一種小球藻功能成分連續提取的方法

2023-05-21 19:13:11

專利名稱：一種小球藻功能成分連續提取的方法
技術領域：
本發明屬於海洋生物技術領域，特別涉及一種小球藻功能成分連續提取的方法。
背景技術：
小球藻是普生性單細胞綠藻，屬綠藻綱綠球目卵囊藻科小球藻屬，在自然界分布 廣泛，能利用光能自養，也能在異養條件下利用有機碳源進行生長、繁殖。現在世界上的小 球藻有15種左右，加上變種有上百種之多。小球藻具有豐富全面的營養成分和生物活性 物質。通常小球藻蛋白質含量較高(55% 67% )，含有較多的糖類(15% 20%)和脂 類(5% 10%)，含有生物活性多糖、生長因子、糖蛋白、糖脂蛋白、膳食纖維等。其所含蛋 白質中胺基酸種類齊全，包含人體必需的八種胺基酸且組成平衡。由於小球藻營養價值高， 兼具保健功能，在一些國家和地區已有很大程度的開發和利用，先後開發成蛋白源飼料、食 品、飲料、醫藥製品等。 小球藻中含有功能性油脂。目前，EPA(二十碳五烯酸)和DHA(二十二碳六烯酸) 的開發應用已受到世界各國的關注和重視，在保健品和醫藥方面的應用開發已十分引人注 目，研究和開發EPA和DHA產品具有廣闊的應用前景和巨大的經濟價值。其唯一的商業來 源——魚油作為EPA和DHA的來源已難以滿足人們生活的需要，需尋找EPA和DHA更為廣 闊、穩定的來源。小球藻中含有豐富的EPA和DHA，且海藻油脂與魚油相比，具有脂肪酸組成 穩定，不含膽固醇，沒有難聞的魚腥味和重金屬元素的汙染，藻類可以通過簡單生長營養素 的培養，有生長周期短、收穫快等優點，而且還可以通過生物工程方法和培養條件的控制來 提高EPA和DHA的含量。因此，利用小球藻作為生產EPA和DHA的又一來源具有很大潛力。
CN1018071B介紹了一種小球藻的生態採收方法，但操作周期過長，產率低，且影響 小球藻正常的生長。CN1302013C介紹了一種活性小球藻多糖的製備方法，通過超聲波破壁， 再用熱浸提並除雜，獲得的提取物具有強的免疫調節活性，具有增強機體免疫力、抗腫瘤、 預防心腦血管疾病等功能，但其得率較低，且浪費了小球藻其他功能成分。CN101053577A公 開了小球藻壓力破壁及核苷酸、蛋白質、多糖、藻乾粉的製取方法，對小球藻採用常溫壓力 破壁，但製備產品的過程中需要_201:冷凍，其能耗非常高。CN 11359270公開了一種小球 藻提取液的製備方法，得到的是一種混合物，且產率較低。CN11647620發明了一種小球藻生 長因子提取方法，包括溫浴、破壁、酶解、分離、殘渣利用等步驟。同樣存在產物不明確，產率 低且浪費嚴重的現象。

