具有酯酶活性的多肽和編碼該多肽的核酸的製作方法

2023-05-15 09:00:26

專利名稱：：具有酯酶活性的多肽和編碼該多肽的核酸的製作方法
技術領域：
：本發明涉及具有酯酶活性的分離的多肽和編碼所述多肽的分離的核酸序列。本發明還涉及包含所述核酸序列的核酸構建體、載體和宿主細胞，以及用於產生和使用所述多肽的方法。
背景技術：
：植物細胞壁多糖約構成植物細胞壁的90%，並且能分成三組纖維素，半纖維素和果膠。纖維素代表細胞壁多糖的主要成分。半纖維素是植物細胞壁第二豐富的成分。主要的半纖維素聚合物是木聚糖。木聚糖骨架的生物降解依賴於兩類酶內切木聚糖酶和β-木糖苷酶。內切木聚糖酶(EC3.2.1.8)將木聚糖骨架切割成更小的寡糖，其可以進一步由β-木糖苷酶(EC3.2.1.37)降解成木糖。其它與木聚糖降解有關的酶包括，例如，乙醯木聚糖酯酶，阿拉伯糖酶，α-葡糖醛酸糖苷酶，酯酶，和對-香豆酸酯酶。W002/12472公開了能夠立體選擇性水解手性酯和水解阿魏酸酯的酯酶。Faulds和Williamson，1991，J.Gen.Microbiol.137:2339-2345描述了來自橄欖色鏈黴菌(Sti^ptomycesolivochromogenes)的4_羥基-3-甲氧基-肉桂(阿魏)酸酯酶的純化和表徵。Faulds和Williamson，1994，Microbiology140:779_787，描述了來自黑麴黴(Aspergillusniger)的阿魏酸酯酶的純化和表徵。Kroon等，1996，Biotechnol.Appl.Biochem.23:255-262描述了由糖甜菜粕上黑麴黴生長而誘導的新酯酶的純化和表徵。deVries等，1997，Appl.Environ.Microbiol.63:4638-4644公開了來自黑麴黴和塔賓麴黴(Aspergillustubingensis)的酉旨酶基因。Castanares等，1992,EnzymeMicrobiol.Technol.14:875_884，描述了來自嗜松青黴(Penicillumpinophilu)的阿魏醯基/對-香豆醯基酯酶的純化和性質。本發明涉及具有酯酶活性的多肽和編碼所述多肽的多核苷酸。發明概述本發明人分離了具有酯酶活性的來自漆斑菌屬菌種(Myrotheciumsp.)的酯酶。所述新酯酶與已知的胺基酸序列具有少於30%的非常低的同一性。本發明人還分離了編碼該新酯酶的基因，並將其克隆入大腸桿菌菌株。本發明涉及具有酯酶活性的分離的多肽，所述多肽選自下組(a)包含胺基酸序列的多肽，所述胺基酸序列與SEQIDNO2的成熟多肽具有至4少45%同一性；(b)由多核苷酸編碼的多肽，所述多核苷酸在至少中嚴格條件下與以下雜交(i)SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列，(ii)包含於SEQIDNO1的成熟多肽編碼序列中的cDNA序列，或(iii)⑴或的全長互補鏈；(c)由多核苷酸編碼的多肽，所述多核苷酸包含與SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列具有至少45%同一性的核苷酸序列；(d)SEQIDNO2的成熟多肽的包含取代、缺失和/或插入一個或幾個胺基酸的變體。本發明還涉及編碼具有酯酶活性的多肽的分離的多核苷酸，所述多核苷酸選自下組(a)編碼包含胺基酸序列的多肽的多核苷酸，所述胺基酸序列與SEQIDNO2的成熟多肽具有至少45%同一性；(b)多核苷酸，其在至少中嚴格條件下與以下雜交(i)SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列，(ii)包含於SEQIDNO1的成熟多肽編碼序列中的cDNA序列，或(iii)(i)或的互補鏈；(c)多核苷酸，其包含與SEQIDNO=I的成熟多肽編碼序列具有至少45%同一性的核苷酸序列；(d)多核苷酸，其編碼SEQIDNO2的成熟多肽的包含取代、缺失和/或插入一個或幾個胺基酸的變體。本發明還涉及包含所述多核苷酸的核酸構建體、重組表達載體和重組宿主細胞，和產生具有酯酶活性的多肽的方法。本發明還涉及抑制多肽在細胞中表達的方法，其包括對細胞施用雙鏈RNA(dsRNA)分子或在細胞中表達雙鏈RNA(dsRNA)分子，其中dsRNA包括本發明的多核苷酸的亞序列。本發明還涉及此種雙鏈抑制性RNA(dsRNA)分子，其中任選地該dsRNA是siRNA或miRNA分子。本發明還涉及降解包含木聚糖的材料的方法。本發明還涉及包含分離的多核苷酸的植物，所述多核苷酸編碼此種具有酯酶活性的多肽。本發明還涉及用於產生此種具有酯酶活性的多肽的方法，其包括(a)在有助於產生該多肽的條件下培養包含多核苷酸的轉基因植物或植物細胞，所述多核苷酸編碼具有阿魏酸酯酶的多肽；和(b)回收所述多肽。本發明進一步涉及包含編碼蛋白質的基因的核酸構建體，其中將所述基因可操作地連接於編碼信號肽的核苷酸序列，所述信號肽包含SEQIDNO:2的胺基酸1至20或由SEQIDNO2的胺基酸1至20組成，其中所述基因對於所述核苷酸序列是外源的。附圖簡述酯酶活性術語「酯酶活性」定義為在稱作水解的與水進行的化學反應中將酯分解為酸和醇的水解酶活性(EC3.1.1.)。就本發明而言，酯酶活性是根據實施例1中所述的在PNPB底物中確定酯酶活性的方法來確定的。在本領域公知(EC3.1.1.)包含的酯酶可選自例如阿魏酸酯酶(EC3.1.1.73)、乙醯木聚糖酯酶(EC3.1.1.72)、蛋白質-穀氨酸甲基酯酶(EC3.1.1.61)、羧基酯酶(EC3.1.1.1)、芳基酯酶(EC3.1.1.2)、乙醯基酯酶(EC3.1.1.6)、膽鹼酯酶(EC3.1.1.8)、甾醇酯酶(EC3.1.1.13),α-胺基酸酯酶(EC3.1.1.43)等等。本發明的多肽具有SEQIDNO:2的成熟多肽的酯酶活性的至少20%，優選至少40%，更優選至少50%，更優選至少60%，更優選至少70%，更優選至少80%，甚至更優選至少90%，最優選至少95%，並且甚至最優選至少100%。分離的多肽術語「分離的多肽」用於本文中指由來源分離的多肽。在一個優選的方面，多肽是如通過SDS-PAGE測定的，至少純，優選至少5%純，更優選至少10%純，更優選至少20%純，更優選至少40%純，更優選至少60%純，甚至更優選至少80%純，並且最優選至少90%純的多肽。基本上純的多肽術語「基本上純的多肽」在本文表示多肽製備物，所述多肽製備物含有按重量計至多10%，優選至多8%，更優選至多6%，更優選至多5%，更優選至多4%,更優選至多3%，甚至更優選至多2%，最優選至多1%，並且甚至最優選至多0.5%的與其天然或重組結合的(associated)的其它多肽材料。因此，優選所述基本上純的多肽是按存在於製備物中的全部多肽材料的重量計至少92%純，優選至少94%純，更優選至少95%純，更優選至少96%純，更優選至少96%純，更優選至少97%純，更優選至少98%純，甚至更優選至少99%，最優選至少99.5%純，並且甚至最優選100%純。本發明的多肽優選是基本上純的形式，即，所述多肽製備物基本上(essentially)不含與其天然或重組結合的其它多肽材料。例如，這能夠通過以下實現通過公知的重組方法或由經典純化方法製備多肽。成熟多肽術語「成熟多肽」在本文中定義為具有酯酶活性的多肽，所述多肽以其在翻譯和任何翻譯後修飾之後的最終形式存在，所述修飾例如N-末端加工、C-末端截短、糖基化、磷酸化等。在一個優選的方面，根據預測SEQIDNO:2的胺基酸1至20是信號肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQIDNO2的胺基酸21至520。成熟多肽編碼序列術語「成熟多肽編碼序列」在本文中定義為編碼具有酯酶活性的成熟多肽的核苷酸序列。在一個優選的方面，根據預測SEQIDN0:1的核苷酸1至60編碼信號肽的SignalP程序，成熟多肽編碼序列是SEQIDNO=I的核苷酸61至1560。同一性由參數「同一性」描述的兩個胺基酸序列之間或兩個核苷酸序列之間的相關性。就本發明而言，兩個胺基酸序列之間的同一性程度使用如EMBOSS軟體包(EMBOSS:TheEuropeanMolecularBiologyOpenSoftwareSuite,Rice等，2000,TrendsinGenetics16:276-277)的Needle程序，優選3.0.0版或更高版本中執行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch，1970，J.Mol.Biol.48:443-453)來確定。使用的任選參數為缺口罰分(gappenalty)10，缺口延伸罰分(gapextensionpenalty)0.5和EBL0SUM62取代矩陣(BL0SUM62的EMBOSS版)。使用Needle標記為「最高同一性(longestidentity)，，(使用-nobrief選項獲得)的輸出結果作為百分比同一性，並計算如下(相同的殘基X100)/(比對長度-比對中缺口的總數)就本發明而言，兩個核苷酸序列之間的同一性程度使用如EMBOSS軟體包(EMBOSSTheEuropeanMolecularBiologyOpenSoftwareSuite，Rice等，2000，見上文)的Needle程序，優選3.0.0或更高版本中執行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和mmSCh，1970，見上文)來測定。使用的任選參數為缺口罰分10，缺口延伸罰分0.5和EDNAFULL取代矩陣(NCBINUC4.4的EMBOSS版)。使用Needle標記為「最高同一性」的輸出結果(使用-nobrief選項獲得)作為百分比同一性，並計算如下(相同的脫氧核糖核苷酸X100)/(比對長度-比對中缺口的總數)同源序列術語「同源序列」在本文中定義為預測的蛋白質，其在用SEQIDNO2的漆斑菌屬菌種酯酶或其成熟多肽進行的tfasty搜索(Pearson，W.R.，1999，於BioinformaticsMethodsandProtocols,S.Misener禾口S.A.Krawetz編，pp.185-219)中給出小於0.001的E值(或期望值)。多肽片段術語「多肽片段」在本文中定義為從SEQIDNO2的成熟多肽或其同源序列的氨基和/或羧基末端缺失一個或多個(幾個)胺基酸的多肽；其中所述片段具有酯酶活性。在一個優選的方面，片段含有SEQIDNO:2的成熟多肽或其同源序列的至少250個胺基酸殘基，更優選至少300個胺基酸殘基，並且最優選至少450個胺基酸殘基。亞序列術語「亞序列(subsequence)」在本文中定義為從SEQIDNO1的成熟多肽編碼序列或其同源序列的5』和/或3』端缺失一個或多個(幾個)核苷酸的核苷酸序列；其中所述亞序列編碼具有酯酶活性的多肽片段。在一個優選的方面，亞序列含有SEQIDNO1的成熟多肽編碼序列或其同源序列的至少750個核苷酸，更優選至少900個核苷酸，並且最優選至少1350個核苷酸。等位變體(allelicvariant)術語「等位變體」在本文中表示佔據相同染色體基因座的基因的任何兩種或兩種以上可選形式。等位變異通過突變天然地發生，並且可導致種群內的多態性。基因突變可以是沉默的(在編碼的多肽中無變化)或可以編碼具有改變的胺基酸序列的多肽。多肽的等位變體是由基因的等位變體編碼的多肽。分離的多核苷酸術語「分離的多核苷酸」用於本文中指從來源分離的多核苷酸。在一個優選的方面，多核苷酸是如通過瓊脂糖電泳測定的，至少純，優選5%純，更優選至少10%純，更優選至少20%純，更優選至少40%純，更優選至少60%純，甚至更優選至少80%純，並且最優選至少90%純的多核苷酸。基本上純的多核苷酸術語「基本上純的多核苷酸」用於本文指不含其它外來的或不期望的核苷酸的多核苷酸製備物，並且所述多核苷酸製備物處於適合於在遺傳工程的蛋白質生產體系中使用的形式。因此，基本上純的多核苷酸含有按重量計至多10%，優選至多8%，更優選至多6%，更優選至多5%，更優選至多4%，更優選至多3%，甚至更優選至多2%，最優選至多1%，並且甚至最優選至多0.5%的與其天然或重組結合的其它多核苷酸材料。然而，基本上純的多核苷酸可包括天然存在的5』和3』非翻譯區，如啟動子和終止子。優選基本上純的多核苷酸是按重量計至少90%純，優選至少92%純，更優選至少94%純，更優選至少95%純，更優選至少96%純，更優選至少97%純，甚至更優選至少98%純，最優選至少99%，並且甚至最優選至少99.5%純的。本發明所述多核苷酸優選為基本上純的形式。具體而言，優選在本文公開的多核苷酸是「基本上(essentially)純的形式」，即，所述多核苷酸製備物基本上不含與其天然或重組結合的其它多核苷酸材料。所述多核苷酸可以是基因組、cDNA、RNA、半合成、合成來源的，或它們的任何組合。編碼序列當用於本文時術語「編碼序列」的意思是直接指定其蛋白產物的胺基酸序列的核苷酸序列。編碼序列的邊界通常由開讀框決定，所述開讀框通常以ATG起始密碼子或可供選擇的起始密碼子例如GTG和TTG開始，並且以終止密碼子例如TAA、TAG和TGA結束。編碼序列可以是DNA、cDNA、合成或重組核苷酸序列。cDNA:術語「cDNA」在本文中定義為能夠通過反轉錄從得自真核細胞的成熟的、已剪接的mRNA分子製備的DNA分子。cDNA缺少通常存在於相應基因組DNA中的內含子序列。起始的(initial)、初級的RNA轉錄物是mRNA的前體，其通過一系列的步驟加工然後作為成熟的已剪接的mRNA出現。這些步驟包括通過稱為剪接的過程去除內含子序列。因而源自mRNA的cDNA沒有任何內含子序列。核酸構建體術語「核酸構建體」用於本文指單鏈或雙鏈的核酸分子，所述核酸分子分離自天然存在的基因，或將所述核酸分子以本來不存在於(nototherwiseexist)自然界中的方式修飾以含有核酸的區段，或所述核酸是合成的。當所述核酸構建體含有表達本發明的編碼序列所需的調控序列時，術語核酸構建體與術語「表達盒」同義。調控序列(controlsequence)術語「調控序列」在本文定義為包括對編碼本發明多肽的多核苷酸表達是必需的所有成分。