能夠與所述靶核酸的一部分雜交的條件下，使所述核酸與snoRNA或修飾的snoRNA相接觸；並且其中所述snoRNA或其片段與所述核酸部分的雜交調節所述靶核酸的表達和/或功能。
2.用於調節靶核酸的表達的修飾的snoRNA序列，所述修飾的snoRNA序列包括基本與 所述靶序列的一部分互補的核酸序列，所述核酸序列用於與所述靶核酸的部分雜交且調節 所述靶核酸的表達。
3.根據權利要求1或2所述的方法或修飾的snoRNA序列，其中所述靶核酸序列是RNA 序列。
4.根據前述權利要求任一項所述的方法或修飾的snoRNA序列，其中所述snoRNA分子 基於細胞snoRNAs，包括所謂的盒C/D-snoRNA或盒H/ACA-snoRNA。
5.根據權利要求3所述的方法或修飾的snoRNA，其中所述盒C/DsnoRNAs包括 L. collosoma b2 (GenBank 登記號 AF331656)，L. collosoma B3 (GenBank 登記號 AY046598)， L. collosoma B4 (GenBank 登記號 AY046598)，L. collosoma B5 (GenBank 登記號 AY046598)， L. colIosomaTSl(GenBank 登記號 AF331656)，L. collosoma TS2(GenBank 登記號 AF331656)，L. collosoma g2 (GenBank 登記號 AF331656)，L. collosomasnoRNA-2 (GenBank 登記號 AF050095)，Τ· brucei snoRNA 92 (GenBank 登記號 Z50171，L. tarentolae snoRNA 92 (GenBank 登記號 AF016399)，T. brucei TBC4 snoRNA(SEQ ID NO 35), T. brucei sno 270 (GenBank 登記號 Z50171)和人 U14snoRNA (GenBank 登記號 NR_000022)。
6.根據前述權利要求任一項所述的方法或修飾的snoRNA，其包括通常存在於所述盒 C/D snoRNAs中的一種或多種D/D'盒核酸序列。
7.根據權利要求5所述的方法或修飾的snoRNA，其中所述至少一種或多種D和/ 或D'盒包含選自下列各項的序列，例如，5' -CUGA-3 『 ,5' -AUGA-3 『 ,5' -CCGA-3'， 5 『 -CAGA-3『，5『 -CUUA-3『，5『 -UUGG-3'和 5 『 -CAGC-3『。
8.根據前述權利要求任一項所述的方法或修飾的snoRNA，其中所述修飾的snoRNA分 子還包括盒C序列和/或任選地與28S rRNA互補的另一個區域或與snoRNA修飾的其它生 理學靶標互補的另一個區域。
9.根據權利要求4所述的方法或修飾的snoRNA，其中編碼所述snoRNA的序列包括提 供按照建立的snoRNA加工途徑由內含子進行加工所必需的結構元件。
10.根據權利要求7所述的方法或修飾的snoRNA，其中所述盒C序列長度為5_9個核 苷酸。
11.根據前述權利要求任一項所述的方法或修飾的snoRNA，其中所述基本與靶RNA序 列的部分互補的序列基本上與內含子或外顯子序列互補，或與內含子-外顯子連接序列互 補，或與在所述靶核酸5'或3'非翻譯區內部的區域或在所述靶核酸5'或3'非翻譯區 連接處的區域互補。
12.根據前述權利要求任一項所述的方法或修飾的snoRNA，其中基本上與所述靶RNA 序列的部分互補的所述核酸序列長度典型地為15-45個核苷酸。
13.根據權利要求3所述的方法或修飾的snoRNA，其中所述靶RNA序列是mRNA，tRNA, miRNA或rRNA序列或RNA病毒基因組序列或來源於其的轉錄體。
14.根據前述權利要求任一項所述的方法或修飾的snoRNA，其中所述修飾的snoRNA分子包括多於一種設計為與靶核酸分子雜交的序列。
15.根據權利要求13所述的方法或修飾的snoRNA，其中所述多於一種設計為與靶核酸 分子雜交的序列可以靶向同一靶核酸分子的不同部分、或靶向不同的靶核酸分子。
16.核酸構建體，其包括質粒和病毒載體，其能夠表達權利要求2-15中任一項所述的 至少一種修飾的snoRNA分子。
17.根據權利要求16所述的核酸構建體，其包括與內含子核酸區域側連的至少兩個外 顯子核酸區域，所述內含子核酸區域能夠編碼所述修飾的snoRNA。
