抗-人epo受體的抗體及使用方法

2023-05-15 06:18:51

抗-人epo受體的抗體及使用方法
【專利摘要】本文報導了一種抗體，所述抗體特異性結合人EPO受體，其中所述抗體結合EPO受體片段LPGPGGSVDIV(SEQ?ID?NO：01)，但是所述抗體不特異性結合分子量為約66kD的可獲自人內皮細胞的蛋白質。
【專利說明】抗-人EPO受體的抗體及使用方法
發明領域
[0001]本發明涉及抗-人EPO受體的抗體及其使用方法。
[0002]背景
[0003]人紅細胞生成素(erythropoietin,ΕΡ0)是166個胺基酸的糖蛋白，其參與紅系祖細胞的增殖和分化。這些細胞反應由人EPO受體(EPO receptor,EP0R)介導，人EPO受體是508個胺基酸的糖蛋白。EPO受體是長度為508個胺基酸的蛋白質(Swiss Prot P19235)，其包含單個跨膜結構域並且已被歸類為I類細胞因子受體生長激素亞家族的成員。EPO受體描述於例如，ffinkelmann, J.C.等，Blood (血液)76 (1990) 24-30,和 Jones, S.S.等，Blood (血液)76 (1990) 31—35)。
[0004]從例如以下文獻中針對EPO受體的抗體是已知的:D』 Andrea, A.D.，Blood(血液)82 (1993) 46-52 ；Elliott, S.，Bloodl07 (2006) 1892—1895 ；Kirkeby, A.，J.Neurosc1.Methodsl64 (2007) 50-58 ；Miura, 0.，Arch.Biochem.306 (1993) 200-208 ；Mayeux, P.等，J.Biol.Chem.266 (1991) 23380-23385 ；ffestphal.G.等，Clin.Exp.Med.2 (2002) 45—52 ；Elliott, S.等，J.1mmunol.Meth.352(2010) 126—139，以及 EP1146056、EP1327681、EP0773962、EP0776370、US2002 / 0031806、US2003 / 0215444、US2004 / 0058393、US2004 / 0071694、US2004 / 0175379、US2005 / 0227289、US2005 / 0244409、US2006 /0018902、US6, 153，190、US6, 998，124、US7, 053，184、US7, 081，523、W01995 / 005469、W01996 / 003438、W02000 / 061637、W02004 / 035603、W02005 / 100403 和 W02010 /022924。然而，由於已知抗體對EPO受體缺少特異性，調查EPO受體在組織樣品中表達和定位的研究產生有分歧的和通常人為的結果(見，Jelkmann, W.等，Crit.Rev.0ne.Hematol.67(2008)39-61 ；Elliott, S.等，Bloodl07 (2006) 1892—1895 Jelkmann,ff.和 Laugsch，Μ.，J.Clin.0ncol.25(2007) 1627—1628 ;Kirkeby，A.等，J.Neurosc1.Methodsl64(2007)50—58 ；Laugsch, M.等，Int.J.Ca`ncerl22 (2008) 1005—1011)，或據報導，研究採用具有可疑特異性的抗體，並且觀察的意義是有爭議的(Elliott，S.，見上文)。
[0005]概述
[0006]已經發現，本文所述的抗體特異性結合人EPO受體，並且不與存在於內皮細胞上/內的類似大小的蛋白質交叉反應，從而允許產生明確的檢測結果。
[0007]如本文中所報導的一個方面是體外檢測人EPO受體的方法，所述方法包括以下步驟:通過將樣品與特異性結合人EPO受體片段LPGPGGSVDIV(SEQ ID NO:01)的EPO受體的抗體溫育，體外確定所述樣品中人EPO受體的存在，由此體外檢測人EPO受體，其中所述特異性結合EPO受體片段LPGPGGSVDIV(SEQ ID NO:01)的EPO受體的抗體不特異性結合具有約58kD至約70kD分子量的可獲自人內皮細胞的蛋白質。
[0008]在一個實施方案中，所述方法的特徵在於所述抗體不特異性結合具有約66kD分子量的可獲自人內皮細胞的蛋白質。
[0009]在一個實施方案中，所述方法的特徵在於所述抗體以KT3M或更高的親和力結合所述可獲自人內皮細胞的蛋白質。[0010]在一個實施方案中，所述方法的特徵在於所述抗體是多克隆抗體或單克隆抗體。
[0011]在一個實施方案中，所述方法的特徵在於所述抗體是人抗體、人源化抗體或嵌合抗體。
[0012]在一個實施方案中，所述方法的特徵在於所述抗體是結合人EPO受體的抗體片段。
[0013]如本文中所報導的一個方面是特異性結合人EPO受體的抗體，其特徵在於所述抗體結合人EPO受體片段LPGPGGSVDIV(SEQ ID NO:01)並且不特異性結合具有約58kD至約70kD分子量的可獲自人內皮細胞的蛋白質。