各個調控序列對於編碼所述多肽的核苷酸序列可以是天然的或外源的，或各個調控序列對於彼此可以是天然的或外源的。這些調控序列包括但不限於前導序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、啟動子、信號肽序列和轉錄終止子。最少的情況，調控序列包括啟動子和轉錄和翻譯的終止信號。調控序列可以和用於引入特異性限制位點的接頭一起提供，所述特異性限制位點促進調控序列與編碼多肽的核苷酸序列編碼區的連接。可操作地連接術語「可操作地連接」在本文表示這樣的構型，其中將調控序列置於相對於多核苷酸序列的編碼序列的適當位置，使得調控序列指導多肽編碼序列的表達。表達術語「表達」包括涉及多肽產生的任何步驟，其包括但不限於轉錄、轉錄後修飾、翻譯、翻譯後修飾和分泌。表達載體術語「表達載體」在本文定義為線性的或環狀的DNA分子，其包含編碼本發明多肽的多核苷酸，並且所述多核苷酸與提供用於其表達的額外核苷酸可操作地連接。宿主細胞如本文中所使用的術語「宿主細胞」包括任何細胞類型，所述細胞類型對於使用包含本發明多核苷酸的核酸構建體或表達載體的轉化、轉染、轉導等是易感的(susceptible)0修飾術語「修飾」在本文的意思是，對由SEQIDNO2的成熟多肽或其同源序列組成的多肽的任何化學修飾，以及對編碼所述多肽的DNA的遺傳操作。所述修飾可以是一個或多個(幾個)胺基酸的取代、缺失和/或插入，以及一個或多個(幾個)胺基酸側鏈的置換。人工變體當用在本文時，術語「人工變體」的意思是具有酯酶活性的多肽，所述多肽由表達SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列或其同源序列的修飾的多核苷酸序列的生物體產生。所述修飾的核苷酸序列通過人為幹預(humanintervention)，通過修飾SEQIDN0:1中公開的多核苷酸序列或其同源序列來獲得。發明詳述具有酯酶活性的多肽在第一個方面，本發明涉及包含胺基酸序列的分離的多肽，所述胺基酸序列與SEQIDNO2的成熟多肽具有優選至少45%，更優選至少50%，更優選至少55%，更優選至少65%，更優選至少70%，更優選至少75%，甚至更優選至少80%，最優選至少85%，且甚至最優選至少90%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%或至少99%的同一性程度，所述多肽具有酯酶活性(下文中的「同源多肽」)。在一個優選的方面，所述同源多肽具有胺基酸序列，其與SEQIDNO:2的成熟多肽相差十個胺基酸，優選相差五個胺基酸，更優選相差四個胺基酸，甚至更優選相差三個胺基酸，最優選相差兩個胺基酸，並且甚至最優選相差一個胺基酸。本發明的多肽優選包含SEQIDNO2的胺基酸序列或其等位變體；或它們的具有酯酶活性的片段。在一個優選的方面，多肽包含SEQIDNO:2的胺基酸序列。在另一個優選方面，多肽包含SEQIDNO2的成熟多肽。在另一個優選方面，多肽包含SEQIDNO2的胺基酸21至520，或其等位變體；或它們的具有酯酶活性的片段。在另一個優選方面，多肽包含SEQIDNO2的胺基酸21至520。在另一個優選方面，多肽由SEQIDNO2的胺基酸序列或其等位變體；或它們的具有酯酶活性的片段組成。在另一個優選方面，多肽由SEQIDNO:2的胺基酸序列組成。在另一個優選方面，多肽由SEQIDNO:2的成熟多肽組成。在另一個優選方面，多肽由SEQIDNO2的胺基酸21至520或其等位變體；或它們的具有酯酶活性的片段組成。在另一個優選方面，多肽由SEQIDNO2的胺基酸21至520組成。在第二個方面，本發明涉及具有酯酶活性的分離的多肽，所述分離的多肽由多核苷酸編碼，所述多核苷酸在優選非常低嚴格條件下，更優選低嚴格條件下，更優選中嚴格條件下，更優選中-高嚴格條件下，甚至更優選高嚴格條件下，並且最優選非常高嚴格條件下，與以下雜交(i)SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列，(ii)包含於SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列中的cDNA序列，(iii)(i)或(ii)的亞序列，或(iν)(i)、(ii)或(iii)的全長互補鏈(J.Sambrook,E.F.Fritsch,禾口T.Maniatis,1989,MolecularCloning,ALaboratoryManual，第2版，ColdSpringHarbor,NewYork)。SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列的亞序列含有至少100個連續的核苷酸或優選至少200個連續的核苷酸。此外，所述亞序列可編碼具有酯酶活性的多肽片段。在一個優選的方面，所述互補鏈是SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列的全長互補鏈。SEQIDNO=I的核苷酸序列或其亞序列，以及SEQIDNO2的胺基酸序列或其片段，可用於設計核酸探針，以根據本領域內公知的方法從不同屬和種的菌株鑑定和克隆編碼具有酯酶活性的多肽的DNA。具體而言，根據標準的Southern印跡方法，可將這些探針用於與感興趣的屬或種的基因組或cDNA雜交，以鑑定和從其中分離相應的基因。這些探針可明顯短於完整序列，但長度上應為至少14，優選至少25，更優選至少35，並且最優選至少70個核苷酸。然而，優選所述核酸探針是至少100個核苷酸長度。例如，所述核酸探針的長度可為至少200個核苷酸，優選至少300個核苷酸，更優選至少400個核苷酸，或最優選至少500個核苷酸。甚至可以使用更長的探針，例如，長度是優選至少600個核苷酸，更優選至少700個核苷酸，更優選至少800個核苷酸，或最優選至少900個核苷酸的核酸探針。DNA和RNA探針二者均可使用。通常將探針標記以探測相應的基因(例如，用％PJH、35S、生物素或抗生物素蛋白(avidin)標記)。將這些探針涵蓋於本發明中。因而，可從由這些其它菌株製備的基因組DNA或cDNA文庫中篩選DNA，所述DNA與上述探針雜交並且編碼具有酯酶活性的多肽。可以通過瓊脂糖或聚丙烯醯胺凝膠電泳，或通過其它分離技術分離來自這些其它菌株的基因組或其它DNA。可以將來自文庫的DNA或分離的DNA轉移至硝化纖維素(nitrocellulose)或其它合適的載體材料並且固定於其上。為了鑑定與SEQIDNO:1或其亞序列同源的克隆或DNA，將所述載體材料優選用在Sounthern印跡中。就本發明而言，雜交表示核苷酸序列在非常低至非常高的嚴格條件下與標記的核酸探針雜交，所述核酸探針對應於SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列；包含於SEQIDNO=I的成熟多肽編碼序列中的cDNA序列，其全長互補鏈；或它們的亞序列。可使用例如X射線片(X-rayfilm)檢測在這些條件下與核酸探針雜交的分子。在一個優選的方面，核酸探針是SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列。在另一個優選方面，核酸探針是SEQIDNO:1的核苷酸61至1560。在另一個優選方面，核酸探針是編碼SEQIDNO:2的多肽的多核苷酸序列，或其亞序列。在另一個優選方面，核酸探針是SEQIDNO:1。在另一個優選方面，核酸探針是包含在大腸桿菌(E.coli)DSM19428中的質粒中含有的多核苷酸序列，其中所述其多核苷酸序列編碼具有酯酶活性的多肽。在另一個優選方面，核酸探針是包含在大腸桿菌DSM19428中的質粒中含有的成熟多肽編碼區。對於長度至少100個核苷酸的長探針，將非常低至非常高的嚴格條件定義為在42°C，在5XSSPE、0.3%SDS、200yg/ml已剪切並且變性的鮭精DNA中，並且對於非常低和低嚴格性為25%的甲醯胺、對於中和中-高嚴格性為35%的甲醯胺、或對於高和非常高嚴格性為50%的甲醯胺，根據標準的Southern印跡法進行預雜交和雜交最佳12至M小時。對於長度為至少100個核苷酸的長探針，使用2XSSC、0.2%SDS優選至少在450C(非常低嚴格性)，更優選至少在50°C(低嚴格性)，更優選至少在55°C(中嚴格性)，更優選至少在60°C(中-高嚴格性)，甚至更優選至少在65°C(高嚴格性)，並且最優選至少在70°C(非常高嚴格性)將載體材料最終洗滌三次，每次15分鐘。對於長度大約15個核苷酸至大約70個核苷酸的短探針，將嚴格條件定義為在比牛艮據Bolton禾口McCarthy計算法(1962，ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA48:1390)得出的Tm低大約5°C至大約10°C，在0.9MNaCl，0.09MTris-HClpH7.6,6mMEDTA，0.5%NP-40,1XDenhardt溶液，ImM焦磷酸鈉(sodiumpyrophosphate)，ImM舞酸二S1IffcI(sodiummonobasicphosphate),0.ImMATP禾口0.2mg每ml的酵母RNA中，根據標準的Southern印跡步驟進行預雜交、雜交和雜交後洗滌最佳12至24小時。對於長度大約15個核苷酸至大約70個核苷酸的短探針，將所述載體材料在6XSSC加0.1%SDS中洗滌一次15分鐘，並用6XSSC在比計算的Tm低5°C至10°C的溫度洗滌兩次，每次15分鐘。在第三方面，本發明涉及具有酸酯酶活性的分離的多肽，其由包含核苷酸序列或由核苷酸序列組成的多核苷酸編碼，所述核苷酸序列與SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列具有優選至少45%，更優選至少50%，更優選至少55%，更優選至少65%，更優選至少75%，更優選至少80%，優選至少85%，甚至更優選至少90%，且甚至最優選至少95%、96%,97^^98%或99%的同一性程度，其編碼活性多肽。參見本文的多核苷酸部分。在第四方面，本發明涉及SEQIDNO:2的成熟多肽或其同源序列的包含取代、缺失和/或插入一個或多個(幾個)胺基酸的人工變體。優選地，胺基酸改變對性質是較不重要的(ofaminornature)，即保守的胺基酸取代或插入，其不顯著影響蛋白質的摺疊和/或活性；通常為1至大約30個胺基酸的小缺失；小的氨基或羧基末端延伸，例如氨基末端甲硫氨酸殘基；多至大約20-25個殘基的小接頭肽；或通過改變淨電荷或其它功能來促進純化的小延伸,如多組氨酸序列(polyhistidinetract)、抗原表位(antigenicepitope)或結合域(bindingdomain)。保守取代的實例是在以下組之內鹼性胺基酸組(精氨酸、賴氨酸和組氨酸)、酸性胺基酸組(穀氨酸和天冬氨酸)、極性胺基酸組(穀氨醯胺和天冬醯胺)、疏水胺基酸組(亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸)、芳族胺基酸組(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)和小胺基酸組(甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸和甲硫氨酸)。通常不改變比活性(specificactivity)的胺基酸取代是本領域已知的，並且由例如H.Neuratt^PR.L.Hill,1979，於TheProteins,AcademicPress,NewYork中描述。最普遍發生的交換是Ala/^er、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser,Ala/Gly,Ala/Thr,Ser/Asn.Ala/Val、Ser/Gly,Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu禾口Asp/Gly。除了20個基本胺基酸，非基本胺基酸(例如4-羥脯氨酸、6-N-甲基賴氨酸、2_氨基異丁酸、異纈氨酸和α-甲基絲氨酸)可以取代野生型多肽的胺基酸殘基。有限數量的非保守胺基酸、不由遺傳密碼編碼的胺基酸和非天然胺基酸可以取代胺基酸殘基。「非天然胺基酸」在蛋白質合成後已經過修飾，和/或在它們的側鏈具有不同於基本胺基酸的化學結構。非天然胺基酸能夠以化學方法合成，並且優選是商業上能夠獲得的，包括六氫吡啶羧酸(pipecolicacid)、噻唑燒羧酸(thiazolidinecarboxylicacid)、脫氫脯氨酸、3-和4-甲基脯氨酸，和3，3-二甲基脯氨酸。或者，胺基酸改變具有這樣的性質以使多肽的物理化學性質改變。例如，胺基酸改變可改進多肽的熱穩定性，改變底物特異性，改變最適PH等。能夠根據本領域已知的方法，例如定位誘變或丙氨酸分區誘變法(Cunningham和Wells，1989，ScienceM4:1081-1085)來鑑定親本多肽中的必需胺基酸。在後一技術中，將單一丙氨酸突變引入到分子中的每個殘基，並且測試所得突變分子的生物活性(即，酯酶活性)以鑑定對於所述分子的活性關鍵的胺基酸殘基。同樣參見Hilton等，1996，J.Biol.Chem.271:4699_4708。酶的活性部位或其它的生物相互作用也能夠通過結構的物理分析而測定，如通過以下這些技術如核磁共振、晶體學、電子衍射或光親和標記，連同推定的接觸位點胺基酸的突變來測定。參見例如deVos等，1992，Science255=306-312；Smith等，1992，J.Mol.Biol.224:899-904；Wlodaver等，1992，FEBSLett.309:59_64。必需胺基酸的同一性也能夠從與多肽的同一性分析來推斷，所述多肽與根據本發明的多肽相關。能夠使用已知的誘變、重組和/或改組(shuffling)方法，然後是有關的篩選方法，例如由Reidhaar-Olson禾口Sauer，1988，Science241:53-57；Bowie禾口Sauer，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:2152-2156；WO95/17413;或WO95/2洸25公開的那些方法來進行並測試單個或多個胺基酸取代、缺失和/或插入。