檢測bcrp基因中g34a和c421a兩個位點基因型的方法
2023-05-15 15:08:31 2
專利名稱：檢測bcrp基因中g34a和c421a兩個位點基因型的方法
技術領域：
本發明涉及利用螢光定量PCR的方法測定人類乳腺癌耐藥蛋白(BCRP)基因中 G34A和C421A兩個位點基因型的方法。
背景技術：
作為"第三代DNA遺傳標記"的單核苷酸多態性標記SNP (single皿cleotide Poly =rphismS， SNP)具有位點豐富、具代表性、遺傳穩定性和分析自動化的等特點，是研究藥 物基因組學的分子基礎。人類基因序列的變異大多數是SNP，但在不同的人群中SNP的分布 存在差異，這些差異可以代表某一種族或某人群間的遺傳變異.因此，研究SNP有助於解釋 個體的表型差異、不同群體和個體對疾病，特別是對複雜疾病的易感性以及對各種藥物的 耐受性和對環境因素反應的差異。如果確定了某SNP的基因型與某種腫瘤易感性的強相關 關係，就可以此SNP作為分子遺傳標記，進行分子標記診斷，在流行病學調查中確定患某種 腫瘤的高危人群，以及進行患病危險程度評價，達到有效的一級預防目的。
BC RP < A BCG2基因位於染色體22，由655個胺基酸組成，編碼72_kDa的跨膜蛋 白。BCRP抗體在胎盤上皮、腸上皮、乳腺導管等處表達。從結構上看，它只有一個ATP結合 區、一個跨膜區，與MDR基因不同。構造上的獨特提示其藥物轉運機制可能與其它ABC轉運 蛋白不同。BCRP基因表達增加可以在多種不同類型的耐藥腫瘤中觀察到。
由於BCRP基因G34A(Vail2Met)和C421A(Glnl41Lys)多態性存在較高頻率且高 發於大多數種族人群中，研究發現它的表達與BCRP蛋白活性有關。不同基因型所表達的 BCRP蛋白活性也不盡相同，在人胎盤組織中，421A等位基因純合子的蛋白水平比421C等位 基因純合子要低很多，同時雜合子則介於中間水平與野生等位基因型對比，34A和42A等位 基因變異可降低BCRP轉運蛋白活性。許多研究結果顯不BCRP基因G34A和C421A多態性 與DLBCL易感和生存相關。 本發明通過設計特殊的螢光定量PCR的核酸引物和探針來檢測BCRP基因G34A和 C421A位點的多態性，避免了測序的繁瑣過程，從而可以更加準確、快速、方便地實現基因型 的檢測。 發明概述 本發明提供了一種用於測定人類乳腺癌耐藥蛋白基因(BCRP)中G34A和C421A兩 個位點基因型的方法，該方法通過一組特殊的、用於螢光定量PCR反應的探針，對包括血液 樣本在內的多種樣本進行處理，分析其結果而判斷出基因型。
附圖簡述 圖l.樣本中BCRP基因G34A位點G/A基因型的兩種探針的螢光定量PCR的圖形。
圖2.樣本中BCRP基因G34A位點G/G基因型的兩種探針的螢光定量PCR的圖形。
圖3.樣本中BCRP基因G34A位點A/A基因型的兩種探針的螢光定量PCR的圖形。
圖4.樣本中BCRP基因C421A位點C/A基因型的兩種探針的螢光定量PCR的圖形。
圖5.樣本中BCRP基因C421A位點C/C基因型的兩種探針的螢光定量PCR的圖形。
發明詳述
3
本發明提供了在人類細胞、組織和包括血清和唾液在內的體液中檢測BCRP基因中G34A和C421A兩個位點基因型的方法。 在實施方案中，本發明提供了一種測量血液樣本中BCRP基因中G34A和C421A兩個位點基因型的方法，該方法通過使用螢光定量PCR，利用兩組特殊探針對樣本進行處理，其中每種探針都只會與一種特定的基因型核酸結合，通過對這一組探針對同一樣本處理的結果判斷G34A和C421A兩個位點的基因型。通過測序證實基於這種方法的判斷是準確的。
實施例 以下的實施例用於為本領域中的普通技術人員提供有關如何實施和使用本發明的完整披露和描述，並且這些例子並非意在對本發明者所認為的發明範圍進行限制，亦非意指下文的實驗是被實施的全部實驗而且是僅可實施的實驗。 實施例1 :血滴樣本中BCRP某因G34A位點G/A某因型的兩種探針的螢光定量PCR白勺賺。 我們分別使用SEQ ID NO. 2和SEQ ID NO. 3的核酸引物及SEQID NO. 6和SEQ IDNO. 7的核酸探針，使用螢光定量PCR對同一樣本進行處理，得到