[0014]在一個實施方案中，所述抗體的特徵在於其不特異性結合具有約66kD分子量的可獲自人內皮細胞的蛋白質。
[0015]在一個實施方案中，所述抗體的特徵在於其以IO-3M或更高的親和力結合所述可獲自人內皮細胞的蛋白質。
[0016]在一個實施方案中,所述抗體的特徵在於其是多克隆抗體或單克隆抗體。
[0017]在一個實施方案中，所述抗體的特徵在於其是人抗體、人源化抗體或嵌合抗體。
[0018]在一個實施方案中，所述抗體的特徵在於其是結合人EPO受體的抗體片段。
[0019]如本文中所報導的一個方面是特異性結合人EPO受體並且可以用於如本文中所報導的方法的抗體。
·[0020]如本文中所報導的一個方面是特異性結合人EPO受體的抗體，其用於如本文中所報導的方法。
[0021]在一個實施方案中，所述抗體的特徵在於所述抗體結合EPO受體片段LPGPGGSVDIV(SEQ ID NO:01)並且不特異性結合具有約58kD至約70kD分子量的可獲自人內皮細胞的蛋白質。
[0022]在一個實施方案中，所述抗體的特徵在於其不特異性結合具有約66kD分子量的可獲自人內皮細胞的蛋白質。
[0023]在一個實施方案中，所述抗體的特徵在於其以KT3M或更高的親和力結合所述可獲自人內皮細胞的蛋白質。
[0024]在一個實施方案中，所述抗體的特徵在於其是多克隆抗體或單克隆抗體。
[0025]在一個實施方案中，所述抗體的特徵在於其是人抗體、人源化抗體或嵌合抗體。
[0026]在一個實施方案中，所述抗體的特徵在於其是結合人EPO受體的抗體片段。
[0027]如本文中所報導的一個方面是特異性結合人EPO受體的抗體在檢測人EPO受體中的用途，其特徵在於所述抗體結合EPO受體片段LPGPGGSVDIV(SEQ ID NO:01)並且不特異性結合具有約58kD至約70kD分子量的可獲自人內皮細胞的蛋白質。
[0028]在一個實施方案中，所述用途的特徵在於所述抗體不特異性結合具有約66kD分子量的可獲自人內皮細胞的蛋白質。
[0029]在一個實施方案中，所述用途的特徵在於所述抗體以KT3M或更高的親和力結合所述可獲自人內皮細胞的蛋白質。
[0030]在一個實施方案中，所述用途的特徵在於所述抗體是多克隆抗體或單克隆抗體。[0031 ] 在一個實施方案中，所述用途的特徵在於所述抗體是人抗體、人源化抗體或嵌合抗體。[0032]在一個實施方案中，所述用途的特徵在於所述抗體是結合人EPO受體的抗體片段。
[0033]如本文中所報導的一個方面是用於預測或確定患者對用於增加紅細胞數目的藥物的反應性的方法，所述方法包括
[0034]-通過將患者的樣品與如本文中所報導的EPO受體的抗體體外溫育並且體外確定所述抗體與所述樣品的結合來體外確定人EPO受體在所述患者的癌細胞上的存在，
[0035]由此，人EPO受體在患者癌細胞上的存在指示患者對用於增加紅細胞數目的藥物的反應性。
[0036]在一個實施方案中，所述方法的特徵在於所述抗體不特異性結合具有約58kD至約70kD分子量(在一個實施方案中，約66kD)的、可獲自人內皮細胞的蛋白質。
[0037]在一個實施方案中，所述方法的特徵在於所述抗體以KT3M或更高的親和力結合所述可獲自人內皮細胞的蛋白質。
[0038]在一個實施方案中，所述方法的特徵在於所述抗體是多克隆抗體或單克隆抗體。
[0039]在一個實施方案中，所述方法的特徵在於所述抗體是人抗體、人源化抗體或嵌合抗體。
[0040]在一個實施方案中，所述方法的特徵在於所述抗體是結合人EPO受體的抗體片段。
[0041]本文中報導了這樣的抗體，其特異性結合具有胺基酸序列LPGPGGSVDIV(SEQ IDNO:01)的人EPO受體片段並且不結合人內皮細胞。已經發現，這樣的抗體可以通過以下方式獲得:用具有胺基酸序列LDKWLLPRNPPSED`LPGPGGSVDIV(SEQ ID NO:02)的EPO受體片段免疫實驗動物，並且之後將獲自實驗動物的抗體交叉吸附(即，選擇)到具有胺基酸序列LPGPGGSVDIV(SEQ ID NO:01)的 EPO 受體片段。
[0042]如本文中所報導的一個方面是用於製備特異性結合人EPO受體的抗體的方法，所述方法包括以下步驟:
[0043]-用包含EPO 受體片段 LDKWLLPRNPPSEDLPGPGGSVDIV (SEQ ID NO:02)的多肽免疫動物，和
[0044]-選擇結合EPO受體片段LPGPGGSVDIV(SEQID NO:01)的抗體並且由此製備特異性結合人EPO受體的抗體。
[0045]在一個實施方案中，所述選擇是通過將獲自所述免疫的動物的抗體交叉吸附到固定的SEQ ID NO:01的EPO受體片段。
[0046]在一個實施方案中，所述方法的特徵在於所述抗體不特異性結合具有約58kD至約70kD分子量(在一個實施方案中，約66kD)的、可獲自人內皮細胞的蛋白質。
[0047]在一個實施方案中，所述方法的特徵在於所述抗體以KT3M或更高的親和力結合所述可獲自人內皮細胞的蛋白質。
[0048]在一個實施方案中，所述方法的特徵在於所述抗體是多克隆抗體或單克隆抗體。