能夠使用的其它方法包括易錯PCR、噬菌體展示(例如，Lowman等，1991，Biochem.30:10832-10837；美國專利號5，223，409；WO92/06204)和區域定向的誘變(Derbyshire等，1986，Gene46:145；Ner等，1988，DNA7:127)。誘變/改組方法能夠與高通量、自動化的篩選方法組合以檢測由宿主細胞表達的克隆的、誘變的多肽的活性(Ness等，1999，NatureBiotechnology17:893-896)。能夠從宿主細胞回收編碼活性多肽的誘變的DNA分子，並且使用本領域內標準方法快速測序。這些方法允許快速測定感興趣的多肽中單個胺基酸殘基的重要性，並且能夠應用於未知結構的多肽。SEQIDNO2的成熟多肽，如SEQIDNO2的胺基酸21至520的胺基酸取代、缺失和/或插入的總數是10，優選9，更優選8，更優選7，更優選至多6，更優選5，更優選4，甚至更優選3，最優選2，並且甚至最優選1。具有酯酶活性的多肽的來源本發明的多肽可以獲得自任何屬的微生物。就本發明而言，用於本文與給定的來源有關的術語「獲得自」，意思是核苷酸序列編碼的多肽由所述來源產生，或由其中插入了來自所述來源的核苷酸序列的菌株產生。在一個優選的方面，獲得自給定來源的多肽是胞外分泌的。本發明具有酯酶活性的多肽可以是細菌多肽。例如，所述多肽可以是具有酯酶活性的革蘭氏陽性細菌多肽例如芽孢桿菌屬(Bacillus)、鏈球菌屬(!印tococcus)、鏈黴菌屬(Streptomyces)、葡萄球菌屬(Staphylococcus)、腸球菌屬(Enterococcus)、乳桿菌屬(Lactobacillus)、乳球菌屬(Lactococcus)、梭菌屬(Clostridium)、地芽孢桿菌屬(Geobacillus)或海洋芽孢桿菌屬(Oceanobacillus)多肽；或具有酯酶活性的革蘭氏陰性細菌多肽，如大腸桿菌(E.coli)、假單胞菌屬O^seudomonas)、沙門氏菌屬(Salmonella)、彎曲桿菌屬(Campylobacter)^iIffliiM(Helicobacter)、黃桿菌屬(Flavobacterium)、梭桿菌屬(Fusobacterium)、泥桿菌屬(Ilyobacter)、奈瑟氏菌屬(Neisseria)或脲原體屬(Ureaplasma)多妝。在一個優選的方面，所述多肽是具有酯酶活性的嗜鹼芽孢桿菌(Bacillusalkalophilus)S"(Bacillusamyloliquefaciens)^M^^^fM(Bacillusbrevis)、環狀芽孢桿菌(Bacilluscirculans)、克勞氏芽孢桿菌(Bacillusclausii)、凝結芽孢桿菌(Bacilluscoagulms)、堅強芽孢桿菌(Bacillusfirmus)、燦爛芽孢杆M(Bacilluslautus)、遲緩芽孢桿菌(Bacilluslentus)、地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)、巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)、短小芽孢桿菌(Bacilluspumilus)、嗜熱月旨肪芽孢桿菌(Bacillusstearothermophilus)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)或蘇雲金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis)多肽。在另一個優選的方面，所述多肽是具有酯酶活性的似馬鏈球菌(Streptococcusequisimilis)、酉良月農鏈球菌(Streptococcuspyogenes)、乳房鏈球菌(Streptococcusuberis)或馬鏈球菌獸痕亞禾中(Streptococcusequisubsp.Zooepidemicus)多月太。在另一個優選的方面，所述多肽是具有酯酶活性的不產色鏈黴菌(Streptomycesachromogenes)、除蟲鏈黴菌(Streptomycesavermitilis)、天藍鏈黴菌(Streptomycescoelicolor)、灰色鏈黴菌(Streptomycesgriseus)或淺青紫鏈黴菌(Streptomyceslividans)多月太。本發明具有酯酶活性的多肽也可以是真菌多肽，並且更優選具有酯酶活性的酵母多肽如念珠菌屬(Candida)、克魯維酵母屬(Kluyveromyces)、畢赤酵母屬(Pichia)、酵母屬(Saccharomyces)、裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces)或西洋蓍黴屬(Yarrowia)多肽；或更優選具有酯酶活性的絲狀真菌多肽如枝頂孢黴屬(Acremoniumm)、傘菌屬(Agaricus)、鏈格孢屬(Alternaria)、麴黴屬(Aspergillus)、短梗黴屬(Aureobasidium)、Botryospaeria、擬錯菌屬(Ceriporiopsis)、毛_殼屬(Chaetomidium)、金抱子菌屬(Chrysosporium)、Claviceps、Cochliobolus、鬼傘屬(Coprinopsis)、Coptotermes、棒囊殼屬(Corynascus)、隱叢赤殼菌屬(Cryphonectria)、隱球菌屬(Cryptococcus)、色二孢屬(Diplodia)、黑耳屬(Exidia)、Filibasidium.鐮孢屬(Fusarium)、赤黴屬(Gibberella)、全鞭毛蟲屬(Holomastigotoides)、腐質黴屬(Humicola)、耙齒菌屬(Irpex)λMSM(Lentinula)、Leptospaeria、梨抱菌屬(Magnaporthe)、Melanocarpus、多孔菌屬(Meripilus)、毛黴屬(Mucor)、毀絲黴屬(Myceliophthora)、新考瑪脂黴屬(Neocallimastix)、脈抱菌屬(Neurospora)、擬青黴屬(Paecilomyces)、青黴屬(Penicillium)、平革菌屬(Phanerochaete)、瘤胃壺菌屬(Piromyces)、Poitrasia、假漂盤菌屬(Pseudoplectania)、Pseudotrichonympha、根毛黴屬(Rhizomucor)、裂褶菌屬(Schizophyllum)、柱頂孢屬(Scytalidium)、踝節菌屬(Talaromyces)、嗜熱子囊菌屬(Thermoascus)、梭孢殼屬(fThielavia)、彎頸黴屬(Tolypocladium)、木黴屬CTrichoderma)、長毛盤菌屬(Trichophaea)、輪枝孢屬(Verticillium)、包腳菇屬(Volvariella)或炭角菌屬(Xylaria)多肽。在一個優選的方面，所述多肽是具有酯酶活性的卡爾酵母(Saccharomycescarlsbergensis)、酉良酒酵母(Saccharomycescerevtsiae)、糖化酵母(Saccharomycesdiastaticus)、道格拉氏酵母(Saccharomycesdouglasii)、克魯弗酵母(Saccharomyceskluyveri)、諾地酵母(Saccharomycesnorbensis)或卵形酵母(Saccharomycesoviformis)多月太。在另一個優選方面，所述多肽是具有酯酶活性的解纖維枝頂孢黴(Acremoniudmcellulolyticus)、棘孢麴黴(Aspergillusaculeatus)、泡盛麴黴(Aspergillusawamori)、煙麴黴(Aspergillusfumigatus)、臭麴黴(Aspergillusfoetidus)、曰本麴黴(Aspergillusjaponicus)、構巢麴黴(Aspergillusnidulans)、漂麴黴(Aspergillusniger)、米麴黴(Aspergillusoryzae)、嗜角質金抱子菌(Chrysosporiumkeratinophilum)、Chrysosporiumlucknowense、熱帶金抱子菌(Chrysosporiumtropicum)、Chrysosporiummerdarium、Chrysosporiuminops、金抱子菌(Chrysosporiumpannicola)、Chrysosporiumqueenslandicum、Chrysosporiumzonatum、杆孢狀鐮孢(Fusariumbactridioides)、禾穀鐮孢(Fusariumcerealis)、庫威鐮孢(Fusariumcrookwellense)、大刀德抱(Fusariumculmorum)、禾本禾鬥德抱(Fusariumgraminearum)、禾赤德抱(Fusariumgraminum)、異抱德抱(Fusariumheterosporum)、合歡木德抱(Fusariumnegundi)、尖德抱(Fusariumoxysporum)、多枝德抱(Fusariumreticulatum)、粉紅德抱(Fusariumroseum)、接骨木德抱(Fusariumsambucinum)、膚色德抱(Fusariumsarcochroum)、擬分枝抱德抱(Fusariumsporotrichioides)、硫色,廉抱(Fusariumsulphureum)、圓德抱(Fusariumtorulosum)、擬絲抱,廉抱(Fusariumtrichothecioides)、壤片德抱(Fusariumvenenatum)、灰腐質黴(Humicolagrisea)、特異腐質霄(Humicolainsolens)、疏棉狀腐質霄(Humicolalanuginosa)、白奉巴齒菌(Irpexlacteus)、米黑毛黴(Mucormiehei)、嗜熱毀絲黴、粗糙脈孢菌(Neurosporacrassa)、繩狀青黴(Penicilliumfunicidlosum)、產紫青黴(Penicilliumpurpurogenum)、35PJji1(Phanerochaetechrysosporium)、Thielaviaachromatica>Thielaviaalbomyces>Thielaviaalbopilosa^^yifl^ifil^(Thielaviaaustraleinsis)>Thielaviafimeti、小抱梭抱殼(Thielaviamicrospora)、卵抱梭抱殼(Thielaviaovispora)、Thielaviaperuviana^^^(Thielaviaspededonium)>^^(Thielaviasetosa)>Thielaviasubthermophila、^(Thielaviaterrestris)>(^^7^(Trichodermaharzianum)>^tJ27^β(Trichodermakoningii)、^枝7^(Trichodermalongibrachiatum)、裡氏木霄(Trichodermareesei)或參錄色木霄(Trichodermaviride)多肽。在另一個優選的方面，所述多肽是漆斑菌屬多肽，在一個更優選的方面，所述多肽是具有酯酶活性的漆斑菌屬菌種多肽，例如，包含SEQIDNO:2的成熟多肽的多肽。可理解的是對於前述的種，本發明包含完全和不完全階段(perfectandimperfectstates)，和其它分類學的等同物(equivalent)，例如無性型(anamorph)，而無論它們已知的種名。本領域熟練技術人員將容易地識別適合的等同物的同一性。這些種的菌株在許多培養物保藏中心對於公眾能夠容易地取得，所述保藏中心諸如美國典型培養物保藏中心(theAmericanTypeCultureCollection)(ATCC)、德意志微生物和細胞培養物保藏中心(DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturenGmbH)(DSM)、真菌菌種保藏中心(CentraalbureauVoorSchimmelcultures)(CBS)和農業研究機構專利培養物保藏中心北區研究中心(AgriculturalResearchServicePatentCultureCollection,NorthernRegionalResearchCenter)(NRRL)。此外，可以使用上述的探針從其它來源，包括從自然界(例如，土壤、堆肥、水等)分離的微生物鑑定和獲得這些多肽。用於從天然生境(habitat)分離微生物的技術是本領域內公知的。隨後可通過相似地篩選這種微生物的基因組或cDNA文庫來獲得所述多核苷酸。一旦用所述探針檢測到編碼多肽的多核苷酸序列，就能夠使用本領域普通技術人員熟知的技術將所述多核苷酸分離或克隆(參見，例如，Sambrook等，1989，見上文)。本發明的多肽還包括融合多肽或可切割的融合多肽，其中將另外的多肽融合到所述多肽或其片段的N末端或C末端。通過將編碼另一個多肽的核苷酸序列(或其部分)融合於本發明的核苷酸序列(或其部分)來產生融合的多肽。產生融合多肽的技術是本領域已知的，並包括連接編碼多肽的編碼序列以使它們在閱讀框中，並且使融合多肽的表達在相同啟動子和終止子的控制下。融合多肽還可以包括切割位點。一旦分泌了融合多肽，就切割所述位點，從融合蛋白質釋放具有酯酶活性的多肽。