一種甲、乙型流感病毒的快速檢測方法及試劑盒的製作方法

2023-05-15 16:49:51 1

專利名稱：一種甲、乙型流感病毒的快速檢測方法及試劑盒的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種甲、乙型流感病毒的快速檢測方法及試劑盒，屬於流感監測領域。
基於上述原因，目前建立了許多快速檢測法間接或直接免疫螢光法；ELISA；RT-PCR法；新神經氨酸酶測定法；Diretigen FLU-A KIT和FLU OIA KIT等。這些方法的敏感性和特異性在檢測過程中隨著實驗室、工作人員、操作方法和標本的不同而異，同時需要一定的特殊設備，價格昂貴，指示系統多採用免疫螢光標記或酶標記，操作複雜，基層單位難以開展。上述所提到的新神經氨酸酶測定法，Diretigen FLU-A KIT和FLU OIA KIT雖然能在30分鐘內得出結果，但其敏感性很低，在採集的標本中病毒含量需要達到1000～2000個融斑形成單位或至少含有20個或以上呼吸道脫落細胞方可測出陽性的結果，並且無法獲得活病毒。
為實現上述目的，本發明採取以下技術方案本發明的原理是(1)流感病毒與紅細胞相互作用甲、乙型流感病毒在較高溫度下，依靠其血凝素蛋白很快吸附到紅細胞表面，同時又可通過其表面的神經氨酸酶蛋白迅速地從吸附的紅細胞表面游離下來，再去吸附其他的紅細胞，而被吸附過的紅細胞由於其表面受體受到了損傷，不再被同種病毒所吸附。
(2)花生凝集素(Arachis Lectin or Peanut Agglutinin，簡稱PNA)與細胞結合的特異性正常宿主細胞及人、豚鼠和雞紅細胞表面受體為含有神經氨酸的糖蛋白或糖脂，PNA不與之作用；但是當這些細胞被神經氨酸酶作用後，細胞表面受體上的神經氨酸就被游離下來，因而就能夠被PNA識別並聚集。這種聚集現象通過普通光學顯微鏡就可清楚地觀察到，並根據結果作出判斷。
一種甲、乙型流感病毒的快速檢測方法，該方法包括下列步驟(一)接種用pH7.5±0.1的Hank’s液洗滌長成單層的MDCK細胞兩遍，加入標本接種液，置33～35℃，CO2孵箱吸附1～3小時；(二)培養吸掉接種液，用相同的Hank’s液洗滌三遍，以將殘餘的唾液酸酶洗淨、防止其與紅細胞作用；加入維持液和紅細胞，輕輕搖勻，置33～35℃，CO2孵箱孵育16～18小時；(三)檢測加入工作濃度的PNA混勻，再置33～35℃，CO2孵箱孵育1～3小時，取出，輕搖，將與MDCK細胞不發生聚集的紅細胞搖起，然後在普通光學顯微鏡下觀察結果。
一種用於檢測甲、乙型流感病毒的快速檢測試劑盒，該試劑盒包括下列溶液A液洗滌液，即pH7.5±0.1的Hank’s液；B液pH7.5±0.1的Eagle溶液；C液胰蛋白酶；D液花生凝集素(PNA)。作為原料的PNA可購得或自行製備。
該試劑盒還包括E液1％豚鼠或人的紅細胞(A、B、AB、O型均可)，此液也可由使用者自行配製。
本發明的優點是適用性廣、靈敏度高、指示系統簡易且清晰、能夠獲得活病毒、可排除副流感病毒的幹擾、可防止口、咽、鼻中唾液酸酶對測定的影響，便於基層單位開展工作。
(2)提取將乾燥物移入500ml三角燒瓶中，放入一個磁力棒，加入pH7.4，0.1M PBS 500ml，置攪拌器上攪拌3～4小時，停機讓其自然沉澱20～30分鐘，吸出上清置4℃保存。按同法再重複3次。
(3)過濾於乾淨的漏鬥頸部鬆鬆地置入一條脫脂棉，將收集到的上清通過脫脂棉進行過濾。如遇到不易過濾時，可從漏鬥中取出上清，將用過的脫脂棉取出，換新漏鬥按同法過濾或將漏鬥衝洗乾淨，放入新的脫脂棉，然後再放入上清進行過濾。