[0049]在一個實施方案中，所述方法的特徵在於所述抗體是人抗體、人源化抗體或嵌合抗體。
[0050]在一個實施方案中，所述方法的特徵在於所述抗體是結合人EPO受體的抗體片段。[0051]如本文中所報導的一個方面是特異性結合人EPO受體的抗體，其中所述抗體結合EPO 受體片段 LPGPGGSVDIV(SEQ ID NO:01)。
[0052]在一個實施方案中，所述抗體對所述人EPO受體的親和力為10_7M以下。在一個實施方案中，所述抗體對所述人EPO受體的親和力為10-8Μ以下。在一個實施方案中，所述抗體對所述人EPO受體的親和力為5χ10_9Μ以下。在一個實施方案中，所述抗體對所述人EPO受體的親和力為2χ10_9Μ以下。在一個實施方案中，所述抗體對所述人EPO受體的親和力為約1.8χ10_9Μ。在一個實施方案中，所述抗體對所述人EPO受體的親和力為至少δχΙΟ,Μ。在一個實施方案中，所述抗體對所述人EPO受體的親和力為至少約6.βχΙΟ,Μ。
[0053]在所有方面的一個實施方案中，所述抗體是多克隆抗體或單克隆抗體。
[0054]在所有方面的一個實施方案中，所述抗體是小鼠抗體，或大鼠抗體，或兔抗體，或倉鼠抗體，或綿羊抗體，或山羊抗體，或雞抗體，或猴抗體，或豬抗體，或人抗體，或人源化抗體。在一個實施方案中，所述抗體是人抗體、人源化抗體或嵌合抗體。
[0055]在一個實施方案中，所述抗體是特異性結合人EPO受體的抗體片段。
[0056]如本文中所報導的一個方面是分離的核酸，其編碼如本文中所報導的抗體。
[0057]如本文中所報導的一個方面是宿主細胞，其包含編碼如本文中所報導的抗體的核酸。
[0058]如本文中所報導的一個方面是製備如本文中所報導的抗體的方法，所述方法包括培養如本文中所報導的宿主細胞從而製備所述抗體。
[0059]在一個實施方案中 ，所述方法包括以下步驟:從所述宿主細胞或培養基回收抗體。
[0060]在一個實施方案中，宿主細胞是原核細胞或真核細胞。在一個實施方案中，所述細胞是CHO細胞，或HEK細胞，或BHK細胞，或Sp2 / O細胞，或NSO細胞。
[0061]在一個實施方案中，細胞是大腸桿菌(E.coli)細胞或芽孢桿菌(Bacillus)細胞。
[0062]如本文中所報導的一個方面是用於製備特異性結合人EPO受體的抗體的方法，所述方法包括以下步驟:
[0063]-用包含EPO 受體片段 LDKWLLPRNPPSEDLPGPGGSVDIV (SEQ ID NO:02)的多肽免疫動物，和
[0064]-選擇結合EPO受體片段LPGPGGSVDIV(SEQID NO:1)的抗體，和
[0065]由此生產特異性結合人EPO受體的抗體。
[0066]在一個實施方案中，所述方法包括以下額外步驟中的一個或多個:
[0067]-培養包含編碼已被選擇的抗體的核酸的細胞，和/或
[0068]-從細胞或培養基回收抗體。
[0069]如本文中所報導的一個方面是包含如本文中所報導的抗體和可檢測的標記或細胞毒性劑的免疫綴合物。
[0070]如本文中所報導的一個方面是包含如本文中所報導的抗體和任選地藥用載體的藥物製劑。
[0071]如本文中所報導的一個方面是包含與可檢測的標記綴合的如本文中所報導的抗體的診斷製劑。
[0072]如本文中所報導的一個方面是如本文中所報導的抗體，其用作藥物。
[0073]如本文中所報導的一個方面是如本文中所報導的抗體，其用於治療貧血。[0074]如本文中所報導的一個方面是如本文中所報導的抗體，其用於改變患者中的紅細胞數目。
[0075]如本文中所報導的一個方面是如本文中所報導的抗體在製備藥物中的用途。
[0076]在一個實施方案中，所述藥物用於治療貧血。
[0077]在一個實施方案中，所述藥物用於改變患者中的紅細胞數目。
[0078]如本文中所報導的一個方面是治療患有貧血的個體的方法，所述方法包括向所述個體施用有效量的如本文中所報導的抗體用以改變/增加個體中的紅細胞數目。
[0079]如本文中所報導的一個方面是改變個體中的紅細胞數目的方法，所述方法包括向所述個體施用有效量的如本文中所報導的抗體以改變個體中的紅細胞數目。
[0080]如本文中所報導的一個方面是診斷試劑盒，其包含如本文中所報導的抗體。
[0081]如本文中所報導的一個方面是用於製備包含如本文中所報導的抗體的診斷試劑盒的方法。
[0082]如本文中所報導的一個方面是如本文中所報導的抗體在確定或分析人組織樣品中的人EPO受體中的用途。
[0083]在所有方面的一個實施方案中，樣品是人組織或人細胞的溶解產物。
[0084]在所有方面的一個實施方案中，所述樣品是組織的切片，或新鮮組織的切片，或冷凍的組織，或冷凍的組織的 切片，或福馬林固定的石蠟包埋的組織，或福馬林固定的石蠟包埋的組織的切片。
[0085]在所有方面的一個實施方案中，所述分析通過免疫化學，免疫螢光法，或免疫組織化學進行。在一個實施方案中，所述分析通過蛋白質印跡或FACS或使用NIRF或PET的體內成像進行。
[0086]在所有方面的一個實施方案中，所述確定是通過將組織樣品與如本文中所報導的抗體溫育並檢測所述抗體與所述組織樣品的結合。
[0087]如本文中所報導的一個方面是用於預測或確定患者對用於增加紅細胞數目的藥物的反應性的方法，所述方法包括