切割位點的實例包括，但不限於，編碼二肽Lys-Arg的Kex2位點(Martin等，2003，J.Ind.Microbiol.Biotechnol.3:568-76；Svetina等，2000，J.Biotechnol.76:245-251；Rasmussen-WiIson等，1997,Appl.Environ.Microbiol.633488-3493；Ward等，1995，Biotechnology13:498—503;禾口Contreras等，1991，Biotechnology9:378-381)；Ile_(Glu或Asp)-Gly-Arg位點，其在精氨酸殘基後通過因子Xa蛋白酶切割(Eaton等，1986，Biochem.25:505-512)；Asp-Asp-Asp-Asp-Lys位點，其在賴氨酸後通過腸激酶切割(Collins-fcicie等，1995，Biotechnology13:982-987)；His-Tyr-Glu位點或His-Tyr-Asp位點，其通過GenenaseI切割(Carter等，1989，Proteins-Structure,Function,andGenetics6:240-248)；Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser位點，其在Arg後通過凝血酶切割(Stevens，2003，DrugDiscoveryWorld4:35-48)；Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln-Gly位點，其在Gln後通過TEV蛋白酶切割(Stevens，2003，見上文)；和Leu-Glu-Val-Leu-Phe-Gln-Gly-Pro位點，其在Gln後通過基因工程形式的人鼻病毒3C蛋白酶切割(Stevens，2003，見上文)。多核苷酸本發明還涉及分離的多核苷酸，其包含編碼本發明具有酯酶活性的多肽的核苷酸序列，或由編碼本發明具有酯酶活性的多肽的核苷酸序列組成。在一個優選的方面，核苷酸序列包含SEQIDNO=I或由SEQIDNO=I組成。在另一個更優選的方面，核苷酸序列包含大腸桿菌DSM19428中所含質粒中含有的序列，或由大腸桿菌DSM19428中所含質粒中含有的序列組成。在另一個優選方面，核苷酸序列包含SEQIDNO1的成熟多肽編碼序列或由SEQIDNO1的成熟多肽編碼序列組成。在另一個優選方面，核苷酸序列包含SEQIDNO:1的核苷酸61至1560或由SEQIDNO:1的核苷酸61至1560組成。在另一個更優選的方面，核苷酸序列包含大腸桿菌DSM19428中所含質粒中含有的成熟多肽編碼序列或由大腸桿菌DSM19428中所含質粒中含有的成熟多肽編碼序列組成。本發明還涵蓋編碼多肽的核苷酸序列，所述多肽包含SEQIDNO:2的胺基酸序列或其成熟多肽，或由SEQIDNO2的胺基酸序列或其成熟多肽組成；由於遺傳密碼的簡併性，所述核苷酸序列不同於SEQIDNO:1或其成熟多肽編碼序列。本發明還涉及SEQIDN0:1的亞序列，所述亞序列編碼具有酯酶活性的SEQIDNO:2的片段。本發明還涉及突變多核苷酸，所述突變多核苷酸在SEQIDNO1的成熟多肽編碼序列中包含至少一個突變，或由具有至少一個突變的SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列組成，其中所述突變核苷酸序列編碼SEQIDNO:2的成熟多肽。用於分離或克隆編碼多肽的多核苷酸的技術是本領域內已知的，包括從基因組DNA分離，從cDNA製備，或其組合。可通過例如使用熟知的聚合酶鏈式反應(PCR)或表達文庫的抗體篩選來檢測具有共有結構特性的克隆DNA片段，從而實現從這種基因組DNA克隆本發明的多核苷酸。參見，例如，Innis等，1990，PCR:AGuidetoMethodsandApplication,AcademicPress,NewYork。可以使用其它核酸擴增方法，如連接酶鏈式反應(LCR)、連接活化轉錄(ligatedactivatedtranscription；LAT)和基於核苷酸序列的擴增(NASBA)。可以從漆斑菌屬菌株，或其它或相關生物體克隆多核苷酸，並且因此可以是例如所述核苷酸序列的多肽編碼區的等位基因變體或種變體(speciesvariant)。本發明還涉及包含核苷酸序列或由核苷酸序列組成的分離的多核苷酸，所述核苷酸序列與SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列具有優選至少45%，更優選至少50%，更優選至少65%，更優選至少75%，更優選至少80%，更優選至少85%，甚至更優選至少90%，最優選至少95%，並且甚至最優選至少96%，至少97%，至少98%，或者至少99%同一性的同一性程度，其編碼具活性多肽。修飾編碼本發明多肽的核苷酸序列對於合成與所述多肽基本上相似的多肽可為必需的。術語與所述多肽「基本上相似」指多肽的非天然存在的形式。這些多肽可能以一些工程改造的方式而不同於從其天然來源分離的多肽，例如，比活性、熱穩定性、最適PH等方面不同的人工變體。可以在作為SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列存在的核苷酸序列，例如其亞序列的基礎上，和/或通過引入如下核苷酸取代來構建變體序列所述取代不產生由核苷酸序列編碼的多肽的另外的胺基酸序列，但是符合意欲產生酶的宿主生物體的密碼子選擇；或者所述取代可產生不同的胺基酸序列。關於核苷酸取代的概述，參見，例如，Ford等，1991，ProteinExpressionandPurification2:95一107。對於本領域技術人員顯而易見的是，這些取代能夠在對於分子功能重要的區域之外進行，並且仍然產生活性多肽。對於由本發明的分離的多核苷酸編碼的多肽活性關鍵的並且因此優選不進行取代的胺基酸殘基，可以根據本領域公知的方法，例如定位誘變或丙氨酸分區誘變法(參見，例如，Cunningham和Wells，1989，見上文)來鑑定。在後一技術中，將突變引入到分子中的每個荷正電的殘基處，並且測試所得突變分子的酯酶活性，以鑑定對於所述分子的活性關鍵的胺基酸殘基。底物-酶相互作用的位點也能夠通過分析三維結構測定，通過如核磁共振分析、晶體學或光親和標記這樣的技術來測定(參見，例如，deVos等，1992，見上文；Smith等，1992，見上文；Wlodaver等，1992，見上文)。本發明還涉及編碼本發明多肽的分離的多核苷酸，所述分離的多核苷酸在非常低嚴格條件下，優選低嚴格條件，更優選中等嚴格條件，更優選中-高嚴格條件，甚至更優選高嚴格條件，並且最優選非常高的嚴格條件下，與以下序列雜交(i)SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列，(ii)包含於SEQIDNO1的成熟多肽編碼序列中的cDNA序列，或(iii)⑴或(ii)的全長互補鏈；或它們的等位變體和亞序列(Sambrook等，1989，見上文)，如本文所定義的。在一個優選的方面，互補鏈是SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列的全長互補鏈。本發明還涉及分離的多核苷酸，所述分離的多核苷酸通過以下方法獲得(a)在非常低、低、中、中-高、高或非常高嚴格條件下，將DNA的群體與以下序列雜交(i)SEQIDNO1的成熟多肽編碼序列，(ii)包含於SEQIDNO1的成熟多肽編碼序列中的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全長互補鏈；和(b)分離雜交的多核苷酸，其編碼具有酯酶活性的多肽。在一個優選的方面，互補鏈是SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列的全長互補鏈。核酸構建體本發明還涉及包含本發明的分離的多核苷酸的核酸構建體，所述分離的多核苷酸與一個或多個(幾個)調控序列可操作地連接，所述調控序列在合適的宿主細胞中在與該調控序列相容的條件下指導編碼序列的表達。可以用許多方式操作編碼本發明多肽的分離的多核苷酸以提供多肽的表達。依賴於表達載體，在將多核苷酸的序列插入載體之前對其進行操作可能是理想的或必需的。使用重組DNA方法修飾多核苷酸序列的技術是本領域熟知的。調控序列可以是適當的啟動子序列，其是由用於表達編碼本發明多肽的多核苷酸的宿主細胞識別的核苷酸序列。啟動子序列含有介導多肽的表達的轉錄調控序列。啟動子可以是在所選的宿主細胞中顯示轉錄活性的任何核苷酸序列，包括突變的、截短的和雜合的啟動子，並且可以從編碼與宿主細胞同源或異源的胞外或胞內多肽的基因獲得。用於指導本發明的核酸構建體轉錄，特別是在細菌宿主細胞中轉錄的合適啟動子的實例是從下述獲得的啟動子大腸桿菌Iac操縱子、天藍色鏈黴菌(Sti^ptomyces16coelicolor)瓊脂糖酶基因(dagA)、枯草芽孢桿菌果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、地衣芽孢桿菌α-澱粉酶基因(amyL)、嗜熱脂肪芽孢桿菌產麥芽澱粉酶基因(amyM)、解澱粉芽孢桿菌α-澱粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢桿菌青黴素酶基因(penP)、枯草芽孢桿菌xylA和xylB基因和原核β-內醯胺酶基因(Villa-Kamaroff等，1978，ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA75:3727-3731)，以及tac啟動子(DeBoer等，1983，ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA80:21-25)。另外的啟動子在〃Usefulproteinsfromrecombinantbacteria"於ScientificAmerican,1980,242:74-94中；禾口在Sambrook等，1989，見上文中描述。用於指導本發明的核酸構建體在絲狀真菌宿主細胞中轉錄的合適啟動子的實例是從下列酶的基因獲得的啟動子米麴黴TAKA澱粉酶、曼赫根毛黴(lihizomucormiehei)天冬氨酸蛋白酶、黑麴黴中性α-澱粉酶、黑麴黴酸穩定性α-澱粉酶、黑麴黴或泡盛麴黴葡糖澱粉酶(glaA)、曼赫根毛黴脂肪酶、米麴黴鹼性蛋白酶、米麴黴丙糖磷酸異構酶、構巢麴黴乙醯胺酶、鑲片鐮孢澱粉葡糖苷酶(W000/56900)、鑲片鐮孢Daria(WC)00/56900)、鑲片鐮孢Quirm(W000/56900)、尖鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶(W096/00787)、裡氏木黴β-葡糖苷酶、裡氏木黴纖維二糖水解酶I、裡氏木黴纖維二糖水解酶II、裡氏木黴內切葡聚糖酶I、裡氏木黴內切葡聚糖酶II、裡氏木黴內切葡聚糖酶III、裡氏木黴內切葡聚糖酶IV、裡氏木黴內切葡聚糖酶V、裡氏木黴木聚糖酶I、裡氏木黴木聚糖酶II、裡氏木黴β-木糖苷酶，以及NA2-tpi啟動子(來自黑麴黴中性α-澱粉酶基因和米麴黴丙糖磷酸異構酶基因的啟動子的雜合體)；和它們的突變的、截短的和雜合的啟動子。在酵母宿主中，有用的啟動子從如下酶的基因獲得釀酒酵母烯醇化酶(ΕΝ0-1)、釀酒酵母半乳糖激酶(GALl)、釀酒酵母醇脫氫酶/甘油醛-3-磷酸脫氫酶(ADH1，ADH2/GAP)、釀酒酵母丙糖磷酸異構酶(TPI)、釀酒酵母金屬硫蛋白(CUPl)和釀酒酵母3-磷酸甘油酸激酶。對於酵母宿主細胞其它有用的啟動子由Romanos等，1992,Yeast8:423-488描述。調控序列也可以是合適的轉錄終止子序列，是由宿主細胞識別以終止轉錄的序列。所述終止子序列與編碼所述多肽的核苷酸序列的3』末端可操作地連接。可以將在所選宿主細胞中有功能的任何終止子用在本發明中。對於絲狀真菌宿主細胞優選的終止子從如下酶的基因獲得米麴黴TAKA澱粉酶、黑麴黴葡糖澱粉酶、構巢麴黴鄰氨基苯甲酸合酶、黑麴黴α-葡糖苷酶和尖鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶。對於酵母宿主細胞優選的終止子從如下酶的基因獲得釀酒酵母烯醇化酶、釀酒酵母細胞色素C(CYCl)和釀酒酵母甘油醛-3-磷酸脫氫酶。對於酵母宿主細胞其它有用的終止子由Romanos等，1992，見上文描述。調控序列還可以是合適的前導序列，其是對於宿主細胞的翻譯重要的mRNA非翻譯區。前導序列可操作地連接於編碼多肽的核苷酸序列的5』-末端。可以將在所選宿主細胞中有功能的任何前導序列用在本發明中。對於絲狀真菌宿主細胞優選的前導序列從如下酶的基因獲得米麴黴TAKA澱粉酶和構巢麴黴丙糖磷酸異構酶。對於酵母宿主細胞合適的前導序列從如下酶的基因獲得釀酒酵母烯醇化酶(EN0-1)、釀酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、釀酒酵母α-因子和釀酒酵母醇脫氫酶/甘油醛-3-磷酸脫氫酶(ADH2/GAP)。調控序列也可以是聚腺苷酸化序列，其是與核苷酸序列的3，末端可操作地連接的序列，並且在轉錄時，宿主細胞將其識別為信號以將聚腺苷殘基添加至轉錄的mRNA。可以將在所選宿主細胞中有功能的任何聚腺苷酸化序列在本發明中使用。對於絲狀真菌宿主細胞優選的聚腺苷酸化序列從如下酶的基因獲得米麴黴TAKA澱粉酶、黑麴黴葡糖澱粉酶、構巢麴黴鄰氨基苯甲酸合酶、尖鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶和黑麴黴α-葡糖苷酶。對於酵母宿主細胞有用的聚腺苷酸化序列由Guo和aierman，1995，MolecularCellularBiology15:5983-5990描述。調控序列還可以是信號肽編碼序列，其編碼與多肽的氨基末端相連的胺基酸序列，並且指導編碼的多肽進入細胞分泌途徑。核苷酸序列的編碼序列5』端可固有地包含信號肽編碼序列，其與編碼分泌多肽的編碼序列片段一起天然地連接在翻譯閱讀框中。或者，編碼序列5』端可含有對於所述編碼序列異源的信號肽編碼序列。異源信號肽編碼序列在編碼序列不天然地含有信號肽編碼序列時可為必需的。或者，外源信號肽編碼序列可以簡單地取代天然信號肽編碼序列以增強多肽的分泌。然而，指導表達的多肽進入所選宿主細胞的分泌途徑(即，分泌至培養基中)的任何信號肽編碼序列可在本發明中使用。對於細菌宿主細胞有效的信號肽編碼序列是從如下酶的基因獲得的信號肽編碼序列芽孢桿菌屬NCIB11837產麥芽糖澱粉酶、嗜熱脂肪芽孢桿菌α-澱粉酶、地衣芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶(subtilisin)、地衣芽孢桿菌β-內醯胺酶、嗜熱脂肪芽孢桿菌中性蛋白酶(nprT，nprS,nprM)、克勞氏芽孢桿菌鹼性蛋白酶(Bacillusclausiialcalineprotease)(aprH)和枯草芽孢桿菌prsA。