(4)加防腐劑於濾液中加入終濃度為0.5‰的疊氮鈉(NaN3)，混勻，置4℃保存。實施例2、PNA工作濃度的確定在MDCK細胞上進行方陣測定，選一株當時在人群中流行的甲1(H1N1)或甲3(H3N2)亞型毒株，將其稀釋成10-1～10-8，與不同濃度(1∶20～1∶640)PNA進行方陣測定，在24小時內，最低濃度的PNA能測出最高稀釋度病毒神經氨酸酶活性者為PNA的工作濃度。實施例3、紅細胞終濃度的測定新鮮採集的豚鼠紅細胞，用Eagle’s液，先配成1％，然後用前用同樣溶液進行倍比稀釋，對6株病毒分兩批進行測定TCID50值，每株均測定兩次，兩次的平均值列於表1。表1病毒紅細胞終濃度/ml1‰ 0.5‰ 0.25‰ 0.125‰A/CNIC/143/2001(H1N1)6.56.56.05.5A/CNIC/123/2001(H3N2)5.55.55.03.5B/Shandong/1/20025.55.54.53.5B/Sichuan/63/20013.53.53.5＜2.0A/Guangzhou/333/99(H9N2) 4.54.54.53.5A/Hongkong/156/97(H5N1) 4.53.53.03.0正常雞胚尿囊液 ＜1.0 ＜1.0 ＜1.0 ＜1.0
由實驗結果得到測定中最佳紅細胞終濃度為1‰。實施例4、不同種類紅細胞對測定敏感性的影響同一時間，在同一條件下採集豚鼠，人A型、B型、O型和AB型紅細胞，立即按同法，在同一條件下配製1％，而測定病毒分三批進行測定，每株病毒測兩次，然後算出其平均值的TCID50。
測定結果指出不同紅細胞間見不到有差異，它們的TCID50按表1列出毒株從上到下順序為6.5，5.5，4.5，2.5，4.5和5.5。對正常雞胚尿囊液進行同樣的測定，TCID50均為＜1.0，表明不發生任何特異性聚集。實施例5、本法與常規法的敏感性和特異性的比較1、用已知病毒進行比較病毒按Lg稀釋，按上述方法接種、吸附、洗滌，然後分成兩組，實驗組(本法)和對照組(常規法)，同樣進行兩次重複測定，算出24h內觀察結果平均的TCID50。結果見表2，括號外為CPE值，括號內為HA值。表2病毒 測定方法 相差Lg常規法 本法A/CNIC/143/2001(H1N1) 2.5(2.5)7.0 4.5A/CNIC/123/2001(H3N2) ＜2.0(＜2.0)5.5 ≥3.5B/Shandong/1/2002 ＜2.0(＜2.0)4.5 ≥2.5B/Sichuan/63/2001 ＜2.0(＜2.0)4.0 ≥2.0A/Guangzhou/333/99(H9N2) ＜2.0(＜2.0)4.5 ≥2.5A/Hongkong/156/97(H5N1) 2.5(2.5)5.5 3.0Para influenza I ＜1.0(＜1.0)＜1.0Para influenza II ＜1.0(＜1.0)＜1.0Para influenza III＜1.0(＜1.0)＜1.0表2結果指出，本法比常規法至少敏感100倍以上，最多可達30000倍以上。同時清楚表明本法測不出副流感病毒I-III型神經氨酸酶活性的存在，從而證明本法可以排除副流感病毒的幹擾。2、對未知標本進行比較共比較79份從流感樣患者採集的標本，本法與常規法共分離到陽性標本40份，陽性率達51％，其中甲3亞型17份，甲1亞型15份，乙型8份，而且兩者標本號也相符，即兩者符合率達100％。實施例6、用本發明方法在24孔板中進行檢測長成單層的MDCK細胞，用pH7.4的Hank’s液洗3遍，標明每孔接種標本的名稱和號碼，每標本可接種1～2孔，0.5ml/孔，置33～35℃，CO2孵箱吸附2小時。吸掉接種液，再用相同的Hank’s液洗3遍，每孔加入0.9ml維持液(不含小牛血清，但含有終濃度為2.5μg/ml胰酶，1‰紅細胞(人或豚鼠的)，pH7.5～7.6的Eagle’s液)，輕輕搖勻，置33～35℃，CO2孵箱16~18小時，取出，每孔加入0.1ml工作濃度的PNA，混勻，再置33～35℃，CO2孵箱孵育2小時，取出，輕輕搖晃，將與MDCK細胞不發生聚集的紅細胞搖起，然後在普通光學低倍顯微鏡下觀察凡在MDCK細胞上能見到2個或2個以上典型的紅細胞聚集塊(像出血斑點)的可判為陽性；出現1個聚集塊判為可疑，再繼續孵育一天，如聚集塊僅有一個並不擴大，可判為陰性；不出現任何聚集塊的判為陰性。
為獲得具有較高紅細胞滴度的活病毒，可將顯示為陽性的培養板再孵育1～2天，收集維持液，並可進行型或亞型鑑定，然後凍存之。