[0088]-體外確定人EPO受體在患者癌細胞上的存在，和
[0089]-將人EPO受體在患者癌細胞上的存在與患者對用於增加紅細胞數目的藥物的反應性相關聯。
[0090]如本文中所報導的一個方面是用於確定用於治療癌症患者的用於增加紅細胞數目的藥物的劑量的方法，所述方法包括:
[0091]-體外確定人EPO受體在患者癌細胞上的存在，和
[0092]-當確定存在人EPO受體時，決定不施用或施用較低劑量的增加紅細胞數目的藥物，和
[0093]-當確定不存在人EPO受體時，決定施用一定劑量的增加紅細胞數目的藥物。
[0094]如本文中所報導的一個方面是用於預測或確定患者對用於增加紅細胞數目的藥物的反應性的方法，所述方法包括
[0095]-體外確定人EPO受體在患者癌細胞上的密度，
[0096]-將人EPO受體在患者癌細胞上的密度與患者對用於增加紅細胞數目的藥物的反應性相關聯。[0097]如本文中所報導的一個方面是用於確定用於治療癌症患者的用於增加紅細胞數目的藥物的劑量，所述方法包括:
[0098]-體外確定人EPO受體在患者癌細胞上的存在，和
[0099]-在人EPO受體存在的情況下，決定不施用或施用較低劑量的增加紅細胞數目的藥物，和
[0100]-在不存在人EPO受體的情況下，決定施用正常劑量的增加紅細胞數目的藥物。
[0101]在所有方面的一個實施方案中，確定人EPO受體在癌細胞上的存在或確定人EPO受體在癌細胞上的密度是通過將患者的組織樣品與如本文中所報導的EPO受體的抗體體外溫育並且在體外確定所述抗體與所述樣品的結合。
[0102]在一個實施方案中，增加紅細胞數目的藥物是紅細胞生成素。
[0103]附圖簡述
[0104]圖1對來自wt-HELA、HELA-EP0R和UT-7細胞的溶解產物的蛋白質印跡分析。
[0105]圖2對wt-HELA和HELA-EP0R細胞的免疫細胞化學分析:Α:ΕΡ0受體-GFP融合蛋白:示例的如本文中所報導的抗體。
[0106]圖3對wt-HELA和HELA-EP0R細胞的免疫組織化學分析:A:野生型HELA細胞；B:EP0R-HELA。
[0107]圖4對來自UT-7、HUVEC(人臍靜脈內皮細胞)和HMVEC細胞(人微血管內皮細胞)的溶解產物的蛋白質印跡分析。
[0108]序列簡述
[0109]SEQ ID NO:01人EPO受體的片段，其具有胺基酸序列LPGPGGSVDIV。
[0110]SEQ ID NO:02人EPO受體的片段，其具有胺基酸序列LDKWLLPRNPPSEDLPGPGGSVDIV。
[0111]SEQ ID NO:03人EPO受體前體的胺基酸序列。
[0112]發明實施方案詳述
[0113]1.定義
[0114]用於本文目的的「接納體人構架」是包含獲自人免疫球蛋白構架或如下所定義的人共有構架的輕鏈可變結構域(VL)構架或重鏈可變結構域(VH)構架的胺基酸序列的構架。「獲自」人免疫球蛋白構架或人共有構架的接納體人構架可以包含其相同的胺基酸序列，或其可以包含胺基酸序列的變化。在一些實施方案中，胺基酸變化的數目為10以下，9以下，8以下，7以下，6以下，5以下，4以下，3以下，或2以下。在一些實施方案中，VL接納體人構架的序列與VL人免疫球蛋白構架序列或人共有構架序列相同。
[0115]「親和力」是指分子(例如抗體)的單一結合位點與其結合配偶體(例如抗原)之間全部非共價相互作用總和的強度。除非另有說明，在用於本文時，「結合親和力」指反映結合對的成員(例如抗體與抗原)之間1:1相互作用的內在結合親和力。分子X對其配偶體Y的親和力通常可用解離常數(也作Kd或KD或平衡常數)來表述。親和力可通過本領域知道的常用方法(包括本文中所描述的那些)來測量。當確定多克隆抗體的親和力時，親和力也被稱為「表觀親和力」。 用於測量結合親和力的具體說明性和示例性實施方案描述於以下。
[0116]術語「抗-人EPO受體的抗體」和「結合人EPO受體的抗體」是指能夠以足夠的親和力結合SEQ ID NO:03的人EPO受體，從而使得所述抗體用作靶向人EPO受體的診斷和/或治療劑。在一些實施方案中，結合人EPO受體的抗體具有≤1OnM, ≤1nM, ≤ 0.1nM,≤0.01nM，或≤0.001nM(例如，KT8M以下，例如，KT8M至10_13M，例如，KT9M至10-13M)的解離常數(Kd)。在一些實施方案中，抗-人EPO受體的抗體結合在來自不同物種的人EPO受體中保守的人EPO受體的表位。
[0117]術語"抗體"在本文中以最廣義使用，並且包括不同抗體結構，包括但不限於單克隆抗體，多克隆抗體，多特異性抗體(例如，雙特異性抗體)，和抗體片段，只要它們顯示所需的抗原結合活性。
[0118]"抗體片段"是指不同於完整抗體的分子，其包含完整抗體的部分，所述部分結合完整抗體結合的抗原。抗體片段的實例包括但不限於Fv，Fab，Fab'，Fab』_SH，F(ab' )2 ；雙抗體；線性抗體；單鏈抗體分子(例如scFv);和由抗體片段形成的多特異性抗體。
[0119]術語「嵌合」抗體是指這樣的抗體，其中一部分重鏈和/或輕鏈來源於特定來源或物種，而剩餘的重鏈和/或輕鏈來源於不同來源或物種。