另外的信號肽由Simonen和Palva,1993，MicrobiologicalReviews57109-137描述。對於絲狀真菌宿主細胞有效的信號肽編碼序列是從如下酶的基因獲得的信號肽編碼序列米麴黴TAKA澱粉酶、黑麴黴中性澱粉酶、黑麴黴葡糖澱粉酶、曼赫根毛黴天冬氨酸蛋白酶、特異腐質黴纖維素酶、特異腐質黴內切葡聚糖酶V和疏棉狀腐質黴脂肪酶。對於酵母宿主細胞有用的信號肽從釀酒酵母α-因子和釀酒酵母轉化酶的基因獲得。其它有用的信號肽編碼序列由Romanos等，1992，見上文描述。在一個優選的方面，信號肽包含SEQIDNO:2的胺基酸1至20，或者由SEQIDΝ0:2的胺基酸1至20組成。在另一個優選方面，信號肽編碼序列包含SEQIDNO1的核苷酸1至60，或者由SEQIDNO1的核苷酸1至60組成。調控序列還可以是前肽編碼序列，其編碼位於多肽氨基末端的胺基酸序列。所得多肽稱為酶原(proenzyme)或前多肽(propolyp印tide)(或在某些情況下稱為酶原(zymogen))0前多肽通常是無活性的並且能夠通過前肽的催化或自催化切割從前多肽轉化為成熟活性多肽。可以從枯草芽孢桿菌鹼性蛋白酶(aprE)、枯草芽孢桿菌中性蛋白酶(nprT)、釀酒酵母α-因子、曼赫根毛黴天冬氨酸蛋白酶和嗜熱毀絲黴漆酶(W095/33836)的基因獲得前肽編碼序列。當信號肽和前肽序列二者均出現在多肽的氨基末端時，將前肽序列置於緊接著(nextto)多肽氨基末端，並且將信號肽序列置於緊接著前肽序列的氨基末端。同樣理想的是添加調節序列，其允許相對於宿主細胞的生長來調節多肽的表達。調節系統的實例是引起基因表達響應化學或物理刺激物，包括調節化合物的存在而開啟或關閉的那些系統。原核系統中的調節系統包括lac、tac、xyl和trp操縱基因系統。在酵母中，可以使用ADH2系統或GALl系統。在絲狀真菌中，可以使用TAKAα-澱粉酶啟動子、黑麴黴葡糖澱粉酶啟動子和米麴黴葡糖澱粉酶啟動子作為調節序列。調節序列的其它實例是那些允許基因擴增的序列。在真核系統中，這些序列包括在氨甲蝶呤(methotrexate)存在下擴增的二氫葉酸還原酶基因，和以重金屬(withheavymetal)擴增的金屬硫蛋白基因。在這些情況下，編碼多肽的核苷酸序列可與調節序列可操作地連接。表達載體本發明還涉及重組表達載體，所述重組表達載體包含本發明的核酸序列、啟動子和轉錄和翻譯終止信號。上述的多種核酸和調控序列可以結合在一起以產生重組表達載體，所述表達載體可以包括一個或多個(幾個)方便的限制位點以允許在這些位點插入或取代編碼多肽的核酸序列。或者，可以通過在適當的用於表達的載體中插入包含所述序列的核酸序列或核酸構建體來表達本發明的核酸序列。在製備表達載體的過程中，將編碼序列置於載體中，使得該編碼序列與適當的表達調控序列可操作地連接。重組表達載體可以是任何載體(例如，質粒或病毒)，其能夠方便地進行重組DNA步驟，並且能夠產生核酸序列的表達。載體的選擇將通常依賴於載體與將引入該載體的宿主細胞的相容性。載體可以是線狀或閉合環狀質粒。載體可以是自主複製載體，即，作為染色體外實體(entity)存在的載體，其複製獨立於染色體複製，例如，質粒、染色體外元件、微型染色體(minichromosome)或人工染色體。載體可以含有任何用於確保自複製的手段(means)。或者，載體可以是一種當被引入宿主細胞中時，整合到基因組中並且與整合了該載體的染色體一起複製的載體。此外，可以使用單獨的載體或質粒或兩個或更多個載體或質粒，其共同含有待引入宿主細胞基因組的完整DNA(totalDNA)，或可以使用轉座子(transposon)。本發明的載體優選地含有一個或多個選擇性標記，其允許簡單選擇經轉化的細胞。選擇性標記是基因，其產物提供殺生物劑或病毒抗性、對重金屬的抗性、對營養缺陷型的原養性(prototrophytoauxotrophs)等。細菌選擇性標記的實例是來自枯草芽孢桿菌或地衣芽孢桿菌的dal基因，或賦予抗生素抗性的標記，所述抗生素抗性例如氨苄青黴素、卡那黴素、氯黴素或四環素抗性。對於酵母宿主細胞合適的標記是ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1和URA3。用於絲狀真菌宿主細胞的選擇性標記包括但不限於amdS(乙醯胺酶)、argB(鳥氨酸氨甲醯基轉移酶)、bar(草銨膦(phosphinothricin)乙醯轉移酶)、hph(潮黴素磷酸轉移酶)、niaD(硝酸還原酶)(nitratereductase)、pyrG(乳清酸核苷-5，-磷酸脫羧酶(orotidine-5，-phosphatedecarboxylase))、sC(硫酸腺苷醯轉移酶)和trpC(鄰氨基苯甲酸合酶(anthranilatesynthase))以及它們的等同物。優選用在麴黴屬細胞中的是構巢麴黴或米麴黴的amdS和pyrG基因禾口吸水鏈霄菌(Streptomyceshygroscopicus)的bar基因。本發明的載體優選含有元件，其允許載體穩定整合入宿主細胞基因組或載體在細胞中獨立於基因組的自主複製。為了整合入宿主細胞基因組，載體可依賴編碼多肽的多核苷酸的序列或用於通過同源或非同源重組整合入基因組的任何其它載體元件。或者，載體可以含有額外的核苷酸序列，用於指導通過同源重組整合入宿主細胞基因組染色體中的精確位置。為了增加在精確位置整合的可能性，整合元件應優選含有足夠數量的核酸，如100至10，000鹼基對，優選400至10，000鹼基對，並且最優選800至10，000鹼基對，其與相應的目標序列具有高度同一性以增強同源重組的概率。整合元件可以是任何序列，其與宿主細胞基因組中的目標序列同源。此外，整合元件可以是非編碼或編碼的核苷酸序列。另一方面，可以將載體通過非同源重組整合到宿主細胞的基因組中。為了自主複製，載體可以進一步包含複製起點，其使載體能夠在所述的宿主細胞中自主地複製。複製起點可以是介導自主複製的任何質粒複製子(r印licator)，其在細胞中發揮功能。術語「複製起點」或「質粒複製子」在本文定義為能夠使質粒或載體體內複製的核苷酸序列。細菌複製起點的實例是允許在大腸桿菌中複製的質粒pBR322、pUC19、pACYC177和pACYC184的複製起點，和允許在芽孢桿菌屬中複製的質粒pUBllO、pE194、pTA1060和ρΑΜβ1的複製起點。用於酵母宿主細胞中的複製起點的實例是2微米複製起點，ARSl,ARS4，ARSl和CEN3的組合，和ARS4和CEN6的組合。在絲狀真菌細胞中有用的複製起點的實例是AMAl和ANSI(Gems等，1991，Gene98:61-67;Cullen等，1987，NucleicAcidsResearch15:9163-9175；WO00/24883)。分離AMAl基因和構建包含該基因的質粒或載體能夠根據公開於WO00/24883中的方法完成。可以將多於一個拷貝的本發明的多核苷酸插入宿主細胞以增加基因產物的產生。多核苷酸拷貝數的增加可通過如下方法獲得將至少一個額外拷貝的序列整合入宿主細胞基因組，或將可擴增的選擇性標記基因包括於多核苷酸，其中可通過在合適的選擇劑(selectableagent)存在下培養細胞來選擇含有選擇性標記基因的擴增拷貝的細胞，和由此得到多核苷酸的額外拷貝。用於連接上述元件以構建本發明的重組表達載體的方法是本領域技術人員熟知的(參見，例如，Sambrook等，1989，見上文)。宿主細胞本發明還涉及重組宿主細胞，其包含本發明的分離的多核苷酸，可有利地用於多肽的重組生產中。將包含本發明的多核苷酸的載體導入宿主細胞，使載體作為染色體整合體或如前所述的自複製的染色體外載體維持。術語「宿主細胞」包括由於複製過程中發生的突變而與親本細胞不同的親本細胞的任何後代。宿主細胞的選擇在很大程度上依賴於編碼多肽的基因及其來源。宿主細胞可以是在本發明的多肽的重組產生中有用的任何細胞，例如，原核或真核細胞。原核宿主細胞可以是任何革蘭氏陽性細菌或革蘭氏陰性細菌。革蘭氏陽性細菌包括但不限於，芽孢桿菌屬、鏈球菌屬、鏈黴菌屬、葡萄球菌屬、腸球菌屬、乳桿菌屬、乳球菌屬、梭菌屬、地芽孢桿菌和海洋芽孢桿菌。革蘭氏陰性細菌包括但不限於，大腸桿菌、假單胞菌屬、沙門氏菌屬、彎曲桿菌屬、螺桿菌屬、黃桿菌屬、梭桿菌屬、泥桿菌屬、奈瑟氏菌屬和脲原體屬。細菌宿主細胞可以是任何芽孢桿菌屬細胞。在本發明的實施中有用的芽孢桿菌屬細胞包括但不限於，嗜鹼芽孢桿菌、解澱粉芽孢桿菌、短芽孢桿菌、環狀芽孢桿菌、克勞氏芽孢桿菌、凝結芽孢桿菌、堅強芽孢桿菌、燦爛芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌和蘇雲金芽孢桿菌細胞。在一個優選的方面，細菌宿主細胞是解澱粉芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌或枯草芽孢桿菌細胞。在一個更優選的方面，細菌宿主細胞是解澱粉芽孢桿菌細胞。在另一個更優選的方面，細菌宿主細胞是克勞氏芽孢桿菌細胞。在另一個更優選的方面，細菌宿主細胞是地衣芽孢桿菌細胞。在另一個更優選的方面，細菌宿主細胞是枯草芽孢桿菌細胞。細菌宿主細胞還可以是任何鏈球菌屬細胞。在本發明的實施中有用的鏈球菌屬細胞包括但不限於，似馬鏈球菌、釀膿鏈球菌、乳房鏈球菌和馬鏈球菌獸瘟亞種細胞。在一個優選的方面，細菌宿主細胞是似馬鏈球菌細胞。在另一個優選的方面，細菌宿主細胞是釀膿鏈球菌細胞。在另一個優選的方面，細菌宿主細胞是乳房鏈球菌細胞。在另一個優選的方面，細菌宿主細胞是馬鏈球菌獸瘟亞種細胞。細菌宿主細胞還可以是任何鏈黴菌屬細胞。在本發明的實施中有用的鏈黴菌屬細胞包括但不限於，不產色鏈黴菌、除蟲鏈黴菌、天藍鏈黴菌、灰色鏈黴菌和淺青紫鏈黴菌細胞。在一個優選的方面，細菌宿主細胞是不產色鏈黴菌細胞。在另一個優選的方面，細菌宿主細胞是除蟲鏈黴菌細胞。在另一個優選的方面，細菌宿主細胞是天藍鏈黴菌細胞。在另一個優選的方面，細菌宿主細胞是灰色鏈黴菌細胞。在另一個優選的方面，細菌宿主細胞是淺青紫鏈黴菌細胞。可通過如下方法實現將DNA引入到芽孢桿菌屬細胞例如原生質體轉化(參見，例如，Chang和Cohen，1979，MolecularGeneralGenetics168:111-115)，使用感受態細胞(參見，例如，Young禾口Spizizen，1961，JournalofBacteriology81:823-829或Dubnau和Davidoff-Abelson，1971，JournalofMolecularBiology56:209-221)，電穿孔(參見，例如，Shigekawa和Dower,1988，Biotechniques6:742-751)或接合(參見，例如，Koehler禾口Thorne，1987，JournalofBacteriologyl69:5771-5278)。可通過如下方法實現將DNA引入到大腸桿菌細胞例如原生質體轉化(參見，例如，Hanahan,1983，J.Mol.Biol.166:557-580)或電穿孔(參見，例如，Dower等，1988，NucleicAcidsRes.166127-6145)。可通過如下方法實現將DNA引入到鏈黴菌屬細胞例如原生質體轉化和電穿孔(參見，例如，Gong等，2004，R)liaMicrobiol.(Praha)49:399-405)，接合(參見，例如，Mazodier等，1989，J.Bacteriol.171:3583-3585)，或轉導(參見，例如，Burke等，2001，Proc.Natl.Acad.Sci.USA98:6289-6294)。可通過如下方法實現將DNA引入到假單胞菌屬細胞，例如電穿孔(參見，例如，Choi等，2006，J.Microbiol.Methods64:391-397)或接合(參見，例如，Pinedo和Smets，2005,Appl.Environ.Microbiol.71:51-57)。可通過如下方法實現將DNA引入到鏈球菌屬細胞，例如天然感受態(naturalcompetence)(參見，例如，Perry和Kuramitsu，1981，hfect.Immun.321295_1四7)，原生質體轉化(參見，例如，Catt和Jollick,1991，Microbios.68:189-2070)，電穿孔(參見，例如，Buckley等，1999，Appl.Environ.Microbiol.65:3800-3804)或接合(參見，例如，Clewell，1981，Microbiol.Rev.45:409-436)。然而，可以使用任何已知的將DNA引入宿主細胞的方法。宿主細胞還可以是真核生物，如哺乳動物、昆蟲、植物或真菌細胞。在一個優選的方面，宿主細胞是真菌細胞。「真菌」用在本文包括以下門子囊菌門(Ascomycota)、擔子菌門(Basidiomycota)、壺菌門(Chytridiomycota)禾口接合菌門(Zygomycota)(如由Hawksworth等，於AinsworthandBisby'sDictionaryofTheFungi,8thedition,1995,CABInternational,UniversityPress,Cambridge,UK中所定義)以及卵菌門(Oomycota)(如Hawksworth等，1995，見上，171頁中所引用)，和所有有絲分裂孢子真菌(mitosporicfungi)(Hawksworth等，1995，見上)。在一個更優選的方面，真菌宿主細胞是酵母細胞。「酵母」用在本文包括產子囊酵母(ascosporogenousyeast)(內孢黴目(Endomycetales))、產擔子酵母(basidiosporogenousyeast)禾口屬於半知菌類(FungiImperfecti)(芽抱綱(Blastomycetes))的酵母。由於酵母的分類在未來可能改變，就本發明而言，將酵母定義為如BiologyandActivitiesofYeast(Skinner,F.A.,Passmore,S.M.,禾口Davenport,R.R.