一種精子染色質擴散實驗檢測精子dna碎片的方法

2023-05-15 10:27:51

專利名稱：一種精子染色質擴散實驗檢測精子dna碎片的方法
技術領域：
本發明涉及醫學臨床上使用的試劑，是一種精子染色質擴散實驗檢測精子 DNA碎片的方法。
背景技術：
目前，世界許多國家都在研究精子成熟過程中因受內外環境影響形成 DNA碎片出現的DNA完整性異常，從而引起的精子形態和功能異常。由於在 男性不育檢測中DNA的完整性是精液的常規檢測，也是評估男性不育的主要 指標，因此，如何檢測精子DNA完整性是生殖醫學領域研究的重要課題之一。 國外比較領先的檢測方法為精子染色質擴散試驗，其英文名為sperm chromatin dispersion,簡稱SCD，其商品化的試驗盒已推廣使用。SCD檢測方 法具有較多優點，例如簡單、快速、準確、解析度高等，但是，由於試劑盒 包含智慧財產權，因此該試劑盒價格昂貴，受此限制，目前在我國尚未推廣應用， 並且，這種試劑盒中的精子核蛋白裂解液採用聚乙二醇辛基苯基醚，十二垸基 碘酸鈉等成份，這些成份均為化學試劑，其異味、刺激性及腐蝕性較大，並具 有毒性成份，汙染環境等。

發明內容
本發明的目的是，提供一種精子染色質擴散實驗檢測精子DNA碎片的方 法，使它具有造價低、無腐蝕，無毒，操作簡便，易於推廣的優點。
本發明為實現上述目的，通過以下技術方案實現 一種精子染色質擴散實驗檢測精子DNA碎片的方法，其步驟如下① 精確配製精子裂解液精子裂解液為每100毫升蒸餾水中含三羥甲基氨基甲垸4.844克、氯化鈉 11.7克、二硫蘇糖醇1.86克、皂角提取物8.12克及乙二胺四乙酸二鈉鹽12.32 克，PH值為7.5;② 將裂解液置入4'C保存2周，使用前L5小時取出，置入22'C室溫內；③ 將精液稀釋至5—10X10Vml，在室溫37°(:下將0.31111的精液稀釋，加 入0.7毫升的1%低熔點瓊脂糖內，混勻；④ 取稀釋精液50微升置入用0.65%瓊脂糖處理好的載玻片上，蓋上22X 22mm蓋玻片，放置在冰箱內5分鐘，冰箱內溫度為4'C;⑤ 冰箱內取出後將蓋玻片移走，將載玻片水平浸入0.08摩爾鹽酸(HC1) 中變性7分鐘取出；⑥ 步驟⑤中取走的載玻片再水平浸入步驟①中所述的精子裂解液中20分鐘；⑦ 將步驟(D中的載玻片緩衝液衝洗5分鐘，緩衝液中各物質及含量為三 羥甲基氨基甲垸10.78克/升，硼酸5.5克/升及乙二胺四乙酸二鈉鹽0.58克/升；@用70%、卯％、 100%乙醇各2分鐘脫水；(D用瑞氏法或姬姆薩一瑞氏法或天藍法染精子，在光學顯微鏡下觀察分析 精子DAN碎片。本發明的方法,為我國推廣應用SCD方法檢測精子DNA完整性提供了重 要的基礎。本發明所述方法中採用的裂解液用皂角或桔梗提取物替代了化學試 劑，從而減少了化學試劑的應用，減少汙染、無刺激性、無腐蝕、無毒，並使裂解液製造成本大幅降低，易於推廣應用。本發明裂解液為精子染色質擴散實 驗試劑盒的裂解液，試驗結果表明採用本發明所述的裂解液用SCD方法檢測精子DNA完整性的效果與國外同類試劑盒的檢測效果完整性一致。SCD試 驗後經染色能夠在光學顯微鏡下清晰的觀察保留尾巴的單個精子DNA的完整 性，根據暈環的大小，能夠準確判定精子DNA是否有碎片，從而對男性生育 力進行準確評估。本發明所述方法可由附圖l、 2、 3、 4、 5、 6、 7中清楚得出正常精子沒 有DNA碎片，具有大大的暈環或中等暈環，如附圖l、 2所示，存在DNA碎 片的精子沒有暈環形成或有很小的暈環，或沒有暈環且著色很淡，呈退化跡象， 如附圖3、 4、 5所示。上述試驗進一步表明，本發明方法能夠準確判定精子 DNA是否具有完整性。上述試驗結果還可具體描述為計數500個精子，觀 察精子暈環大小，根據暈環與精子頭部橫徑的比例，粗分為大、中、小和無暈 環4個等級，大和中暈環表示精子DNA完整無碎片，小和無暈環表示精子DNA 斷裂為碎片。小暈環以《精子頭直徑四分之一為判斷標準，中暈環>精子頭直 徑四分之一而《精子頭直徑三分之二，大環暈>精子頭直徑三分之二。本發明方法中的裂解液所含的皂角或桔梗提取物不使蛋白變性，絲毫不破 壞精子尾部。本發明方法中所述的裂解液實現了精子DNA檢測簡單、快趙、 準確、廉價、解析度高的目的。本發明的方法還具有操作簡便、準確性好，分 辨率高及成本低等優點。本發明的方法以試劑盒商品推廣應用，試劑盒包括1、 DNA變性染液；2、 精子核蛋白裂解液；DNA變性染液為公知技術。