[0120]抗體的「類別」是指其重鏈具有的恆定結構域或恆定區的類型。有五個主要類別的抗體:IgA，IgD，IgE，IgG和IgM，並且這些中的一些可以進一步被劃分為亞類(同種型)，例如，IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1和IgA2。對應於不同類別的免疫球蛋白的重鏈恆定結構域分別被稱為α，δ，ε，Y和μ。
[0121]術語「細胞毒性劑」用在本發明中指抑制或防止細胞功能和/或引起細胞死亡或破壞的物質。細胞毒性劑包括但不限於:放射性同位素(例如，At211，I131，I125，Y90, Re186，Re188，Sm153, Bi212, P32，Pb212和Lu的放射性同位素)；化療劑或藥物(例如，甲氨蝶呤(methotrexate),阿黴素(adriamicin),長春花生物喊(vinca alkaloids)(長春新鹼(vincristine)，長春鹼(vinblastine),依託泊苷(etoposide)),多柔比星(doxorubicin),美法侖(melphalan),絲裂黴素(mitomycin) C,苯丁酸氮芥(chlorambucil),柔紅黴素(daunorubicin)或其它嵌入劑)；生長抑制劑；酶及其片段如核酸水解酶；抗生素；毒素如小分子毒素或細菌、真菌、植物或動物起源的酶促活性毒素，包括其片段和/或變體；和下面公開的各種抗腫瘤或抗癌劑。
[0122]「效應子功能」指那些可歸於抗體Fe區且隨抗體同種型而變化的生物學活性。抗體效應子功能的實例包括=Clq結合和補體依賴性細胞毒性(CDC) ；Fc受體結合；抗體依賴性細胞介導的細胞毒性(ADCC);吞噬作用；細胞表面受體(例如B細胞受體)下調jPB細胞活化。
[0123]試劑例如藥物製劑的"有效量"是指在需要的劑量和時間階段有效獲得所需的治療或預防結果的量。
[0124]術語「Fe區」在本文中用於定義免疫球蛋白重鏈的C端區域，所述區域包含至少一部分的恆定區。該術語包括天然序列Fe區和可變Fe區。在一個實施方案中，人IgG重鏈Fe區從Cys226或Pro230延伸至重鏈的羰基端。然而，Fe區的C端賴氨酸(Lys447)可以存在或者可以不存在。除非另外說明，Fe區或恆定區中的胺基酸殘基的編號是根據EU編號系統，其也被稱為 EU 索引，如在 Kabat, E.A.等，Sequences ofProteins of ImmunologicalInterest (免疫學感興趣的蛋白質的序列)，第5版，Public Health Service, NationalInstitutes ofHealth, Bethesda, MD(1991), NIH Publication91—3242 中所述。[0125]"構架"或"FR"是指除高變區(HVR)殘基之外的可變結構域殘基。可變結構域的FR通常由四個FR結構域組成:FR1，FR2，FR3和FR4。因此，HVR和FR序列通常出現在VH(或 VL)的以下序列中:FR1—Hl(Ll)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。
[0126]術語「全長抗體」、「完整的抗體」和「完整抗體」在本文被可交換地用於指結構與天然抗體結構基本相似或具有包含如本文所定義的Fe區的重鏈的抗體。
[0127]術語"宿主細胞"、"宿主細胞系"和"宿主細胞培養物"被可交換地使用並且是指其中引入外源核酸的細胞，包括這種細胞的後代。宿主細胞包括"轉化體"和"轉化的細胞"，其包括初級轉化的細胞和來源於其的後代，而不考慮傳代的數目。後代在核酸含量上可能與親本細胞不完全相同，而是可以包含突變。本文中包括與在最初轉化的細胞中篩選或選擇的具有相同功能或生物學活性的突變體後代。
[0128]「人抗體」指具有這樣的胺基酸序列的抗體，所述胺基酸序列對應於這樣抗體的胺基酸序列，所述抗體由人或人細胞生成或來源於非人來源，其利用人抗體庫或其它人抗體編碼序列。人抗體的這種定義明確排除包含非人抗原結合殘基的人源化抗體。
[0129]「人共有構架」是指這樣的構架，即在選擇人免疫球蛋白VL或VH構架序列中，其代表最常出現的胺基酸殘基。一般而言，對人免疫球蛋白VL或VH序列的選擇是從可變結構域序列的亞型中選擇。一般而言，該序列的亞型是如Kabat，E.A.等，Sequencesof Proteins of Immunological Interest (免疫學感興趣的蛋白質的序列)，第五版，Bethesda MD(1991), NIH Publication91— 3242，卷 I一3 中的亞型。在一個實施方案中，對於VL，該亞型是如Kabat等(見上文)中的亞型κ I。在一個實施方案中，對於VH，該亞型是如Kabat等(見上文)中的亞型III。
[0130]「人源化」抗體是指包含來自非人HVR的胺基酸殘基和來自人FR的胺基酸殘基的嵌合抗體。在一些實施方案中，人源化抗體將包含基本上所有的至少一個、通常兩個可變結構域，其中所有或基本上所有的HVR(例如，CDR)對應於非人抗體的那些，並且所有或基本上所有的FR對應於人抗體的那些。人源化抗體任選可以包含至少一部分的來源於人抗體的抗體恆定區。抗體(例如非人抗體)的「人源化形式」是指已經進行了人源化的抗體。