圖1中的一組圖形，判斷該樣本G34A位點的基因型為G/A。該結果通過測序得到確證。 實施例2 :血液樣本中BCRP某因G34A位點G/G某因型的兩種探針的螢光定量PCR白勺賺。 我們分別使用SEQ ID NO. 2和SEQ ID NO. 3的核酸引物及SEQID NO. 6和SEQ IDNO. 7的核酸探針，使用螢光定量PCR對同一樣本進行處理，得到圖1中的一組圖形，判斷該樣本G34A位點的基因型為G/G。該結果通過測序得到確證。 實施例3 :血液樣本中BCRP基因G34A位點A/A基因型的兩種探針的螢光定暈PCR的圖形。 我們分別使用SEQ ID NO. 2和SEQ ID NO. 3的核酸引物及SEQID NO. 6和SEQ IDNO. 7的核酸探針，使用螢光定量PCR對同一樣本進行處理，得到圖1中的一組圖形，判斷該樣本G34A位點的基因型為A/A。該結果通過測序得到確證。 實施例4 :血液樣本中BCRP基因C421A位點C/A基因型的兩種探針的螢光定暈PCR的圖形。 我們分別使用SEQ ID NO. 4和SEQ ID NO. 5的核酸引物及SEQID NO. 8和SEQ IDN0.9的核酸探針，使用螢光定量PCR對同一樣本進行處理，得到圖1中的一組圖形，判斷該樣本C421A位點的基因型為C/A。該結果通過測序得到確證。 實施例5 :血液樣本中BCRP基因C421A位點C/C基因型的兩種探針的螢光定暈PCR的圖形。 我們分別使用SEQ ID NO. 4和SEQ ID NO. 5的核酸引物及SEQIDNO. 8和SEQ ID
N0.9的核酸探針，使用螢光定量PCR對同一樣本進行處理，得到圖1中的一組圖形，判斷該
樣本C421A位點的基因型為C/C。該結果通過測序得到確證。 序列表 〈110〉天津腫瘤醫院 〈120〉檢測BCRP基因中G34A和C421A兩個位點基因型的方法
〈130〉〈150〉
〈151〉2008-12-19
〈160〉9
〈210〉1
〈211〉2418
〈212〉DNA
〈213〉人BCRP序列〈400〉1ggg鄉鄉cggtggtcttgatcccaacattcctgagcctgtcttccagtcgcgacagctcatctgctat
C3C3ggtgg3
attatctgga鄉ttecgtggttctcagcateacagggtcgtttatccgtcactgatcctaaatgctgtccattcatcag
ttetcactgt
agcctgtgga
ttacatcctt
■tgtcg^gtccaatgacccgagtea^ctcgaatatcaggcaaatcttgatgttctga
gctcttcggc
ggtgtgtctgtccatcttgtcttttgctcccctcgatattatgttccacg
gaggcctetettccactgct gtggcattea 3C3gag皿g3ttcc皿gcag gateagccac tcateg皿皿ctec皿3g3g 3c皿皿gctg皿ttecatc3cacagtcttc aaggagatca gctecaccacc皿gcgttca ttc皿3皿ct tgctgggteararagtcgte ctgggactgg tteteggtgctgg皿tccag皿cag3gctg gggttctctttgtttcagcc gtggaactct ttgtggtegacggatectec agagtgtcat cttetttcctgacgatgtte ccaagtette tetttecctgaaaggcagat gccttcttcg ttetgatgtt
