一種毒死蜱抗原及其製備方法與流程

2023-05-21 11:52:06

本發明涉及生物化工技術領域，尤其涉及一種毒死蜱抗原及其製備方法。

背景技術：

毒死蜱[chlorpyrifos，o,o-二乙基-o-(3,5,6-三氯-2-吡啶基)硫逐磷酸酯]，商品名為毒死蜱、樂斯本、白蟻清等，毒死蜱原藥為白色顆粒狀晶體，室溫下穩定，有硫醇氣味，比重1.398(43.5℃)，熔點41.5～43.5℃，在水中的溶解度為1.2×10-5g/kg，溶於大多數有機溶劑。通過觸殺、胃毒和燻蒸三種作用方式防治糧食、果樹、蔬菜和其他經濟作物的害蟲，經過皮膚、呼吸道以及腸胃吸收等途徑進入人體後，可與膽鹼酯酶迅速結合，形成磷醯化膽鹼酯酶，使其失去催化水解乙醯膽鹼的能力，導致大量的乙醯膽鹼在體內蓄積，並抑制僅有的乙醯膽鹼酯酶活力，使中樞神經系統及膽鹼能神經過度興奮而出現中毒症狀，長期作用人體還可引起致畸、致癌、致突變危害。

毒死蜱目前廣泛地應用於農業生產上，作為一種廣譜型有機磷酸酯類殺蟲劑，是甲胺磷和甲基對硫磷等高毒農藥的新型高效、低毒替代品種之一，也是安全農產品農藥殘留監控的重要品種；而且，環境樣品中發現毒死蜱殘留的情況也日趨嚴重，對人們的健康構成了潛在的威脅。農藥殘留對食品安全造成了嚴重威脅，農藥殘留量的快速檢測技術受到人們越來越廣泛的關注。

目前國內檢測農殘的方法多為氣相色譜和液相色譜法，這些方法不僅需要昂貴的儀器，而且樣品預處理繁瑣，不能滿足現場快速測定農殘的需要。因此，研究一種農藥殘留的快速測定方法具有重要的意義。免疫分析技術是近年來發展起來的檢測農殘新方法，具有簡便、快速、靈敏和特異性強等優點。其中，酶聯免疫吸附測定技術enzyme-linkedimmunosorbentassay(elisa)，是將免疫技術與現代測試手段相結合而建立的一種超微量的測定方法，具有成本低、速度快、靈敏度高、儀器設備簡單的特點，適合大批量樣品的快速分析。而免疫學檢測方法的基礎是相應的高特異性、高親和力的抗體的製備，而毒死蜱作為小分子化合物，本身不具備免疫原性，因此，其半抗原的結構改造和全抗原合成是建立免疫速測技術的關鍵和難點之一。

技術實現要素：

鑑於現有技術中存在的問題，本發明的目的之一在於提供一種毒死蜱抗原及其製備方法，本發明所提供的毒死蜱抗原的合成方法簡單，純度高、產量高，對於毒死蜱抗體的製備以及毒死蜱農藥殘留檢測具有重要價值。

為達此目的，本發明採用以下技術方案：

第一方面，本發明提供了一種毒死蜱半抗原，所述毒死蜱半抗原的化學結構式如式(i)所示：

第二方面，本發明還提供了如第一方面所述的毒死蜱半抗原的製備方法，其包括如下步驟：

將毒死蜱與巰基丙酸按照1:(2～2.5)的摩爾比反應，得到所述毒死蜱半抗原。

本發明中所述毒死蜱半抗原的反應路線如下所示：

本發明中，所述毒死蜱與巰基丙酸的摩爾比為1:(2～2.5)，例如1:2、1:2.05、1:2.1、1:2.15、1:2.2、1:2.25、1:2.3、1:2.35、1:2.4、1:2.45或1:2.5。

優選地，所述毒死蜱與巰基丙酸的反應在有機溶劑中進行。

優選地，所述有機溶劑為含有naoh的乙醇溶液。

優選地，所述反應的時間為2～4h，例如2h、2.2h、2.5h、3h、3.2h、3.5h或4h。

優選地，所述毒死蜱半抗原的製備方法可以具體包括如下步驟：

(1)向毒死蜱的乙醇溶液中邊攪拌邊加入naoh，再加入巰基丙酸的乙醇溶液，毒死蜱與巰基丙酸的摩爾比為1:(2～2.5)，回流反應2～4h；

(2)反應完全後，抽濾出固體，濾液旋轉蒸發乾，殘餘物中加入5％的nahco3溶液，用正己烷萃取，棄去有機相，水相用鹽酸調ph值至3～4，再用二氯甲烷萃取三次，有機相用無水naso4乾燥過夜後，旋轉蒸發乾，過矽膠柱純化，得到所述毒死蜱半抗原。

第三方面，本發明還提供了一種毒死蜱抗原，所述毒死蜱抗原由第一方面所述的毒死蜱半抗原與載體蛋白偶聯得到。

優選地，所述毒死蜱半抗原與載體蛋白通過醯胺鍵偶聯。

優選地，所述毒死蜱半抗原與載體蛋白偶聯的摩爾比為(25～30):1，例如25:1、25.5:1、26:1、26.5:1、27:1、27.5:1、28:1、28.5:1、29:1、29.5:1或30:1，優選為30:1。