編，Soc.App.Bacteriol.SymposiumSeriesNo.9,1980)中所述。在一個甚至更優選的方面，酵母宿主細胞是念珠菌屬、漢遜酵母屬(Hansenula)、克魯維酵母屬、畢赤酵母屬、酵母屬、裂殖酵母屬或西洋蓍黴屬細胞。在一個最優選的方面，酵母宿主細胞是卡爾酵母、釀酒酵母、糖化酵母、道格拉氏酵母、克魯弗酵母、諾地酵母或卵形酵母細胞。在另一個最優選的方面，酵母宿主細胞是乳酸克魯維酵母(Kluyveromyceslactis)細胞。在另一個最優選的方面，酵母宿主細胞是解脂西洋蓍黴(Yarrowialipolytica)細胞。在另一個更優選的方面，真菌宿主細胞是絲狀真菌細胞。「絲狀真菌」包括真菌門(Eumycota)和卵菌門的亞門(如由Hawksworth等，1995，見上文，所定義)的所有絲狀形式。絲狀真菌通常的特徵在於由殼多糖(chitin)、纖維素、葡聚糖、殼聚糖(chitosan)、甘露聚糖和其它複雜多糖組成的菌絲體壁。通過菌絲延伸進行營養生長，而碳分解代謝是專性需氧的。相反，酵母例如釀酒酵母的營養生長通過單細胞菌體的出芽生殖(budding)進行，而碳分解代謝可以是發酵的。在一個甚至更優選的方面，絲狀真菌宿主細胞是枝頂孢黴屬、麴黴屬、短梗黴屬、煙管黴屬(Bjerkandera)、擬蠟菌屬、金孢子菌屬、鬼傘屬(Coprinus)、革蓋菌屬(Coriolus)、隱球菌屬、Filikisidium、鐮孢屬、腐質黴屬、梨孢菌屬、毛黴屬、毀絲黴屬、新考瑪脂黴屬、脈孢菌屬、擬青黴屬、青黴屬、平革菌屬(Wianerochaete)、射脈菌屬(Phlebia)、瘤胃壺菌屬、側耳屬(Pleurotus)、裂褶菌屬、踝節菌屬、嗜熱子囊菌屬/嗜熱黴屬(Thermoascus)、梭孢殼屬、彎頸黴屬、栓菌屬(Trametes)或木黴屬細胞。在一個最優選的方面，絲狀真菌宿主細胞是泡盛麴黴、煙麴黴、臭麴黴、日本麴黴、構巢麴黴、黑麴黴或米麴黴細胞。在另一個最優選方面，絲狀真菌宿主細胞是杆孢狀鐮孢、禾穀鐮孢、庫威鐮孢、大刀鐮孢、禾本科鐮孢、禾赤鐮孢、異孢鐮孢、合歡木鐮孢、尖鐮孢、多枝鐮孢、粉紅鐮孢、接骨木鐮孢、膚色鐮孢、擬分枝孢鐮孢、硫色鐮孢、圓鐮孢、擬絲孢鐮孢或鑲片鐮孢細胞。在另一個最優選的方面，絲狀真菌宿主細胞是黑刺煙管菌(Bjerkanderaadusta)>zFiffllif(Ceriponopsisaneirina)>zFifa|1>Ceriporiopsiscaregiea>Ceriporiopsisgilvescens>Ceriporiopsispannocinta>Ceriporiopsisrivulosa、Ceriporiopsissubrufa、蟲擬M菌(Ceriporiopsissubvermispora)、B譽角質金包子菌、Chrysosporiumlucknowense、熱帶金抱子菌、Chrysosporiummerdarium、Chrysosporiuminops、|￡金包子菌、Chrysosporiumqueenslandicum>Chrysosporiumzonatum、灰蓋鬼傘(Coprinuscinereus)、毛革蓋菌(Coriolushirsutus)、特異腐質黴、疏棉狀腐質黴、米黑毛黴、嗜熱毀絲黴、粗糙脈孢菌、產紫青黴、黃孢平革菌(Wianer0Chaetechrysosporium),輻射射脈菌(Phlebiaradiata)、刺芹側耳(Pleurotuseryngii)、土生梭孢黴、長絨毛栓菌(Trametesvillosa)、變色栓菌(Trametesversicolor)、哈茨木黴、康寧木黴、長枝木黴、裡氏木黴或綠色木黴細胞。可以將真菌細胞通過涉及原生質體形成、原生質體轉化和細胞壁重建的方法以本身公知的方式轉化。用於轉化麴黴屬和木黴屬宿主細胞的合適方法在EP238023和^ltonφ,1984,ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA81:1470-1474ψ描述。用於轉化鐮孢屬菌種的合適方法由Malardier等，1989，Gene78:147-156和WO96/00787描述。可以使用由如下文獻描述的方法轉化酵母=Becker和Guarente，於Abelson,J.N.禾口Simon,Μ.I.編，GuidetoYeastGeneticsandMolecularBiology,MethodsinEnzymology,Volume194,ppl82_187,AcademicPress,Inc.,NewYork；Ito等，1983,JournalofBacteriologyl53:163；禾口Hinnen等，1978,ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA75:1920o產生方法本發明還涉及用於產生本發明多肽的方法，其包括(a)在有助於產生多肽的條件下培養宿主細胞；和(b)回收所述多肽。本發明還涉及用於產生本發明的多肽的方法，其包括(a)在有助於產生多肽的條件下培養重組宿主細胞，其中所述宿主細胞包含突變核苷酸序列，其在SEQIDN0:1的成熟多肽編碼序列中具有至少一個突變，其中所述突變核苷酸序列編碼多肽，該多肽包含SEQIDNO2的成熟多肽或由SEQIDNO2的成熟多肽組成，和(b)回收所述多肽。在本發明的產生方法中，使用本領域已知的方法在適合於產生所述多肽的營養培養基中培養細胞。例如，可以通過在合適培養基中和允許表達和/或分離所述多肽的條件下進行的搖瓶培養，和實驗室或工業發酵罐中的小規模或大規模發酵(包括連續、分批、補料分批或固態發酵)來培養細胞。使用本領域已知的方法在合適的營養培養基中進行培養，所述營養培養基包含碳源和氮源和無機鹽。合適的培養基能夠從商業供應商獲得或可以根據公開的組成製備(例如，在美國典型培養物保藏中心的目錄中)。如果多肽分泌到營養培養基中，該多肽能夠從所述培養基中直接回收。如果多肽不分泌，則其能夠從細胞裂解物(Iysate)回收。可以使用本領域已知的對於所述多肽是特異性的方法來檢測多肽。這些檢測方法可包括特異性抗體的使用、酯酶產物的形成或酯酶底物的消失。例如，酯酶測定法(esteraseassay)可用於測定如本文所述的多肽的活性。所得多肽可以使用本領域已知的方法回收。例如，多肽可以通過常規方法從營養培養基中回收，所述常規方法包括但不限於離心、過濾、提取、噴霧乾燥、蒸發或沉澱。本發明的多肽可以通過多種本領域已知的方法純化，所述方法包括但不限於層析(例如，離子交換、親和、疏水、層析聚焦和大小排阻)、電泳方法(例如，製備型(preparative)等電聚焦)、差示溶解度(例如，硫酸銨沉澱)、SDS-PAGE或提取(參見，例如，ProteinPurification,J.-C.Janson禾口LarsRyden,editors,VCHPublishers,NewYork,1989)。植物本發明還涉及轉基因的植物、植物部分或植物細胞，其經核酸序列轉化，所述核酸序列編碼本發明具有酯酶活性的多肽，從而以可回收的量表達和產生所述多肽。多肽可從植物或植物部分回收。或者，同樣可以將含有該重組多肽的植物或植物部分用於改進食品或飼料的質量，例如，改進營養價值、適口性(palatability)和流變性質(rheologicalproperties),或用於破壞抗營養因子。在一個具體實施方案中，所述多肽靶向種子中的胚乳儲藏液泡。這可通過將其合成為具有合適信號肽的前體來獲得，參見Horvath等，於PNASJeb.15,2000,vol.97，no.4，p.1914-1919。轉基因植物可以是雙子葉的(雙子葉植物)或單子葉的(單子葉植物)或其經工程改造的變體。單子葉植物的實例是草(grasses)，如草地早熟禾(meadowgrass)(藍草(bluegrass)，早熟禾屬(Poa))；飼用牧草(foragegrass)如羊茅屬(Festuca)、黑麥草屬(Lolium)；寒地型牧草(temperategrass)，如Agrostis(剪股穎屬)；和穀類，例如，小麥、燕麥、黑麥、大麥、稻(rice)、高粱、黑小麥(小、麥(Triticum)和黑麥(Secale)的穩定雜種)和玉蜀黍(maize)(玉米)。雙子葉植物的實例是菸草(tobacco)，豆類(legumes)如向日葵(Helianthus)、棉(Gossypium)、羽扇豆(lupins)，馬鈴薯，糖甜菜(sugarbeet)，豌豆，豆(bean)和大豆(soybean)禾口十字花禾鬥的(cruciferous)植物(十字花禾鬥(familyBrassicaceae)),如花椰菜(cauliflower)，油菜籽(rapeseed)和緊密相關的模型生物體擬南芥(Arabidopsisthaliana)。如例如美國專利5，689，054號和美國專利6，111，168號中所述的低肌醇六磷酸植物是經工程改造的植物的實例。植物部分的實例是莖(stem)、愈傷組織(calIus)、葉(leaf)、根(root)、果實(fruit)、種子(seed)和塊莖(tuber)，以及包含這些部分的獨立組織，例如，表皮(epidermis)、葉肉(mesophyll)、薄壁組織(parenchyma)、維管組織(vasculartissue)、分生組織(meristem)。具體的植物細胞區室(compartments)，如葉綠體(chloroplast)、質夕卜體(apoplast)、線粒體(mitochondria)、液泡(vacuole)、過氧化物酶體(peroxisome)禾口細胞質(cytoplasm)也被認為是植物部分。此外，任何植物細胞，無論什麼組織來源，都被認為是植物部分。同樣地，植物部分，如分離以促進本發明的應用的具體組織和細胞也被認為是植物部分，例如胚(embryo)、胚乳(endosperm)、糊粉(aleurone)和種皮(seedcoat)。同樣包含於本發明範圍內的還有這些植物、植物部分和植物細胞的後代。表達本發明多肽的轉基因植物或植物細胞可以依照本領域已知方法構建。簡言之，通過如下方法構建所述植物或植物細胞將編碼本發明多肽的一個或多個表達構建體併入植物宿主基因組，並且將所得的修飾植物或植物細胞繁殖為轉基因植物或植物細胞。方便地，表達構建體是包含編碼本發明多肽的核酸序列的核酸構建體，所述多核苷酸與在選擇的植物或植物部分中表達該核酸序列所需的適當的調節序列可操作地連接。此外，表達構建體可包含對於鑑定宿主細胞有用的選擇性標記，在所述宿主細胞中整合了24表達構建體和將該構建體引入到所述植物中所必需的DNA序列(後者依賴於使用的DNA引入方法)。調節序列的選擇，例如啟動子和終止子序列和任選地信號或轉運序列的選擇，舉例來說，基於期望何時、何處以及如何表達多肽而確定。例如，編碼本發明多肽的基因的表達可以是組成型的或誘導型的，或可以是發育、階段或組織特異性的，並且基因產物可以靶向特定的細胞區室、組織或植物部分例如種子或葉。調節序列由例如league等，1988,PlantPhysiology86:506所述。對於組成性表達，可以使用下述啟動子35S_CaMV啟動子(Franck等，1980，Cell21:285-294)、玉米泛素1(ChristensenAH,SharrockRA和Quail1992，.Maizepolyubiquitingenesstructure,thermalperturbationofexpressionandtranscriptsplicing,andpromoteractivityfollowingtransfertoprotoplastsbyelectroporation)或稻肌動蛋白1啟動子(PlantMo.Biol.18，675-689.；Zhang等，W,McElroyD.andWuR1991,AnalysisofriceActl5'regionactivityintransgenicriceplants.PlantCell3,1155-1165)0器官特異性啟動子可以是例如來自貯藏庫組織(storagesinktissue)例如種子、馬鈴薯塊莖和果實的啟動子(Edwards&Coruzzi,1990，Ann.Rev.Genet.24:275-303)，或來自代謝庫組織(metabolicsinktissue)例如分生組織的啟動子(Ito等，1994，PlantMol.Biol.24:863-878)，種子特異性啟動子諸如來自稻的谷蛋白(glutelin)、醇溶蛋白(prolamin)、球蛋白(globulin)或白蛋白(albumin)啟動子(Wu等，1998，PlantandCellPhysiology39:885-889)，來自豆球蛋白(Iegumin)B4和蠶豆(Viciafaba)的未知的種子蛋白基因的蠶豆啟動子(Conrad等，1998，JournalofPlantPhysiology152:708-711)、來自種子油體蛋白(oilbodyprotein)的啟動子(Chen等，1998，PlantandCellPhysiology39:935-941)，來自歐洲油菜(Brassicanapus)的貯藏蛋白napA啟動子，或本
技術領域：