gg33ctgggt aggatttegg ^cgcaccgt gcacatgctt 60actgctgctt tagagtttgt ttggaaggtc cgggtgactc 120aattgttaaa gcgctgcctc cgagcgcacg catcctgaga 180ccgagctcta ttaagctgaa aagataaaaa ctctccagat 240tttttatccc agtgtcacaa ggaaacacca atggcttccc 300tgaaggcatt tactgaagga gctgtgttaa gttttcataa 360tg33g3gtgg ctttctecct tgtcg^^c cagttg3g^ 420atgggatcat gaaacctggt ctcaacgcca tcctgggacc 480cgttettega tgtcttegct gc^gga^g atcc^gtgg 540taaatggagc accgcgacct gccaatttca aatgtaattc 600atgttgtgat gggcactctg 3cggtgagag ^^ctteca 660ttgc^c^c tetgacg^t catg^^^ 3cg^cggat 720teggtctgga te^gtggca gactcc^gg ttgg^ctca 780gaggag^3g 3^^ggact 3gtetegg33 tggagcttet 840tcttggatga gcctacaact ggcttagact caagcacagc 900tgaaaaggat gtctaagcag ggacgaacaa tcatcttctc 960ccatcttcaa gttgtttgat agcctcacct tattggcctc 1020ggcctgctca ggaggccttg ggatactttg aatcagctgg 1080ataaccctgc agacttcttc ttggacatca ttaatggaga 1140
gCC3C3g3g3tcategagcc1200
3ttegcggagatttetgtcaactcctcctt1260
actttccgggggtg卿卿1320
ctccttctgtcatcaactcagatgggtttc1380
tccccaggcctctetegctcagatcattgt1440
catttectttgggcte皿皿atgattctec1500
cttcctgacgaccaaccagtgtttcagcag1560
g皿g皿gctcttcatecatg皿tecatc3g1620
tgg皿皿ctgttetctgatttettecccat1680
tetegtgtecttcatgtteggattg皿gcc1740
tecccttetgatggtggcttattcagccag1800
5
ttccatggcactggccatagcagcaggtca gagtgtggtt tctgtagcaa cacttctcat1860gaccatctgttttgtgtttatgatgatttt ttcaggtctg ttggtcaatc tcacaaccat1920tgcatcttggctgtcatggcttcagtectt cagcattcca cgatetggat ttecggcttt1980gcagcateatgaatttttggg3C朋朋Ctt CtgCCC3gg3 ctC朋tgC朋C3gg朋3C朋2040tccttgteactetgcaacatgtectggcga ag朋tetttg gtaaagcagg gcatcgatct2100ctcaccctggggcttgtggaagaatcacgt ggccttggct tgtatgattg ttettttcct2160cacaattgcctecctg朋attgttatttct teaaaaatat tctteaattt cccctteatt2220cagtatgatttatcctcacataaaaaagaa gcactttgat tgaagtattc aatcaagttt2280ttttgttgttttctgttcccttgccatcac actgttgcac agcagcaatt gtttteaaga2340gatecattttteg朋atcac幼c3朋ctga atte朋c;atg a朋g幼ccca朋朋朋朋ga2400tetcactcagcateatga2418〈210>2〈211>21〈212>DNA〈213〉人BCRP引物〈400>25， _tcaggtcattggaagctgtcg_3，〈210>3〈211>23〈212>DNA〈213〉人BCRP引物〈400>35' _gtcacctagtgtttgcaatctca_3，〈210>4〈211>19〈212>DNA〈213〉人BCRP引物〈400>45， -3gttgttgc朋gccg朋g3-3，〈210>5〈211>20〈212>DNA〈213〉人BCRP引物55， _tgttgtgatgggcactctga_3，〈210>6〈211>15〈212>DNA〈213〉人BCRP探針