優選地，所述載體蛋白為牛血清白蛋白(bsa)。

優選地，所述毒死蜱抗原的化學結構式如式(ii)所示：

第四方面，本發明還提供了如第三方面所述的毒死蜱抗原的製備方法，其包括以下步驟：

將所述毒死蜱半抗原、載體蛋白、三正丁胺和氯甲酸異丁酯在硼酸鹽緩衝液中反應，得到所述毒死蜱抗原。

優選地，所述載體蛋白、毒死蜱半抗原、三正丁胺、氯甲酸異丁酯和硼酸鹽緩衝液的配比為：100mg:0.09mol:23μl:11μl:5ml。

優選地，所述硼酸鹽緩衝液的ph值為8.5，其濃度為0.1mol/l。

與現有技術方案相比，本發明至少具有以下有益效果：

本發明所提供的毒死蜱抗原的合成方法簡單，一步反應即可完成製備，並且製得的毒死蜱抗原純度高，產量高，其對於毒死蜱抗體的製備以及毒死蜱農藥殘留檢測具有重要價值。

附圖說明

圖1是實施例1製備得到的毒死蜱半抗原的esi圖譜；

圖2是實施例1製備得到的毒死蜱半抗原與載體蛋白通過醯胺鍵偶聯後的紫外掃描圖。

下面對本發明進一步詳細說明。但下述的實例僅僅是本發明的簡易例子，並不代表或限制本發明的權利保護範圍，本發明的保護範圍以權利要求書為準。

具體實施方式

下面結合附圖並通過具體實施方式來進一步說明本發明的技術方案。

為更好地說明本發明，便於理解本發明的技術方案，本發明的典型但非限制性的實施例如下：

下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。

下述實施例中所使用的材料、試劑等。如無特殊說明，均可從商業途徑得到。

下述實施例中所使用的ph值為8.5、濃度為0.1mol/l硼酸鹽緩衝液的配方如下：稱2.84g硼酸、5.15g硼砂，用蒸餾水定容至1l。

下述實施例中所使用的ph值為7.4、濃度為0.01m磷酸鹽緩衝液配方如下：稱7.9gnacl、0.2gkcl、0.24gkh2po4和1.8gk2hpo4，溶於800ml蒸餾水中，用hcl調節溶液的ph值至7.4，最後加蒸餾水定容至1l。

實施例1毒死蜱半抗原的製備

毒死蜱半抗原的合成過程如下：

毒死蜱半抗原的合成方法，包括以下步驟：

在100ml反應瓶中，稱取1.75g(5mmol)毒死蜱溶於25ml乙醇，稱取0.53g(5mmol)巰基丙酸溶於25ml乙醇，滴加到毒死蜱溶液中，並加入0.71gnaoh，回流反應3h，tlc監測反應過程。反應完成後，抽濾出白色固體，濾液旋幹溶劑後，加入25ml5％nahco3溶解，用2*50ml正己烷萃取，收集水相。水相用6mhcl調ph值至2～3，再用二氯甲烷3*50ml萃取，收集有機相，有機相用無水硫酸鈉乾燥過夜。抽濾出固體，旋幹有機相，過矽膠柱。洗脫液為正己烷:乙酸乙酯＝8:1，收集產品部分，旋幹收集液，得到的產品即為毒死蜱半抗原，其化學結構式如式(i)所示。

圖1是本實施例製備得到的毒死蜱半抗原的esi圖譜，該合成產物的esi分子離子峰為442.1(m+23)，402.3為去掉羥基後的離子峰，由此可以看出毒死蜱半抗原已被成功合成。

實施例2毒死蜱人工抗原的製備

1、毒死蜱人工抗原的製備

取30mg由實施例1製備的毒死蜱半抗原30mg(0.071mmol)，溶於1.5mldmf中，4℃攪拌下加入18μl三正丁胺，反應30min後，加入9μl氯甲酸異丁酯，室溫反應1h，反應完畢後成為a液；稱取bsa79mg，溶於硼酸鹽緩衝液中，稱為b液；將a液逐滴加入到b液中，邊加邊攪拌，置室溫(25℃)下磁力攪拌反應過夜(12h)，離心後取上清，4℃0.01m，ph7.4磷酸鹽緩衝液中透析3天，每天更換透析液2次，得到毒死蜱人工抗原，冷凍保存。

2、毒死蜱人工抗原的鑑定

將上述產物用0.01m，ph7.4磷酸鹽緩衝液配成溶液進行紫外(200～400nm)掃描，完全抗原紫外光譜在277.5nm處有特徵吸收峰，牛血清白蛋白(bsa)在264.5nm有特徵吸收峰，而半抗原在250nm處有特徵吸收峰，完全抗原的紫外吸收圖譜不同於原載體蛋白和半抗原的紫外掃描圖譜，說明毒死蜱半抗原與載體蛋白成功偶聯(見圖2)。

通過上述結果可以看出，本發明成功製備得到了毒死蜱人工抗原，其合成方法簡單，一步反應即可完成製備，並且製得的毒死蜱抗原純度高，產量高，其對於毒死蜱抗體的製備以及毒死蜱農藥殘留檢測具有重要價值。

申請人聲明，本發明通過上述實施例來說明本發明的詳細結構特徵，但本發明並不局限於上述詳細結構特徵，即不意味著本發明必須依賴上述詳細結構特徵才能實施。所屬技術領域的技術人員應該明了，對本發明的任何改進，對本發明所選用部件的等效替換以及輔助部件的增加、具體方式的選擇等，均落在本發明的保護範圍和公開範圍之內。

以上詳細描述了本發明的優選實施方式，但是，本發明並不限於上述實施方式中的具體細節，在本發明的技術構思範圍內，可以對本發明的技術方案進行多種簡單變型，這些簡單變型均屬於本發明的保護範圍。

另外需要說明的是，在上述具體實施方式中所描述的各個具體技術特徵，在不矛盾的情況下，可以通過任何合適的方式進行組合，為了避免不必要的重複，本發明對各種可能的組合方式不再另行說明。

此外，本發明的各種不同的實施方式之間也可以進行任意組合，只要其不違背本發明的思想，其同樣應當視為本發明所公開的內容。