光遺傳學技術怎麼應用（光遺傳學技術這一篇就夠了）

2023-04-21 08:45:08 2

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光遺傳學（optogenetics）是一項整合了光學、軟體控制、基因操作技術、電生理等多學科交叉的技術。自2005年，史丹福大學Karl Deisseroth實驗室通過在神經細胞中表達光敏蛋白，響應不同波長的光刺激實現對神經功能的調控，宣布人類正式擁有了精準操控大腦的工具。長久以來，我們對複雜的神經網絡連接的理解僅停留在相關性上，有了光遺傳學，我們終於有能力，微創、精準地探究特定的神經環路和大腦功能之間的關係，這無疑是個跨越式的進步，下面我們就詳細地了解一下這門技術。 [ 視頻彩蛋在文末 ]

光遺傳學的歷程：

1. 綠色螢光蛋白的發展：1962年，下村脩從水母中發現了綠色螢光蛋白（GFP），正式開啟了生物發光研究的大門，從此以後，科學家通過改造和篩選，獲得了更強，螢光種類更豐富的螢光蛋白來作為生物體的標記，用螢光的辦法使生物體內發生的變化可視化。2008年，綠色螢光蛋白獲得了諾貝爾化學獎。

圖1. 運用螢光蛋白帶來的最典型、最絢爛的研究——腦虹（Braibow）

2007年，Joshua R. Sanes 和Jeff W. Lichtman主持的一項研究將紅黃藍三種顏色的螢光色素嵌入小鼠基因組，成功地為小鼠的不同細胞塗上不同顏色。三種顏色相互組合，最終展現在顯微鏡下的老鼠腦幹組織切片上有近百種顏色標記，如同一道絢爛的彩虹。

腦虹讓我們清楚地看到了大腦內不同細胞交織在一起的絕妙畫面，也帶來了更深一層的問題——這些細胞之間，是怎麼互相作用的呢？在經典的生物學實驗中，控制神經細胞需要一些比較粗暴的手段，電刺激、切腦區、或者是加一些化學物質。費時費力不說，達到的實驗效果也並不盡如人意。長久以來，神經學家們一直夢想著，能夠以精確的時空精度控制神經元活動。這個夢想被光遺傳學實現了。光遺傳學的靈感實際上來自我們的視覺。人眼中有重重的感光細胞，外界的光線進入我們的眼睛，在視網膜後轉變為化學信號和電信號，通過神經元的傳輸進入大腦。那我們是不是也可以通過光來給神經元下命令，操控它們的活動呢？

2. 2005年——光遺傳學不被認可的開始：，史丹福大學的Edward S Boyden和Karl Deisseroth教授（文末視頻主講者）通過使用慢病毒載體將一種萊茵衣藻的蛋白質ChR2 (Channelrhodopsin-2) 轉染到神經元中，實現動作電位與突觸傳導的興奮/抑制性控制。然而這樣一項開拓性的工作卻接連被Nature和Science雜誌拒稿，最終即使被Nature Neuroscience接收, 其工作的實用性也遭到了質疑。

3. 2005至今——光遺傳學的發展和完善：儘管光遺傳學一出現就遭遇了坎坷，但隨著與光學的緊密結合，這種以微生物產生的視蛋白為基礎的光遺傳學操控被廣泛應用。對神經環路的研究物種發展到了線蟲、果蠅、斑馬魚、齧齒動物等。光遺傳學的出現使科學家對神經環路的研究更加可控，特別是當隨機檢測一個神經元對於神經環路的意義時，光遺傳學已經逐漸成為無脊椎動物研究行為基礎的神經環路的標尺。即使目前無法完全理解任何感覺、行為和認知的過程，但科研工作者們已經嘗試應用光遺傳學來繪製信息流形成的大腦圖譜，例如結合fMRI(functional magnetic resonance imaging, 功能性磁共振成像)或者PET(postron emission tomography，正電子輻射斷層成像)的前沿技術對特定神經細胞產生的活動模式進行全腦範圍的成像。隨著光遺傳學方法和技術的不斷發展與完善，光遺傳學被科學界廣泛認可，2010年被Nature Methods選為年度方法，同年被Science認為是近十年來的突破之一。

圖2. 2005年至今光遺傳相關的論文數量 (Nature Neuroscience，2015，18

光遺傳學的基本原理：

1. 神經元膜內外的離子分布：我們知道，當神經元處於靜息狀態時，細胞膜兩邊存在著電位差，這被稱為靜息電位。靜息電位的產生是由於膜內外各種離子的分布不均衡，以及細胞膜蛋白對各種離子的通透性不同造成的。