6
〈400>65' -tccttgtgacactgg-3'〈210>7〈211>17〈212>DNA〈213〉人BCRP探針75' _tttccttgtgacattgg_3，〈210>8〈211〉16〈212>DNA〈213〉人BCRP探針〈400>85， -ctgctgagaactggaa-3，〈210>9〈211>17〈212>醒〈213〉人BCRP探針〈400>95， 一ctgctgag朋ctgt朋g-3，
權利要求
一種用於測定人類乳腺癌耐藥蛋白基因(BCRP)中G34A和C421A兩個位點基因型的方法，該方法包括(a)以二種人類BCRP特異性化合物與人類細胞相接觸從而形成二種化合物-BCRP的多複合物；以及(b)通過檢測該複合物的存在及其比例而對該細胞BCRP中G34A和C421A兩個位點基因型進行測定；其中BCRP特異性化合物選自結合BCRP的核酸引物和探針，所述核酸引物和探針包括反義寡聚物、siRNA以及shRNA，這些探針應與BCRP DNA雜交，其中BCRP的核酸序列為SEQ ID No1，或者任何與Seq ID No1具有至少80％相同性的序列。
2. 權利要求l中的方法，其中細胞選自腎上腺細胞、腦細胞、乳腺細胞、結腸細胞、上皮 細胞、內皮細胞、心臟細胞、免疫細胞、腎臟細胞、肝細胞、肺細胞、卵巢細胞、胰腺細胞、前列 腺細胞、皮膚細胞、脾細胞、胃細胞、睪丸細胞、甲狀腺細胞、子宮細胞和脈管細胞、癌細胞或 處於腫瘤微環境中的細胞。
3. 權利要求2的方法，其中上皮細胞選自內皮細胞、非膠質神經細胞、結腸細胞、乳腺 細胞、腎臟的近小管細胞、前列腺的平滑肌細胞、子宮的平滑肌細胞以及睪丸的平滑肌細 胞。
4. 權利要求2的方法，其中免疫細胞選自多形核白細胞、單核細胞、巨噬細胞、上皮樣 細胞、巨大細胞、小神經膠質細胞、肝巨噬細胞和肺泡巨噬細胞。
5. 權利要求2的方法，其中該癌細胞選自肺癌、乳腺癌、直腸結腸癌、類癌瘤、胃癌、神 經膠質瘤、肝細胞瘤、平滑肌肉瘤、肝癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌、頭頸癌、陰道或睪丸癌、腦 瘤、子宮頸癌、食道癌、淋巴瘤、惡性黑素瘤、間皮瘤、骨髓瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、甲 狀腺癌、腎細胞癌、眼癌、橫紋肌肉瘤、肉瘤、未分化瘤以及白血病。
6. 權利要求2的方法，其中該處於腫瘤微環境中的細胞選自膠質纖維原細胞、膠質單 核細胞和成肌纖維細胞。
7. 權利要求2的方法，其中用於測定BCRP基因中G34A位點基因型的核酸引物序列為 SEQ ID NO. 2和SEQ ID NO. 3，用於測定BCRP基因中C421A位點基因型的核酸引物序列為 SEQ ID NO. 4和SEQ ID NO. 5。
8. 權利要求2的方法，其中用於測定BCRP基因中G34A位點基因型的核酸探針序列為 SEQ ID NO. 6和SEQ ID NO. 7，用於測定BCRP基因中C421A位點基因型的核酸探針序列為 SEQ ID NO. 8和SEQ ID NO. 9。
全文摘要
本發明涉及利用螢光定量PCR的方法測定人類乳腺癌耐藥蛋白(BCRP)基因中G34A和C421A兩個位點基因型的方法。
文檔編號C12Q1/02GK101760516SQ20081018831
公開日2010年6月30日 申請日期2008年12月25日 優先權日2008年12月25日 公開號200810188315.8
發明者閻昭 申請人:天津醫科大學附屬腫瘤醫院