[0131]術語「高變區」或「HVR」是指抗體可變結構域的每個區域，其序列高可變和/或形成結構上限定的環(「高變環」)。通常，天然四鏈抗體包含六個HVR;三個在VH(HI，H2，H3)中，三個在VL(L1，L2，L3)中。HVR通常包含來自高變環和/或「互補決定區」(CDR)的胺基酸殘基，後者具有最聞序列可變性和/或涉及抗原識別。不例性聞變環發生在氣基酸殘基26-32 (LI)，50—52 (L2) ,91—96 (L3)，26-32 (Hl)，53—55 (H2)，和 96 —101 (H3)。(Chothia,C.和 Lesk，A.M.,J.Mol.Biol.196 (1987) 901—917)。示例性 CDR(CDR_L1，CDR-L2，CDR-L3，CDR-Hl, CDR-H2，和 CDR-H3)發生在胺基酸殘基 LI 的 24-34，L2 的 50-56，L3 的 89-97，Hl的 31—35B，H2 的 50-65，和 H3 的 95—102。(Kabat, E.A.等，Sequences of Proteinsof Immunological Interest (免疫學感興趣的蛋白質的序列)，第5版，Public HealthService, National Institutes of Health, Bethesda, MD(1991), NIH Publication91—3242)。除了 VH中的⑶Rl，⑶R通常包含形成高變環的胺基酸殘基。⑶R還包含「特異性決定殘基」或「SDR」，其是與抗原接觸的殘基。SDR包含在被稱為縮短的(abbreviated)-OTR或 a-CDR 的 CDR 區域中。示例性 a-CDR(a_CDR-Ll， a_CDR_L2， a_CDR_L3， a-CDR-Hl，a-CDR-H2，和 a_CDR-H3)發生在胺基酸殘基 LI 的 31 — 34，L2 的 50-55，L3 的 89-96，Hl 的31—35B, H2 的 50—58，和 H3 的 95—102。(見 Almagro，J.C.和 Fransson，J.，Front.Biosc1.13 (2008) 1619—1633)。除非另外說明，可變結構域中的HVR殘基和其他殘基(例如，FR殘基)在本文中根據Kabat等(見上文)編號。
[0132]「免疫綴合物」是與一個或多個異源分子(包括但不限於細胞毒性劑)綴合的抗體。
[0133]「個體」或「受試者」是哺乳動物。哺乳動物包括但不限於，家養動物(例如，牛，羊，貓，狗和馬)，靈長類動物(例如，人和非人靈長類動物如猴)，兔，以及嚙齒類動物(例如，小鼠和大鼠)。在一些實施方案中，個體或受試者是人。
[0134]"分離的"抗體是這樣的抗體，其已經與其天然環境的組分分離。在一些實施方案中，將抗體純化至超過95%或99%純度，如通過例如電泳(例如，SDS-PAGE，等電聚焦(IEF)，毛細管電泳)或層析(例如，離子交換或反相HPLC)確定的。為了回顧用於評估抗體純度的方法，參見，例如，Flatman, S.等，J.Chromatogr.B848 (2007) 79-87。
[0135]"分離的"核酸是指這樣的核酸分子，其已經與其天然環境的組分分離。分離的核酸包括包含在通常包含該核酸分子的細胞中的核酸分子，但是該核酸分子存在於染色體外或在不同於其天然染色體位置的染色體位置處。
[0136]「分離的編碼抗-人EPO受體的抗體的核酸」是指一個或多個核酸分子，其編碼抗體重和輕鏈(或其片段)，包括在單一載體或分開的載體中的這樣的核酸分子，以及存在於宿主細胞中的一個或多個位置處的這樣的核酸分子。
[0137]術語「單克隆抗體」在用於本文時指從一群基本上同質的抗體中獲得的抗體，即除了可能的變體抗體(該變體抗體例如含有天然存在的突變或在產生單克隆抗體製劑的過程中出現，此類變體通常少量存在)外，構成群體的個體抗體是相同的和/或結合相同的表位。相比於通常包括針對不同決定簇(表位)的不同抗體的多克隆抗體製劑，單克隆抗體製劑中的每個單克隆抗體針對抗原上的單一`決定簇。因此，修飾語「單克隆」表明抗體從基本上同質的抗體群獲得的特徵，不應解釋為要求通過任何特定方法來生產抗體。例如，將根據本發明使用的單克隆抗體可通過多種技術來生成，包括但不限於雜交瘤法，重組DNA法，噬菌體展示法，和利用包含所有或部分的人免疫球蛋白基因座的轉基因動物的方法，這樣的方法和用於製備單克隆抗體的其他示例性方法描述於本文中。
[0138]"天然抗體"是指天然存在的具有變化的結構的免疫球蛋白分子。例如，天然IgG抗體是約150,000道爾頓的異源四聚體糖蛋白，其由兩個相同的輕鏈和兩個相同的重鏈組成，所述鏈通過二硫鍵結合。從N末端至C末端，每個重鏈具有可變區(VH)，其也被稱為可變重結構域或重鏈可變結構域，其後是三個恆定結構域(CH1，CH2和CH3)。類似地，從N末端到C末端，每個輕鏈具有可變區(VL)，其也被稱為可變輕結構域或輕鏈可變結構域，其後是恆定輕(CL)結構域。基於其恆定結構域的胺基酸序列，抗體的輕鏈可以被分配給被稱為kappa (K)和lambda ( λ )的兩個類型中的一個。