2. 光遺傳學原理：首先運用工具病毒載體，將光感基因（如ChR2，eBR，NpHR3.0，Arch或OptoXR等）轉入到神經系統特定類型的細胞中進行特殊離子通道或GPCR的表達。光感離子通道在不同波長的光照刺激下會分別對陽離子或者陰離子的通過產生選擇性，如Cl-、Na 、H 、K ，從而造成細胞膜兩邊的膜電位發生變化，達到對細胞選擇性地興奮或者抑制的目的。

3. 光遺傳蛋白應用舉例：例如，對於ChR2來說，當有473nm的藍色雷射照射時，這些通道蛋白的通道打開，允許陽離子（如Na ）大量內流，產生動作電位，即讓神經元處於興奮狀態。對於NpHR來說，當有580nm的黃色雷射照射時，這些通道蛋白的通道打開，允許Cl-通過，使神經元一直處於靜息電位，即讓神經元保持靜息狀態。

圖3. 光遺傳蛋白的作用原理——利用離子通道的對離子的選擇性調節細胞的興奮性

光遺傳學的應用步驟：

相比起傳統的研究方法，光遺傳學有著無可比擬的優點。它只需要向細胞內轉入一個蛋白，實際操作性高；以光作為刺激媒介，可實現神經細胞的毫秒級操控；利用光遺傳技術觀察神經投射；通過組織特異性啟動子實現特定細胞的調控；對實驗動物的創傷遠遠小於傳統方法，且沒有異物侵入組織；可以用定位的光纖來局部刺激細胞，也可以設計彌散光大範圍刺激腦區。利用光遺傳學技術進行研究主要包括以下4個步驟：

Step1 尋找合適的光敏蛋白

光敏蛋白可分為激活型和抑制型兩種，能夠引起神經元興奮或抑制。其光靈敏度和動力學之間存在負相關，激活或抑制能力強弱與時間的精準控制密切相關，所以，根據光敏感蛋白的不同特性尋找合適的光敏感蛋白是首要步驟。

Step2 向靶細胞內導入光敏蛋白基因

利用轉染、病毒注射或轉基因動物等方法將編碼光敏感蛋白的基因輸入到靶細胞中，其中，病毒注射是光遺傳學研究的主導手段，主要採用慢病毒和腺相關病毒AAV。

Step3 對光信號進行時空調控

可採用導入光纖或控制雷射的方式將光導入研究區域，選擇不同的參數（波長、光強度、頻率和佔空比）進行光刺激，來達到對神經元活動的時間調控；通過選擇性地照射細胞局部的方法來實現對神經元活動的空間調控。

Step4 收集輸出信號，讀取結果

一般採用電極記錄神經元細胞膜內外的電壓變化，並可用螢光性生物傳感器來檢測不同細胞數值，通過電生理記錄或行為學測試等方法，將光刺激對神經元、神經迴路或動物行為的改變呈現出來。

圖4. 光遺傳學實驗的基本步驟（以ChR2為例）

如何選擇合適的光遺傳蛋白：

光遺傳蛋白經過多年的發展，激活型和抑制型蛋白均發展出幾種不同的突變型，可以根據自己的雷射器和實驗需求進行選擇，下面簡要介紹。

激活型通道蛋白：

1. ChR2(H134R)：ChR2的突變體，將第134個胺基酸由組胺酸突變為精胺酸，該蛋白質可以產生兩倍的光電流，但通道開關速度也比野生的ChR2慢了一倍。該突變體是運用最廣的一種類型；

2. ChR2(C128S/D156A): ChR2的突變體，超靈敏光敏感通道，用藍色雷射打開通道，然後用綠色或黃色雷射關閉通道，可以打開其離子通道長達30分鐘；

3. ChR2(E123T/T159C): ChR2的突變體，更大的光電流和更快的動力學變化；

4. ChETA：ChR2的突變體，使得神經元在雷射刺激下可以發放200Hz的spike，而其他的ChR2 通道蛋白只能達到40Hz；

5. C1V1：由ChR1及由團藻發現的VChR1組合在一起的通道蛋白，在紅色雷射刺激下打開通道，該通道蛋白類型更利於雙光子激發；

6. ReaChR：能在大腦深處或透過頭蓋骨激活。

抑制型通道蛋白：

1. NpHR：即為Halorhodopsin，第一個有效抑制神經元活動的光遺傳學工具，在黃綠雷射照射下會將氯離子打進神經元內，而抑制神經元活動。當把NpHR表達在哺乳動物腦內時，會聚集在內質網上，而如果將內質網輸出元件加在NpHR基因序列後面，這樣可以使得NpHR在胞內高量表達，而且不會聚集在內質網上，這樣修改過的NpHR被稱為eNpHR2.0。但是eNpHR2.0在細胞膜的聚集仍然不夠，而將一個高爾基體輸出元件和來自於鉀離子通道Kir2.1的上膜元件加在eNpHR2.0基因序列後面，這樣就能實現在神經元細胞膜上的高量聚集，這樣修改過的NpHR被稱為eNpHR3.0；