如實驗室不具備CO2孵箱或細胞培養板，可用小方瓶或細胞管代替，具體方法同上。實施例7、快速檢測試劑盒的使用方法一種甲、乙型流感病毒的快速檢測試劑盒，該試劑盒由下列溶液構成A液洗滌液，即pH7.5±0.1的Hank’s液，(4℃保存)B液pH7.5±0.1的Eagle溶液，(4℃保存)；C液胰蛋白酶，(≤-20℃保存)；D液花生凝集素(PNA)，(4℃保存)；E液1％豚鼠或人的紅細胞(A、B、AB、O型均可)，(4℃保存)。
C液胰蛋白酶的工作濃度為2.5μg/ml，可用其它濃度(如250μg/ml)的胰蛋白酶稀釋到此工作濃度使用。
E液的配製方法(無菌操作)新鮮採集的紅細胞，1500rpm，離心3分鐘，棄上清，加入適量無菌生理鹽水(約紅細胞體積的5倍)，輕輕吹打混勻，1500rpm離心3分鐘，棄上清，按同法再洗兩遍。加入B液配製成1％濃度懸液，置4℃備用。
以24孔細胞板為例，介紹本發明試劑盒的使用方法1、孔中MDCK細胞已長成單層，倒掉生長液，加入A液，1ml/孔，輕輕搖動後，倒掉，按同法重複一次。
2、每孔標明接種標本名稱，接種採集標本，0.5ml/孔。
3、接種後塑料板置33～35℃，CO2孵箱孵育2小時。
4、配製細胞維持液0.9ml/孔，為留有餘地一般需配製24ml，取23.52mlB液，0.24mlC液和0.24mlE液，混勻。此比例適合於配製任何體積的細胞維持液。
5、吸出孵育後的接種液，加入A液，1ml/孔，輕輕搖動後，吸掉，按同法再重複兩次。
6、將4中配製好的維持液再次搖勻，然後每孔加入0.9ml。
7、將細胞板放入33～35℃，CO2孵箱孵育16～18小時。
8、稀釋D液把D液稀釋成工作濃度，如當前試劑盒所提供的即1mlD液，加入9mlB液，充分混勻，用時配製。
9、從孵箱中取出培養板，每孔加入0.1ml稀釋的D液(原則上所加的容量為維持液的1/10)，輕輕搖勻。
10、放入33～35℃，CO2孵箱孵育2小時。
11、取出，輕輕搖動細胞板，使未發生聚集紅細胞懸起，不致因堆積而影響結果的觀察，置低倍(約100倍)顯微鏡下觀察。
12、結果判斷凡在低倍顯微鏡下能見到兩個或兩個以上清晰的紅細胞聚集塊的判斷為陽性；一個為可疑，可置33～35℃，CO2孵箱再孵育一天，如果聚集塊增多或明顯擴大，判斷為陽性，反之為陰性；其餘情況為陰性。
本發明方法操作簡便，不需特殊設備，只要能開展組織培養工作的單位均可加以使用；敏感性強，24小時內觀察結果，它比常規法敏感100-10000倍以上；特異性強，其病毒分離情況與常規法符合率達100％；快速，在流感監測中，一般20小時內就可得出準確結果，節省了經費和雞胚。
權利要求
1.一種甲、乙型流感病毒的快速檢測方法，其特徵在於該方法包括下列步驟(一)接種用pH7.5±0.1的Hank’s液洗滌長成單層的MDCK細胞，加入標本接種液，置33～35℃，CO2孵箱吸附1～3小時；(二)培養吸掉接種液，用相同的Hank’s液洗滌，加入維持液和紅細胞，輕輕搖勻，置33～35℃，CO2孵箱孵育16～18小時；(三)檢測加入工作濃度的PNA混勻，再置33～35℃，CO2孵箱孵育1～3小時，取出，輕搖，將與MDCK細胞不發生聚集的紅細胞搖起，然後在普通光學顯微鏡下觀察結果。
2.一種甲、乙型流感病毒的快速檢測試劑盒，其特徵在於該試劑盒包括下列溶液A液洗滌液，即pH7.5±0.1的Hank’s液；B液pH7.5±0.1的Eagle溶液；C液胰蛋白酶；D液花生凝集素(PNA)。
3.如權利要求2所述的一種甲、乙型流感病毒的快速檢測試劑盒，其特徵在於該試劑盒還包括E液1％豚鼠紅細胞或人的紅細胞。
4.如權利要求2或3所述的一種甲、乙型流感病毒的快速檢測試劑盒，其特徵在於C液胰蛋白酶的濃度為250μg/ml。
全文摘要
本發明公開了一種甲、乙型流感病毒的快速檢測方法和試劑盒，該方法包括(一)接種用pH7.4的Hank’s液洗滌長成單層的MDCK細胞，加入接種液，置33～35℃，CO
文檔編號C12Q1/04GK1464065SQ0212135
公開日2003年12月31日 申請日期2002年6月14日 優先權日2002年6月14日
發明者郭元吉, 溫樂英, 王敏, 張燁, 郭俊峰, 李梓 申請人:中國疾病預防控制中心病毒病預防控制所