公知的任何其他種子特異性的啟動子，例如，在WO91/14772中所描述的。此外，啟動子可為葉特異性的啟動子，如來自稻或番茄的rbcs啟動子(Kyozuka等，1993，PlantPhysiologyl02:991-1000)，小球藻病毒(chlorellavirus)腺嘌呤甲基轉移酶(adeninemethyltransferase)基因啟動子(Mitra和Higgins，1994，PlantMolecularBiology洸85-93)，或來自稻的aldP基因啟動子(Kagaya等，1995,Molecularandgeneralgenetics248:668-674)，或傷口誘導的啟動子，如馬鈴薯pin2啟動子(Xu等，1993，PlantMolecularBiology22:573-588)。同樣地，所述啟動子可通過非生物的處理誘導，所述非生物的處理如溫度、乾旱或鹽度變化，或通過外源施加的激活所述啟動子的物質誘導，例如乙醇、雌激素(oestrogens)、植物激素(planthormones)如乙烯、脫落酸(abscisicacid)、赤黴酸(gibberellicacid)和/或重金屬。啟動子增強子元件也可以用於實現酶在植物中的較高表達。例如，啟動子增強子元件可以是內含子，其置於啟動子和編碼本發明多肽的核苷酸序列之間。例如Xu等，1993，見上文，公開了使用稻肌動蛋白1基因的第一內含子以增強表達。仍進一步，可對於所討論的植物物種優化密碼子的使用以改善表達(參見上文引用的Horvath等)。選擇性標記基因和表達構建體的任何其它部分可以選自本領域內可得到的那些。將核酸構建體根據本領域已知的常規技術併入植物基因組，所述常規技術包括土壤桿菌屬(Agrobacterium)介導的轉化、病毒介導的轉化、顯微注射(microinjection)、粒子轟擊、生物射彈轉化和電穿孔(Gasser等，1990，Science2441293；Potrykus,1990,Bio/Technology8535；Shimamoto等，1989,Nature338274)。目前，根癌土壤桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)介導的基因轉移(genetransfer)，是產生轉基因雙子葉植物的優選方法(為了參考，見Hooykas和khilperoort，1992，PlantMolecularBiology19:15-38)，而且它也可以用於轉化單子葉植物，雖然對於這些植物其他的轉化方法是更加常用的。目前，除了土壤桿菌屬方法外，產生轉基因單子葉植物的優選的方法，是用粒子(用轉化DNA塗覆的微觀的金或鎢粒子)轟擊胚愈傷組織(embryoniccalli)或發育中白勺(developingembryos)(Christou,1992,PlantJournal2:275-281；Shimamoto,1994,CurrentOpinionBiotechnology5:158-162；Vasil等，1992,Bio/Technology10:667-674)。轉化單子葉植物的可供選擇的方法是基於原生質體轉化，如由Omirulleh等，1993，PlantMolecularBiology21:415-4所描述的。轉化之後，根據本領域熟知的方法選擇具有併入其中的表達構建體的轉化體並且再生成為完整植物。通常設計轉化方法用於通過如下方法在再生期間或在後續世代中選擇性消除選擇基因例如，使用帶有兩種獨立的T-DNA構建體的共轉化或通過特異性重組酶位點特異性地切除選擇基因。本發明還涉及用於產生本發明多肽的方法，其包括(a)在有助於產生多肽的條件下培養包含核酸序列的轉基因植物或植物細胞，所述核酸序列編碼本發明具有酶活性的多肽；和(b)回收所述多肽。組合物在仍進一步的方面，本發明涉及包含本發明的多肽的組合物。可以依照本領域內已知的方法製備多肽組合物，並且可以是液體或幹組合物的形式。例如，所述多肽組合物可以是顆粒(granulate)或微粒(microgranulate)的形式。可以依照本領域內已知方法將包含於所述組合物中的多肽穩定化。下面給出的是本發明的多肽或多肽組合物的優選用途的實例。動物飼料本發明還涉及在動物飼料中使用具有酯酶活性的多肽的方法，以及涉及包含本發明多肽的飼料組合物和飼料添加劑術語動物包括所有動物，包括人。動物的實例為非反芻動物和反芻動物。反芻動物包括，例如，動物如綿羊、山羊和牲畜(cattle)，例如牛(cow)如肉牛和奶牛。在一個具體實施方案中，動物是非反芻動物。非反芻動物包括單胃動物，例如豬(Pigorswine)(包括但不限於，小豬、飼育豬(growingpig)和母豬)；家禽如火雞、鴨和雞(包括但不限於肉仔雞(broilerchick)、蛋雞)；魚(包括但不限於鮭魚、鱒魚、羅非魚、鯰魚和鯉魚)；和甲殼類動物(包括但不限於小蝦(shrimp)和對蝦(prawn))。術語飼料或飼料組合物意指任何適合或旨在由動物攝取的化合物、製備物、混合物或組合物。在本發明的用途中，酯酶可在飲食之前、之後或同時飼餵予動物。後者是優選的。在一個具體實施方案中，所述酯酶在其添加至飼料或包含於飼料添加物時的形式是明確限定的。明確限定意指酯酶製備物如通過尺寸排阻色譜確定為至少50%純(參見W001/58275的實施例12)。在其他具體實施方案中，所述酯酶製備物如通過該方法確定為至少60、70、80、85、88、90、92、94或至少95%純。明確限定的酯酶製備物是有利的。舉例而言，將基本上不含幹擾或汙染的其他酯酶的酯酶正確劑量添加於飼料中是容易得多的。術語正確劑量添加特別指獲得一致和恆定結果的目標，以及基於所需的效果優化劑量的能力。然而，對於在動物飼料中的用途，所述酯酶無需如此之純；其可例如包含其他酶，在此情況下其稱為酯酶製備物。所述酯酶製備物可(a)直接添加至飼料(或直接用於蛋白質的處理工藝)或(b)可用於產生一種或多種後續添加至飼料(或用於處理工藝)的中間組合物如飼料添加劑或預混物(premix)。上述的純度指原始酯酶製備物的純度，無論是根據上述(a)或(b)使用的。具體而言，具有該數量級的純度的酯酶製備物可使用重組產生方法獲得，而當通過傳統發酵方法產生該酯酶時，其並不那麼容易獲得，且其批次間(batch-to-batch)差異要高得多。當然，此種酯酶製備物可與其他酶混合。可以任何形式將酯酶添加至飼料，無論其為相對純的酯酶或與其他旨在添加至動物飼料的組分一同混合，即以動物飼料添加劑的形式，如所謂用於動物飼料的預混物。在一個進一步的方面，本發明涉及用於動物飼料的組合物，如動物飼料和動物飼料添加劑，例如預混物。除了本發明的酯酶，本發明的動物飼料添加劑包含至少一種脂溶性維生素和/或至少一種水溶性維生素，和/或至少一種痕量元素和/或至少一種常量礦物質(macromineral)0此外，可選的飼料添加劑成分為著色劑，例如類胡蘿蔔素如胡蘿蔔素、蝦青素和葉黃素；香料化合物；穩定劑；抗微生物肽；多不飽和脂肪酸；產活性氧類物質；和/或至少一種其他選自下組的酶肌醇六磷酸酶(EC3.1.3.8或3.1.3.26)；木聚糖酶(EC3.2.1.8)；半乳聚糖酶(EC3.2.1.89)；α-半乳糖苷酶(EC3.2.1.22)；蛋白酶(EC3.4.)；磷脂酶Al(EC3.1.1.32)；磷脂酶A2(EC3.1.1.4)；溶血磷脂酶(EC3.1.1.5)；磷脂酶C(EC3.1.4.3)；磷脂酶D(EC3.1.4.4)；澱粉酶如例如α-澱粉酶(EC3.2.1.1)；β-葡聚糖酶(EC3.2.1.4或EC3.2.1.6)和/或阿拉伯呋喃糖苷酶(EC3.2.1.55)。在一個具體實施方案中，這些其他酶是明確限定的(如上述對於酯酶製備物所定義的)。抗微生物肽(AMP)的例子有CAP18、LeucocinA(明串珠菌素A)、Tritrpticin,Protegrin-I、Thanatin(死亡素)、防衛素(Defensin)、Lactoferrin(乳鐵蛋白)、Lactoferricin(乳鐵素)禾口Ovispirin如Novispirin(RobertLehrer，2000)、Plectasins(菌絲黴素)、和Statins(他汀類)，包括WO03/044049和WO03/048148中公開的化合物和多肽，以及上述各項的保留抗微生物活性的變體或片段。多不飽和脂肪酸的例子有C18、C20和C22多不飽和脂肪酸，如花生四烯酸、二十二碳六烯酸(docosohexaenoicacid)、二十碳五烯酸和Y-亞油酸。產活性氧類物質的例子是化學品如過硼酸鹽(perborate)、過硫酸鹽(persulphate)或過碳酸鹽(percarbonate)；和酶如氧化酶、加氧酶或合成酶。通常，脂溶性和水溶性維生素以及痕量礦物質形成旨在加入飼料中的所謂預混物的部分，而常量礦物質通常分開地添加到飼料中。這些組合物類型之任一，當富含本發明的酯酶時，為本發明的動物飼料添加劑。在一個具體的實施方案中，本發明的動物飼料添加劑旨在以0.005至10%，具體而言0.01至5%，更具體而言0.02至2%，且甚至更具體而言0.2至1%的水平包含於(或被規定為必須包含於)動物飲食或飼料中(％表示每IOOg飼料的g添加劑)。對於預混物而言尤其如此。下面是這些組分的實例的非排他性列表脂溶性維生素的例子有維生素A、維生素D3、維生素E和維生素K，例如維生素K3。水溶性維生素的例子有維生素B12、生物素和膽鹼、維生素Bi、維生素B2、維生素B6、煙酸、葉酸和泛酸(鹽)、例如Ca-D-泛酸。痕量礦物質的例子有錳、鋅、鐵、銅、碘、硒和鈷。常量礦物質的例子有鈣、磷和鈉。這些組分的營養需要量(以家禽和小豬/豬為例)在WO01/58275的表A中列出。營養需要量是指這些組分應以指明的濃度在飲食中提供。或者，本發明的飼料添加劑包含WO01/58275的表A中指定的各單獨組分中的至少一種。至少一種意指任一種，一種或多種，一種，或兩種，或三種，或四種，依此類推多至全部13種，或多至全部15種單獨組分。更具體地說，該至少一種單獨組分以這樣的量包含在本發明的添加劑中，從而提供如表A的第4欄、或第5欄或第6欄所示範圍內的飼料中濃度(in-feed-concentration)0本發明還涉及動物飼料組合物。動物飼料組合物或飲食具有相對高含量的蛋白質。家禽和豬用飲食可以如WO01/58275的表B中所示來表徵。魚用飲食可以如該表B的第4欄所示來表徵。此外，此類魚用飲食通常具有200-310g/kg的粗脂肪含量。WO01/58275對應於美國專利第6，960，462號，在此通過提述將其併入本文。根據本發明的動物飼料組合物的粗蛋白含量為50_800g/kg，並且還包含至少一種如本文中要求保護的酯酶。此外，或者(作為上述粗蛋白含量的替代)，本發明的動物飼料組合物的可代謝能量含量為10-30MJ/kg；和/或鈣含量為0.l-200g/kg；和/或有效磷含量為0.l_200g/kg；和/或甲硫氨酸含量為0.l-100g/kg；和/或甲硫氨酸加半胱氨酸含量為0.l-150g/kg；和/或賴氨酸含量為0.5-50g/kg。在具體的實施方案中，可代謝能量、粗蛋白、鈣、磷、甲硫氨酸、甲硫氨酸加半胱氨酸、和/或賴氨酸的含量為WO01/58275的表B中範圍2、3、4或5(第2_5行)之任一者之內。粗蛋白如下計算氮(N)乘以因數6.25，即粗蛋白(g/kg)=N(g/kg)x6.25。氮含量用凱氏定氮法(A.0.A.C.，1984，OfficialMethodsofAnalysis第14版，AssociationofOfficialAnalyticalChemists,WashingtonDC)來測定。可代謝能量可基於下列文獻來計算NRCpublicationNutrientrequirementsinswine,修訂的第9版，subcommitteeonswinenutrition,committeeonanimalnutrition,boardofagriculture,nationalresearchcouncil.NationalAcademyPress，Washington，D.C.，pp.2—6，禾口EuropeanTableofEnergyValuesforPoultryFeed-stuffs,Spelderholtcentreforpoultryresearchandextension,7361DABeekbergen,TheNetherlands.GrafischbedrijfPonsen&looijenbv,ffageningen.ISBN90-71463-12-5。鈣、可用磷、和胺基酸在完全動物飲食中的飲食含量基於如Veevoedertabe11997,gegevensoverchemischesamenstelling,verteerbaarheidenvoederwaardevanvoedermiddelen,CentralVeevoederbureau,Runderweg6,8219pkLelystad.ISBN90-72839-13-7等的飼料表來計算。動物飲食可以作為例如碎飼料(mashfeed)(未制粒的)或制粒的飼料來製備。通常，將經過粉碎的飼料物料混合，並根據所述物種的具體規格加入足夠量的必需維生素和礦物質。酶可以作為固體或液體酶配製物加入。例如，固體酶配製物通常在混合步驟之前或過程中加入，而液體酶製備物通常在制粒步驟之後加入。酶也可以摻入飼料添加劑或預混物中。飲食中的最終酶濃度是在每kg飲食0.01-200mg酶蛋白的範圍內，例如在0.2-30mg的範圍內，優選每kg動物飲食0.5至1.5mg酶蛋白。對於包含木聚糖酶和酯酶的酶組合物，最終酶濃度通常為每kg動物飲食0.5至lmg。毫無疑問，酯酶可以以有效量施用，即以足以改善飼料溶解和/或改善飼料營養價值的量施用。目前涵蓋了酶以一種或多種下述量(劑量範圍)施用0.01-200;0.01-100；0.5-100；1-50；5-100；10-100；0.05-50；或0.10-10-所有範圍為每kg飼料的mg酯酶蛋白(ppm)。為了確定每kg飼料的mg酯酶蛋白，將酯酶從飼料組合物純化，並使用相關測定法(參見下述酯酶測定部分)確定所述純化的酯酶的比活性。飼料組合物本身的酯酶活性也使用相同測定法確定，並基於此兩種確定，計算了以每kg飼料的mg酯酶蛋白計的劑量。相同原則適用於確定飼料添加劑中的mg酯酶蛋白。毫無疑問，如果可獲得用於製備所述飼料添加劑或所述飼料的酯酶的樣品，則從該樣品確定所述比活性(無需從飼料組合物或添加劑純化酯酶)。實施例試劑、培養基和設備mi除非另行指明，所用的化學品為至少試劑級的商業產品。pNP-底物pNPB丁酸對硝基苯酯(p-NitrophenylButyrate)(SigmaN9876),pNPA:乙酸對硝基苯酯(p-NitrophenylAcetate)(SigmaN8130)，pNPP棕櫚酸對硝基苯酯(p-Nitrophenylpalmitate)(SigmaN2752)，pNNAG對硝基苯基N-乙醯基-β-D-氨基葡糖苷(p-NitrophenylN-Acetyl-β-D-Glucosaminide)(SigmaN9376)。