2. Arch：即為archaerhodopsin，是一種黃色雷射激活的外向整流質子泵，能夠將帶正電的質子從神經元內移動到細胞外環境中，使神經元處於超極化狀態，從而保證神經元處於靜息狀態。在特定條件下，可用於增加細胞內pH或減少細胞外基質pH。和NpHR相比，當雷射關閉的時候，Arch立即從通道打開狀態恢復到關閉狀態。

3. Mac:即為 Leptosphaeria maculans fungal opsins，藍色雷射激活的質子泵，能夠將帶正電的質子從神經元內移動到細胞外環境中，使神經元保持超極化狀態，從而保證神經元處於靜息狀態。

光遺傳學應用舉例：

1. 抑制某個神經環路：首先在野生型小鼠脊髓背側的神經元，以AAV為載體表達抑制性光敏蛋白NpHR，在臂旁核區域安裝雷射器並發出黃光，這樣就可以將脊髓-臂旁核環路抑制，然後觀察小鼠的行為學改變。

圖5 光遺傳抑制脊髓-臂旁核的投射能夠明顯抑制藥物誘導的搔癢行為

2. 興奮某個神經環路：首先構建GRPR神經元特異誘導表達的小鼠，在小鼠脊髓背側的GRPR神經元注射AAV-DIO-ChR2-EYFP，使ChR2特異性表達在GRPR陽性神經元中，然後在GRPR陽性神經元處埋置雷射器並發出藍光以興奮神經元，再在GRPR陽性神經元下級處（與臂旁核直接聯繫的神經元）記錄電生理。這樣就可以將GRPR陽性神經元與脊髓水平的臂旁核下級投射神經元胞體的神經環路聯繫在一起。

圖6 光遺傳學研究GRPR陽性神經元與脊髓的投射

光遺傳學技術待解決的問題：

近年來，雖然光遺傳技術取得了矚目的成就，但是依然有一些需要我們關注的問題。

1. 首先，有人認為光遺傳學激活子和抑制子的標準用法存在瑕疵，對神經環路引入這樣外源的興奮或抑制的刺激可能使神經元應答超出生理範圍，在這種情況下，神經環路會出現不自然的變化，最後導致不正確的生理學結論。

2. 其次，光敏蛋白的表達和光照在神經元群體中並不均勻，結果是光遺傳學操縱的量級和範圍會出現異質性，例如發生光的散射時。

3. 再次，大範圍光刺激同時作用在神經元群體上，可能使環路出現非生理性的活動模式，例如靶向特化的某些細胞時產生的能量沉積等問題。

4. 另外，我們知道刺激表達光遺傳學蛋白的軸突是一個常用的策略，不過直接用光刺激軸突boutons，可能會引起非生理性的神經遞質釋放，容易使人過高估計突觸連接的影響。

5. 最後，有研究表明，不論是用病毒還是質粒電轉，長期高水平表達ChR2都會造成軸突形態異常，這就讓人懷疑光敏蛋白是否還會對神經環路的功能產生一些潛在的影響。因此，在光遺傳學用於治療人類疾病之前，我們必須開發更好的病毒體系，仔細評估病毒遞送系統的長期安全性和有效性。

6. 由於神經細胞的軸突、樹突互相交聯，光敏蛋白的響應信號很容易就幹擾到周邊的神經細胞，因此需要開發一些僅表達在胞體上的光敏蛋白（新發表的光敏蛋白soCoChR）；另一方面，想要通過光遺傳達到某一個細胞的精度很難實現（需要發展單細胞級的光遺傳技術）。

7. 另一個更開放的問題就是這項技術如何應用到臨床研究。因為我們現在僅僅掌握人類大腦裡粗略的細胞類型和功能，要精確定位可作為臨床研究靶點的神經細胞還需要更堅實的基礎科學依據。當然，毫無疑問的是，通過光遺傳學在基礎神經科學中的應用，未來將會發現更多的供藥物開發的分子靶點，更多的供計算機模擬人腦的環路位點，更多的供再生醫學如修復人腦使用的方法策略。

彩蛋來啦！！！

作為光遺傳學的先驅者以及透明腦技術CLARITY的發明者，美國加利福尼亞州史丹福大學的神經科學家Karl Deisseroth在神經科學領域大名鼎鼎。Crispr-Cas9 領域「大牛」張鋒在2004年本科畢業後即師從Karl Deisseroth，他們的合作促成了一個全新的領域，也就是大名鼎鼎的光遺傳技術(optogenetics)。下面是Karl Deisseroth精彩演說，猛戳視頻↓↓↓

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