18.根據權利要求16或17所述的核酸構建體，其中所述核酸構建體包括與兩個或多個 內含子序列側連的多個外顯子序列，所述內含子序列包括能夠編碼一種以上snoRNAs的序 列。
19.根據權利要求18所述的核酸構建體，其中所述構建體作為單一構建體形成，其當 在靶細胞內轉錄時，引起與所述外顯子序列對應的且剪除所述內含子序列的mRNA的產生， 且隨後產生所述修飾的snoRNA(s)。
20.根據權利要求16-19中任一項所述的核酸構建體，其中多於一種內含子序列被用 來產生多於一個snoRNA序列，每個snoRNA設計為靶向相同或不同的靶RNA分子。
21.根據權利要求16-20中任一項所述的核酸構建體，其還包括促進對其中已經轉化 或轉染了所述核酸構建體的細胞的鑑定的選擇標記基因。
22.根據權利要求16-21中任一項所述的核酸構建體，其包括至少一個啟動子，如組成 型或可控型啟動子。
23.根據權利要求16-22中任一項所述的核酸構建體，其還包括位點特異性重組位點， 其設計為促進位點特異性整合到宿主細胞基因組中。
24.用權利要求15-23中任一項所述的核酸構建體轉化或轉染的宿主細胞。
25.根據權利要求24所述的宿主細胞，其中所述細胞選自真核細胞，特別是哺乳動物 細胞(例如，HeLa細胞，Cos細胞)，酵母細胞，(例如，AH109, HHY10, KDY80)和昆蟲細胞 (例如，Sf9)，錐蟲細胞(例如，L. collosoma，L. major，T.brucei 29-13)，細菌細胞(例如， JM109, RP437, MM509, SW10)或植物細胞。
26.用於產生修飾的snoRNA分子的核酸載體構建體，所述構建體在5'至3'方向包括i)用於控制轉錄的啟動子序列；ii)第一外顯子序列；iii)第一內含子剪接序列；iv)克隆位點或序列，其用於促進編碼權利要求2-15中任一項所述的修飾的snoRNA的 核酸序列的克隆；v)第二內含子剪接序列；和vi)第二外顯子序列。
27.根據權利要求26所述的核酸載體構建體，其在5'至3'方向還包括vii)第三或其它內含子剪接序列；vii)第二或其它克隆位點或序列，其用於促進編碼權利要求2-15中任一項所述的修 飾的snoRNA的核酸序列的克隆；3viii)第四或其它內含子剪接序列；和ix)第三或其它外顯子序列。
28.根據權利要求26或27所述的核酸載體構建體，其還包括編碼蛋白、RNA、標記的 蛋白、突變蛋白等的可表達的編碼序列，以功能性置換所述靶RNA、或要被所述一種或多種 snoRNAs調節的蛋白。
29.根據權利要求28所述的核酸載體構建體，其中所述snoRNA核酸和所述編碼蛋白、 RNA、標記的蛋白、突變蛋白等的可表達的編碼序列受到相同啟動子的控制，且作為單一轉 錄體表達，其中編碼蛋白、RNA、標記的蛋白、突變蛋白等的所述可表達的編碼序列功能性置 換所述靶RNA、或要被所述一種或多種snoRNAs調節的蛋白。
30.snoRNA,修飾的snoRNA，編碼snoRNA或修飾的snoRNA的核酸構建體，或能夠表達 snoRNA或修飾的snoRNA的細胞，其用於治療受試者中的疾病或病症，在所述受試者中，需 要調節特別是下調靶核酸的表達。
31.藥物組合物，其包括snoRNA，修飾的snoRNA，編碼snoRNA或修飾的snoRNA的核酸 構建體，或能夠表達snoRNA或修飾的snoRNA修飾的snoRNA的細胞，和用於其的藥用載體。
32.根據權利要求30或31所述的產品或組合物，其包括權利要求2-29中任一項所述 的修飾的snoRNA，編碼snoRNA或修飾的snoRNA的核酸構建體，或能夠表達snoRNA或修飾 的snoRNA修飾的snoRNA的細胞。
33.根據權利要求28或29所述的載體的應用，其用於評估突變體表型，或輔助藥物篩 選策略，或用於靶標驗證，或在不與已有的未標記的細胞形式競爭的條件下分析蛋白的標 記形式，或用於其它實施的應用或研究應用。
全文摘要
本發明涉及利用設計成靶向特定核酸序列的snoRNA分子或snoRNA樣分子或片段來調節基因表達的方法。
文檔編號C12N15/11GK101868543SQ200880117264
公開日2010年10月20日 申請日期2008年9月22日 優先權日2007年9月22日
發明者安格斯·萊恩·萊蒙德, 小野基晴 申請人:敦提大學校董事會