[0139]術語「可獲自人內皮細胞」在全細胞的情況中表示多聚甲醛固定的過程，而在組織切片的情況中表示去石蠟過程之後，在檸檬酸緩衝液中在97°C進行45min的表位回收。
[0140]術語「包裝說明書」用於指通常包括在治療產品的商品包裝中的使用說明，其包含關於適應徵、用法、劑量、給藥、組合療法、禁忌症的信息和/或關於使用這樣的治療產品的
敬生
目口 ο[0141]相對於參比多肽序列的「百分比)胺基酸序列同一性」定義為在將所述序列進行比對(並在必要時導入空位)以獲取最大百分比序列同一性，且不將任何保守取代視為序列同一性的部分之後，候選序列中的胺基酸殘基與參比多肽序列中的胺基酸殘基相同的百分數。可使用本領域各種方法進行序列比對以便測定百分比胺基酸序列同一性，例如，使用公眾可得到的計算機軟體如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign (DNASTAR)軟體。本領域技術人員可以決定測量比對的適宜參數，包括對所比較的序列全長獲得最大比對所需的任何算法。然而，為此目的，％胺基酸序列同一性值使用序列比較電腦程式ALIGN-2產生。ALIGN-2序列比較電腦程式的作者是Genentech，lnc，並且原始碼已經隨用戶文檔提交至美國版權局(Washington D.C.，20559)，其美國版權註冊登記號為TXU510087。公眾可通過Genentech, Inc.(South San Francisco, California)得到 ALIGN-2 程序，或者可以從原始碼編譯。ALIGN-2程序應當為在UNIX作業系統、包括數字UNIXV4.0D上使用而進行編譯。ALIGN-2程序設定了所有序列比對參數並且不變。
[0142]在ALIGN-2應用於胺基酸序列比較的情況中，給定胺基酸序列A相對於(to)、與(with)、或針對(against)給定胺基酸序列B的％胺基酸序列同一'丨生(或者這樣說:給定胺基酸序列A具有或含有相對於、與或針對給定胺基酸序列B的某一 ％胺基酸序列同一性)如下計算:
[0143]100乘以X /Y比值
[0144]其中X是用序列比對程序ALIGN-2在該程序的A和B比對中評分為相同匹配的胺基酸殘基數，且其中Y是B中的胺基酸殘基總數。可以理解，當胺基酸序列A與胺基酸序列B的長度不相等時，A相對於B的％胺基酸序列同一性將不等於B相對於A的％胺基酸序列同一性。除非另外具體說明，在本文用的所有％胺基酸序列同一性的值都是用ALIGN-2電腦程式如前段所描述的那樣得到的。
[0145]術語「藥物製劑」指這樣的製劑，其以允許包含在其中的活性成分的生物學活性有效的形式存在，並且不包含對施 用所述製劑的受試者具有不可接受的毒性的另外的成分。
[0146]「藥用載體」是指藥物製劑中不同於活性成分的成分，其對受試者是無毒的。藥用載體包括但不限於緩衝劑、賦形劑、穩定劑或防腐劑。
[0147]除非另外說明，術語「ΕΡ0受體」是指來自任何脊椎動物來源(包括哺乳動物如靈長類動物(例如人)和嚙齒類動物(例如，小鼠和大鼠))的任何天然EPO受體。該術語包括「全長」未加工的人EPO受體以及由細胞內加工產生的任何形式的人EPO受體。該術語還包括人EPO受體的天然存在的變體，例如，剪接變體或等位變體。示例性人EPO受體的胺基酸序列顯示在SEQ ID NO:03中。
[0148]術語「治療(treatment)」(及其語法變化如「治療(treat) 」或「treating」)指在嘗試改變待治療的個體的天然進程中的臨床幹預，並且可以為了預防或在臨床病理學的進程中進行。治療的理想效果包括但不限於防止疾病發生或復發，緩和症狀，消除疾病的任何直接或間接病理學後果，預防轉移，減少疾病進展速率，改善或減輕疾病狀態，和症狀緩解或改善的預後。在一些實施方案中，將本發明的抗體用於延緩疾病的發生或減緩疾病的進展。
[0149]術語「可變區」或「可變結構域」是指參與抗體與抗原結合的抗體重或輕鏈的結構域。天然抗體的重鏈和輕鏈(VH和VL，分別地)的可變結構域通常具有相似的結構，其中每個結構域包含四個保守的構架區(FR)和三個高變區(HVR)。(參見，例如，Kindt,T.J.等，Kuby Immunology,第 6 版，W.H.Freeman and C0., N.Y.(2007)91 頁)。單個VH或VL結構域可以足以給予抗原結合特異性。此外，可以使用來自與特定抗原結合的抗體的VH或VL結構域來分離結合所述抗原的抗體，以分別篩選互補VL或VH結構域的文庫。參見，例如，Portolano, S.等，J.1mmunol.150 (1993) 880-887 ；Clackson, T.等，Nature352(1991)624-628。
[0150]術語"載體"是指能夠增殖與其相連的另一個核酸的核酸分子。該術語包括作為自我複製核酸結構的載體以及結合到已經引入其的宿主細胞的基因組中的載體。一些載體能夠指導與其可操作相連的核酸的表達。這樣的載體在本文中被稱為"表達載體"。