EDTA(GibcoBRL目錄號15576-028)IPTG(Promega,目錄號V3951)X-gal(Promega,目錄號V3941)氨苄青黴素鈉鹽(GIBC0L目錄號11593-019)LMP瓊脂糖(!Iomega，目錄號V2111)BETEB對苯二甲酸二O-羥乙基)酯二苯甲酸酯(Tei^phthalicacidbis(2-hydroxyethyl)esterdibenzoate)在本文中縮寫為BETEB(苯甲醯-亞乙基-對苯三甲酸_亞乙基一苯甲酸酉旨(benzoyl-ethylene-terephthalic-ethelene-benzoate))。其從對苯二甲酸二(2-羥乙基)酯和苯甲酸製備。培養基LB液體培養基向950ml的去離子H2O添加IOg細菌蛋白腖，5g細菌酵母提取物，IOgNaCl。振蕩直至溶質溶解。用5NNaOH(0.^il)將pH調整至7.0。用去離子H2O將溶液體積調整至1升。以液體循環在151b/sq.in.進行高壓滅菌20分鐘。含氨苄青黴素/IPTG/X-Gal的LB平板將15g瓊脂糖添加至1升的LB培養基。添加氨苄青黴素至終濃度100μg/ml，然後補充0.5mMIPTG和80μg/mlX-gal並鋪板。SOC液體培養基2%胰蛋白腖，0.5%酵母提取物，IOmMNaCl,2.5mMKCl,10mMMgCl2,IOmMMgSO4,20mM葡萄糖TAE緩衝液0.04MTris-乙酸，0.001MEDTA1%LMP瓊脂糖凝膠將IgLMP瓊脂糖添加入100ml1XTAE緩衝液。YS培養基向1升水添加10g蛋白腖，IOg酵母提取物，5g葡萄糖，5gK2HPO4,IgMgSO4.7H20,20ml橄欖油。MD培養基1.34%YNB，4X10_5%生物素，2%右旋糖BMGY(緩衝的甘油複合培養基，BufferedGlycerol-complexMedium)；酵母提取物，2%蛋白腖，IOOmM磷酸鉀(pH6.0),1.34%YNB，4xl(T5%生物素，1%甘油BMMY(緩衝的甲醇複合培養基，BufferedMethanol-complexMedium)酵母提取物，2%蛋白腖，IOOmM磷酸鉀(pH6.0)，1.34%YNB，4xl(T5%生物素，0.5%甲醇。設備，包括各種試劑盒5Κ膜(MilliporeΒΙ0ΜΑΧ-5,13442ΑΜ)0.45μm過濾器(Nalgene190-2545)0.45μm聚碳酸酯過濾器(Sartorius)QSepharoseFF柱(AmershamPharmacia17-0510-01)Superdex75柱(AmershamPharmacia17-1047-01)SuperdexPeptidePE(7.5x300mm)凝膠過濾柱(Global)IEF-凝膠(AmershamPharmacia80-1124—80)ThermomixerComfort(Eppendorf)SpectrophotometerDU7500(Beckman)GeneAmpPCRSystem9700(PE)Vac-ManJr.LaboratoryVacuumManifold(Promega,目錄號A7660)BioRadGenePulserIIRNeasyPlantMiniKit(50)(QIAGEN,目錄號74904)DNeasyPlantMiniKit(50)(QIAGEN,目錄號69104)3，RACEKit(GIBC0,目錄號18373-019)，包含Adapter引物和AUAPdNTP混合物(lOOmM，Promega,目錄號U1330)TaqDNA聚合酶系統(Promega，目錄號M1661)，包含PCR緩衝液QOOmOTris-HCl(pH8.4),500mMKCl)PCRPrepsDNAPurificationSystem(Promega,目錄號A7170)pGEM-TVectorSystem(Promega,目錄號A3600)，包含T4DNALigase2XBufferJM109高感受態細胞(!Iomega，目錄號L1001)ElectroMaxDH10B感受態細胞(Invitrogen,目錄號18290-015)MiniprepsDNAPurificationSystem(Promega,A7100)BigDyeTerminatorCycleSequencingReadyReactionKit(PEAppliedBiosystems,目錄號4303149)DNAWalkingSpeedUpKit(SeeGene,目錄號#K1502)ABIPrism377DNA測序儀(PE)pfuDNA聚合酶系統(!Iomega，目錄號M7741)SnaBI(PromegaR6791)NotI(PromegaR6431)BglII(PromegaR6071)實施例1酯酶測定法瓊脂糖平板測定法含有磷酸鹽-檸檬酸鹽緩衝液pH8.5中的瓊脂糖，0.1%BETEB的瓊脂糖平板；將20μ1樣品施於含BETEB底物的瓊脂糖平板中的d=4mm的孔，在45°C溫育12-16小時，通過清晰的暈圖(halo)鑑定酶活性。BETEBfopendorf管測定法將0.08%BETEB底物的溶液在攪拌下懸於Tri-HCl緩衝液pH8.5中(對於實施例4中的pH分布部分，使用pH3至pH11的緩衝液系統代替)。將溶液在攪拌下分配於Eppendorf管中(每孔100μ1)，添加30μ1酶樣品，並在EppendorfThermomixer中在50°C以1200rpm溫育平板30分鐘。使用變性的酶樣品(在100°C煮沸20分鐘)作為空白。在溫育之後，通過將管轉移至冰上來終止反應，然後在4°C以IOOOOrpm離心10分鐘。將60μ1的上清轉移至微滴定板，並使用BioRadMicroplateReader測量230nm處的吸光度。等電聚焦等電聚焦是在預製的AmpholinePAG平板pH3.5-9.5(Pharmacia,Sweden)中根據生產商的指示進行的。將樣品以一式三份施用，並在電泳之後，將凝膠一分為三。將含有瓊脂糖和緩衝液PH8.5中的0.BETEB的覆蓋物(overlay)傾至每部分凝膠之上。在45°C溫育12-16小時。通過清晰區鑑定酶活性和酶蛋白的pi。在pNPB底物中確定酯酶活性使用丁酸對硝基苯酯作為底物確定酯酶活性。將酶製備物稀釋以提供丁酸對硝基苯酯少於15%的轉化，即在1.5ml微離心管中用50mM乙酸鈉pH5.0進行起始稀釋，接著用50mM乙酸鈉pH5.0進行2倍系列稀釋。然後將稀釋酶的100μ1等分試樣轉移至96孔板的孔。丁酸對硝基苯酯儲液是通過將丁酸對硝基苯酯溶解於二甲亞碸(DMSO)以構成0.IM溶液而製成的。在測定之前，將儲液樣品在50mM乙酸鈉pH5.0中稀釋100倍以製成ImM溶液。將100μ1體積的ImM丁酸對硝基苯酯與每個酶稀釋物混合，然後在25°C溫育10分鐘。將底物本身、酶本身和緩衝液本身作為對照運行。將0.25,0.2,0.1,0.05和0.02mM的對硝基苯酚標準溶液通過將IOmM儲液稀釋於50mM乙酸鈉pH5.0來製備。在10分鐘時，將50μ1的1.OMTris-HClpH8.0緩衝液添加至每個孔(包括樣品、底物對照、酶對照、試劑對照和標準)，混合，並在微滴定板讀數器(BioRad)上立即測量405nm處的吸光度。一個單位的酯酶活性定義為在PH5，25°C每分鐘能夠釋放1微摩爾對硝基苯酚鹽陰離子的酶量。實施例2漆斑菌屬菌種菌株的培養對於接種，將真菌菌種漆斑菌屬菌種菌株在YS瓊脂糖平板(10g/L蛋白腖，IOg/L酵母提取物，5g/L葡萄糖，5g/LK2HPO4,lg/LMgSO4.7H20，20g/L瓊脂，pH6.5)上在25°C生長7日並儲藏於4°C，然後用於接種搖瓶。對於粗酶產生，將菌株接種於含50mlYS培養基(10g/L蛋白腖，10g/L酵母提取物，5g/L葡萄糖，5g/LK2HPO4,lg/LMgSO4.7H20，橄欖油，PH6.5)的500ml搖瓶，並在25°C和160rpm下溫育7日。通過離心收穫發酵液(在4°C以4000rpm進行20分鐘)。實施例3來自漆斑菌屬菌種菌株的酯酶的純化將來自實施例2的1200ml上清用硫酸銨(80%飽和)沉澱，並重新溶解於40ml25mMTris-HCl,pH7.4緩衝液。將所得的溶液對25mMTris-HCl緩衝液(pH8.0)透析以去除鹽。最終體積為50ml。將濃縮的酶溶液加載於用25mMTris-HCl緩衝液，pH8.0平衡的MonoQ陰離子交換柱，然後用O-IMNaCl的線性梯度洗脫蛋白質。就^Onm處的吸收檢查來自柱的流出物，並通過BETEB平板測定法在pH8.5測定級分的酶活性。將具活性的級分匯集並濃縮，然後將上述經濃縮的級分上樣於之前用25mMTris-HCl緩衝液，pH8.0平衡的Superdex75凝膠過濾柱，並用相同緩衝液洗脫蛋白。在酶測定之後，匯集具活性的級分，將其再次濃縮並對20mM乙酸鈉緩衝液，pH5.0進行透析。將經透析的樣品施於第三個柱，用20mM乙酸鈉緩衝液，pH5.0平衡的MonoQ0用0_1MNaCl的線性梯度洗脫蛋白。最終，匯集具活性的級分並將其用於表徵。在上述純化步驟之後，收集樣品，並對其就兩種活性(瓊脂糖平板測定法和用BETEB的覆蓋物技術)還有純度(SDSPAGE和IEF凝膠)進行檢查，然後用於表徵。在SDSPAGE上，發現了4個大約在分子量60kDa左右的蛋白條帶，並假定其為對應的酶蛋白。對這些酶條帶進行電印跡，並確定其N端序列。發現這4個蛋白條帶具有相同的N端序列SCSPEVFSSVGIPKGEVL。在運行IEF凝膠之後的BETEB底物的覆蓋物顯示有單個具有約pH3.5的pi的活性級分。根據相同的N端序列和相同的pi推出結論其為相同的蛋白。實施例4漆斑菌屬菌種菌株的酯酶的表徵溫度分布溫度和酶活性之間的關係是使用P-NPB和BETEB兩種測定來評價的。酶在20至70°C的廣泛溫度範圍內具活性，並表現為在50_60°C左右具有其最優溫度。pH分布pH和酶活性之間的關係是使用實施例1的p-NPB和BETEB兩種測定用pH3至pHll的緩衝系統來進行評價的。酶表現為在pH4至10的廣泛pH範圍內具活性。最優pH是約8_9。溫度穩定件對於溫度穩定性測量，將酶在60度溫育不同時間(0、1、3、4、6、7、14和24小時)，然後使用PNPB作為底物在pH8.5測定酶活性。酶表現為穩定的。甚至在60度溫育7小時之後仍具有大約30%的殘留活性。DNP底物特異件所述酶的底物特異性是使用不同底物包括幾種pNP底物(丁酸對硝基苯酯(SigmaN9876)，乙酸對硝基苯酯(SigmaN8130)，棕櫚酸對硝基苯酯(SigmaN275》，對硝基苯基N-乙醯基-β-D-氨基葡糖苷(SigmaN9376)，鞣質，BETEB)來進行評價的。結果示於下述表1。表1本發明的酶的底物特異性的比較權利要求1.一種具有酯酶活性的分離的多肽，所述多肽選自下組(a)包含胺基酸序列的多肽，所述胺基酸序列與SEQIDNO:2的成熟多肽具有至少45%同一性；(b)由多核苷酸編碼的多肽，所述多核苷酸在至少中嚴格條件下與以下雜交(i)SEQIDNO1的成熟多肽編碼序列，(ii)包含於SEQIDNO1的成熟多肽編碼序列中的cDNA序列，或(iii)⑴或的全長互補鏈；(c)由多核苷酸編碼的多肽，所述多核苷酸包含與SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列具有至少45%同一性的核苷酸序列；(d)SEQIDNO:2的成熟多肽的包含取代、缺失和/或插入一個或幾個胺基酸的變體。2.權利要求1的分離的多肽，其具有與SEQIDNO:2的成熟多肽具有至少50%，或55%，或60%，或65%，或70%，或75%，或80%，或85%，或90%，或95%，或98%同一性的胺基酸序列。3.權利要求1的分離的多肽，包含SEQIDNO2的胺基酸序列，或由SEQIDNO2的胺基酸序列組成。4.權利要求1的分離的多肽，包含SEQIDNO2的成熟多肽，或由SEQIDNO2的成熟多肽組成。5.一種分離的多核苷酸，包含編碼權利要求1的多肽的核酸序列。6.權利要求5的分離的多核苷酸，包含編碼SEQIDNO:2的成熟多肽的核酸序列。7.權利要求5的分離的多核苷酸，包含SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列或由SEQIDNO1的成熟多肽編碼序列組成。8.—種核酸構建體，其包含與一種或多種調控序列可操作地連接的權利要求5-7任一項的多核苷酸，所述調控序列在合適的表達宿主中指導所述多肽的產生。9.一種重組表達載體，其包含權利要求8的核酸構建體。10.一種重組宿主細胞，其包含權利要求8的核酸構建體或權利要求9的載體。11.一種轉基因植物或植物部分，能夠表達權利要求1至4中任一項的多肽。12.—種轉基因非人動物，或其產物或元件，能夠表達權利要求1至4中任一項的多肽。13.一種用於產生權利要求1至4中任一項的多肽的方法，所述方法包括(a)培養權利要求10的重組宿主細胞以產生包含所述多肽的上清；(b)回收所述多肽。14.權利要求1至4中任一項的多肽在動物飼料中的用途。15.權利要求1至4中任一項的多肽在製備用於動物飼料的組合物中的用途。16.一種用於改善動物飼料營養價值的方法，其中將至少一種權利要求1至4中任一項的多肽添加至所述動物飼料。17.一種組合物，其包含至少一種權利要求1至4中任一項的多肽，和(a)至少一種脂溶性維生素，和/或(b)至少一種水溶性維生素，和/或(c)至少一種痕量礦物質。18.權利要求17的組合物，其進一步包含澱粉酶、肌醇六磷酸酶、木聚糖酶、半乳聚糖酶、α-半乳糖苷酶、蛋白酶、磷脂酶、β-葡聚糖酶和/或阿拉伯呋喃糖苷酶。19.權利要求17或18的組合物，其為動物飼料添加劑。20.一種動物飼料組合物，其包含權利要求1至4中任一項的多肽或權利要求17至19中任一項的組合物。21.一種用於改善動物飼料營養價值的方法，其中將權利要求1至4中任一項的多肽或權利要求17至19中任一項的組合物添加至所述飼料。全文摘要本發明涉及具有酯酶活性的分離的多肽和編碼所述多肽的分離的多核苷酸。本發明還涉及包含所述多核苷酸的核酸構建體、載體和宿主細胞，以及用於產生和使用所述多肽的方法。文檔編號C12N9/16GK102361973SQ201080012864公開日2012年2月22日申請日期2010年1月15日優先權日2009年1月21日發明者D.彼得森,劉曄,吳文平,湯嵐申請人:諾維信公司