附圖1是呈現大暈環的正常精子；附圖2是呈現中暈環的正常精子；附圖 3是呈現極小暈環的有DNA碎片的異常精子；附圖4是沒有暈環的有DNA碎 片的異常精子；附圖5是沒有暈環且退化的精子；附圖3、 4、 5所示均為有 DNA碎片的異常精子；附圖6是有三個正常精子和一個異常精子的圖片；附 圖7是有兩個正常精子和三個異常精子的圖片。上述圖片均為採用本發明方法進行檢驗的結果。
具體實施方式
本發明所述的一種精子染色質擴散實驗檢測精子DNA碎片的方法，其步 驟如下① 精確配製精子裂解液精子裂解液為每100亳升蒸餾水中含三羥甲基氨基甲烷4.844克、氯化鈉 11.7克、二硫蘇糖醇1.86克、皂角或桔梗提取物8.12克及乙二胺四乙酸二鈉 鹽12.32克，PH值為7，5;② 將裂解液置入4'C保存2周，使用前1.5小時取出，置入22'C室溫內；③ 將精液稀釋至5—10X106/1111，在室溫37'C下將(Uml的精液稀釋，加 入0.7毫升的1V。低熔點瓊脂糖內，混勻；④ 取稀釋精液50微升置入用0.65%瓊脂糖處理好的載玻片上，蓋上22 X 22mm蓋玻片，放置在冰箱內5分鐘，冰箱內溫度為4'C;(D冰箱內取出後將蓋玻片移走，將載玻片水平浸入0.08摩爾鹽酸(HC1) 中變性7分鐘取出；⑥ 步驟⑤中取走的載玻片再水平浸入步驟①中所述的精子裂解液中20分
鍾；
⑦ 將步驟⑥中的載玻片緩衝液衝洗5分鐘，緩衝液中的各物質及含量為 三羥甲基氨基甲烷10.78克/升、硼酸5.5克/升及乙二胺四乙酸二鈉鹽0.58克/ 升；
@用70%、 90%、 100%乙醇各2分鐘脫水；
(D用瑞氏法或姬姆薩一瑞氏法或天藍法染精子，在光學顯微鏡下觀察分析 精子DAN碎片。
權利要求
1、一種精子染色質擴散實驗檢測精子DNA碎片的方法，其特徵在於其步驟如下①精確配製精子裂解液精子裂解液為每100毫升蒸餾水中含三羥甲基氨基甲烷4.844克、氯化鈉11.7克、二硫蘇糖醇1.86克、皂角提取物8.12克及乙二胺四乙酸二鈉鹽12.32克，PH值為7.5；②將裂解液置入4℃保存2周，使用前1.5小時取出，置入22℃室溫內；③將精液稀釋至5-10×106/ml，在室溫37℃下將0.3ml的精液稀釋，加入0.7毫升的1％低熔點瓊脂糖內，混勻；④取稀釋精液50微升置入用0.65％瓊脂糖處理好的載玻片上，蓋上22×22mm蓋玻片，放置在冰箱內5分鐘，冰箱內溫度為4℃；⑤冰箱內取出後將蓋玻片移走，將載玻片水平浸入0.08摩爾鹽酸(HCl)中變性7分鐘取出；⑥步驟⑤中取走的載玻片再水平浸入步驟①中所述的精子裂解液中20分鐘；⑦將步驟⑥中的載玻片緩衝液衝洗5分鐘，緩衝液中各物質及含量為三羥甲基氨基甲烷10.78克/升，硼酸5.5克/升及乙二胺四乙酸二鈉鹽0.58克/升；⑧用70％、90％、100％乙醇各2分鐘脫水；⑨用瑞氏法或姬姆薩-瑞氏法或天藍法染精子，在光學顯微鏡下觀察分析精子DAN碎片。
全文摘要
本發明公開了一種精子染色質擴散實驗檢測精子DNA碎片的方法，其步驟如下①精確配製精子裂解液；②將裂解液置入4℃保存2周，使用前1.5小時取出，置入22℃室溫內；③將精液稀釋至5-10×106/ml；④取稀釋精液50微升放置在冰箱內5分鐘，冰箱內溫度為4℃；⑤冰箱內取出後將蓋玻片移走，將載玻片水平浸入鹽酸中變性7分鐘取出；⑥步驟⑤中取走的載玻片再水平浸入步驟①中所述的精子裂解液中20分鐘；⑦將步驟⑥中的載玻片緩衝液衝洗5分鐘；⑧用乙醇各2分鐘脫水；⑨用瑞氏法或姬姆薩-瑞氏法或天藍法染精子，在光學顯微鏡下觀察分析精子DAN碎片。本發明方法實現了精子DNA檢測簡單、快速、準確、廉價、解析度高的目的。
文檔編號G01N1/30GK101319251SQ20081001650
公開日2008年12月10日 申請日期2008年5月28日 優先權日2008年5月28日
發明者張麗紅, 王磊光, 毅 邱 申請人:山東省計劃生育科學技術研究所