[0151]I1.組合物和方法
[0152]在一方面中，本發明部分基於這樣的發現，即特異性結合人EPO受體(尤其是SEQID NO:01的人EPO受體片段)的抗體，不顯示與人上皮或內皮細胞交叉反應或交叉結合。在一些實施方案中，提供結合人EPO受體的抗體。本發明的抗體可以例如用於診斷或治療貧血或癌症。本發明的抗體也可以用於在施用增加紅細胞數目的藥物之前(尤其是在施用紅細胞生成素之前)給患者分層(stratification)。
[0153]A.示例的抗-人EPO受體的抗體
[0154]在一個方面中，本發明提供結合人EPO受體的分離的抗體。在一些實施方案中，抗-人EPO受體的抗體結合人EPO受體片段LPGPGGSVDIV(EpoR(361—371) ；SEQ ID NO:01)。
[0155]
【權利要求】
1.體外檢測人EPO受體的方法，所述方法包括以下步驟: 通過將樣品與特異性結合人EPO受體片段LPGPGGSVDIV(SEQ ID NO:01)的EPO受體的抗體溫育，體外確定所述樣品中人EPO受體的存在，由此體外檢測人EPO受體， 其中所述特異性結合EPO受體片段LPGPGGSVDIV(SEQ ID NO:01)的EPO受體的抗體不特異性結合具有約66kD分子量的可獲自人內皮細胞的蛋白質。
2.特異性結合人EPO受體的抗體，其特徵在於所述抗體結合人EPO受體片段LPGPGGSVDIV(SEQ ID NO:01)並且不特異性結合具有約66kD分子量的可獲自人內皮細胞的蛋白質。
3.能夠用於根據權利要求1所述的方法的特異性結合人EPO受體的抗體。
4.根據權利要求3所述的抗體，其特徵在於所述抗體結合EPO受體片段LPGPGGSVDIV(SEQ ID NO:01)並且不特異性結合具有約66kD分子量的可獲自人內皮細胞的蛋白質。
5.特異性結合人EPO受體的抗體在檢測人EPO受體中的用途，其特徵在於所述抗體結合EPO受體片段LPGPGGSVDIV(SEQ ID NO:01)並且不特異性結合具有約66kD分子量的可獲自人內皮細胞的蛋白質。
6.預測或確定患者對增加紅細胞數目的藥物的反應性的方法，所述方法包括: -通過將所述患者的樣品與權利要求2至4所述的EPO受體的抗體體外溫育和體外確定權利要求2至4所述的抗體與所述樣品的結合，體外確定人EPO受體在所述患者的癌細胞上的存在，和 -將人EPO受體在所述患者的·癌細胞上的存在與所述患者對增加紅細胞數目的藥物的反應性相關聯。
7.用於製備特異性結合人EPO受體的抗體的方法，所述方法包括以下步驟: -用包含EPO受體片段LDKWLLPRNPPSEDLPGPGGSVDIV(SEQ ID NO:02)的多肽免疫動物，和 -選擇特異性結合EPO受體片段LPGPGGSVDIV(SEQ ID NO:01)的抗體並且由此製備特異性結合人EPO受體的抗體。
8.根據權利要求1或6或7所述的方法，根據權利要求2至4中任一項所述的抗體，或根據權利要求5所述的用途，其特徵在於所述抗體不特異性結合具有約58kD至約70kD分子量的可獲自人內皮細胞的蛋白質。
9.根據權利要求1或6至8中任一項所述的方法，根據權利要求2至4或8中任一項所述的抗體，或根據權利要求5或8的用途，其特徵在於所述抗體以IO-3M或更高的親和力結合可獲自人內皮細胞的蛋白質。
10.根據權利要求1或6至9中任一項所述的方法，根據權利要求2至4、8或9中任一項所述的抗體，或根據權利要求5或8或9所述的用途，其中所述抗體是多克隆抗體或單克隆抗體。
11.根據權利要求1或6至10中任一項所述的方法，根據權利要求2至4或8至10中任一項所述的抗體，或根據權利要求5或8至10中任一項所述的用途，其中所述抗體是人抗體、人源化抗體或嵌合抗體。
12.根據權利要求1或6至11中任一項所述的方法，根據權利要求2至4或8至11中任一項所述的抗體，或根據權利要求5或8至11中任一項所述的用途，其中所述抗體是結合人EPO受體的抗體片段。
13.藥物製劑，其包含權利要求2至4中任一項所述的抗體和藥用載體。
14.分離的核酸，其編碼根據權利要求2至4中任一項所述的抗體。
15.宿主細胞，其包含權利要求14所述的核酸。
16.診斷試劑盒，其包含根據權利要求2至4中任一項所述的抗體。
17.根據權利要求2至4中任一項所述的抗體在分析人組織或細胞樣品中的EPO受體中的用途。
18.根據權利要求17所述的用途，其特徵在於所述樣品是人組織或細胞的溶解產物，或人組織的切片，或新鮮人組織的切片，或冷凍的人組織，或冷凍的人組織的切片，或福馬林固定的石蠟包埋的人組織，或福馬林固定的石蠟包埋的人組織的切片。
19.根據權利要求17或18中任一項所述的用途，其特徵在於所述分析通過免疫化學，免疫螢光或免疫組織化學進行。
20.根據權 利要求17至18中任一項所述的用途，其特徵在於所述分析通過蛋白質印跡進行。
【文檔編號】C07K16/28GK103596984SQ201280029140
【公開日】2014年2月19日 申請日期:2012年6月14日 優先權日:2011年6月15日
【發明者】米夏埃多·雅爾施, 奧拉夫·蒙迪戈爾 申請人:霍夫曼-拉羅奇有限公司