發明內容
本發明的目的是提供一種小球藻功能成分連續提取的方法，主要的產品包括葉綠 素、小球藻活性多糖、小球藻功能性油脂和小球藻蛋白。在確保小球藻功能成分的活性基礎 上，對工藝進行優化，以獲得較高得率並降低生產成本。 本發明的技術方案通過膜分離技術將小球藻進行富集，得到濃縮的小球藻漿液， 在液相體系中加入適當的酶進行破壁，破壁以後的小球藻溶液利用溶劑萃取葉綠素，可以
3得到功能性色素產品，並降低後續產品的色值；經過脫色的小球藻，在水相首先進行酶解，
然後用溶劑萃取功能性油脂，得到的脫脂小球藻用酸法提取活性多糖後其餘部分進行乾燥
獲得小球藻粗蛋白。
具體工藝為 1)膜分離 利用微孔濾膜濃縮小球藻培養液至原體積的0. 5 1 % ，膜分離參數錯流速度為 2. 4 5cm/s，操作壓力為0. 02 0. 08MPa，溫度為20°C 40°C ;
2)酶解破壁 利用複合酶水解濃縮小球藻液中小球藻的細胞壁，所述的複合酶為纖維素酶、果 膠酶、木聚糖酶，酶解工藝參數為溫度40°C 6(TC，每種酶添加量為小球藻濃縮液中乾物 質質量的O. 1 0. 5%，酶解時間為1 5h;
3)色素製備 採用乙醇做為提取劑，從破壁小球藻液中提取葉綠素，提取濃度50 70%，提取 溫度為，5(TC 6(TC，提取時間為2 6h，然後離心得到乙醇提取液和脫色小球藻，乙醇提 取液再經減壓濃縮得葉綠素；
4)酶解提油 採用酶法結合有機溶劑從脫色小球藻中提取油脂，有機溶劑是石油醚、正己烷或
環己烷，脫色小球藻與有機溶液的料液體積比為i : 5 i : io，中性蛋白酶的添加量為脫
色小球藻質量的2. 5 8. 5。；，溫度為5(TC 6(TC，中性蛋白酶酶解結合有機溶劑萃取時間 為3 7h ;離心得到有機溶劑相和脫脂小球藻；
5)酸法提取小球藻多糖 採用酸法從脫脂小球藻中提取小球藻活性多糖，酸的pH值為3 5，提取溫度為 50 8(TC，提取時間為2 4h ;離心得到水相和沉澱，水相經減壓濃縮後進行乙醇沉澱；
6)乾燥製備小球藻蛋白 將提取多糖後的沉澱物在減壓條件下進行乾燥，真空度為0. 01 0. 03Mpa，溫度
為40°C 50°C ，得小球藻粗蛋白。 本發明與傳統方法相比具有以下有益效果 1、傳統的小球藻富集方法採用離心沉降，但其能耗過高，生產效率極低。膜分離具 有分子級分離、無相變、無溶劑汙染、容易保持生物分子的活性、操作簡單可靠等其他濃縮 純化方式不具有的特點。由於小球藻培養液中小球藻濃度非常低，通過膜分離可提高其濃 度以利於後續開發。 2、小球藻的功能性成分均處於細胞內，在提取分離之前，需要破碎細胞的細胞壁、
細胞膜，使活性成分以溶解的狀態釋放出來，並保持其活性。細胞破碎程度越高，活性成分
的得率也越高。本發明通過研究小球藻細胞壁的組成，利用複合酶水解胞壁，可顯著提高小
球藻的破壁率，如表l所示。 表1酶法破壁與傳統破壁的效果對比方法反覆四次凍融法超聲波破壁複合酶法破壁
破壁率70. 32±3. 27%74. 26±1. 25%91. 54±2. 83% 3、自養小球藻顏色深綠，葉綠素是其主要顯色成分，本身具有抗胃潰瘍作用、抗變 態反應作用、抗腦血管性疾病作用，是優異的健康食品、功能性食品、醫藥原材料。同時又對 其他產品的感官有不利影響，所以需要將其提取分離出來。本發明利用乙醇將其萃取分離 出來，可做為功能配料同時減少後續產品的色值，如表2所示。
表2乙醇萃取前後小球藻濃縮液色值的變化
萃取時間0. 5hlh3h
色值降低率25. 3±1. 25%56. 24±2. 85%86. 45±4. 51% 4、本發明採用酶法輔助有機溶劑提取小球藻油脂，可顯著提高小球藻油脂的提取 率，且提取條件較溫和，不會對油脂品質造成不利影響，小球藻油的提取率及EPA含量如表 3所示。 表3小球藻油脂的提取率及EPA含量
提取方法單純有機溶劑萃取酶法輔助 萃取
提取率 (佔小球藻重百分比)3. 36±2. 21%5. 24± 1. 58%
EPA含量 (佔藻油百分比)2. 63 ±1. 29%2. 53± 0. 32 %


圖1是本發明的工藝流程圖。
具體實施方式

實施例1 用泵將小球藻培養液導入以聚碸(或陶瓷或聚醚)為膜材料的膜分離系統進 行微孔膜過濾，控制膜分離工藝參數為錯流速度為2. 4cm/s，操作壓力為0. 02MPa，溫度 為2(TC，將小球藻濃縮至原體積的0. 5%，得到小球藻濃縮液。在濃縮液中加入纖維素酶 0. 1%、果膠酶0. 1%、木聚糖酶0. 1% (酶添加量為佔小球藻濃縮液中乾物質質量的百分比)，溫度40°C ，酶解lh進行破壁。得到破壁小球藻濃縮液，在破壁的小球藻濃縮液中加入 乙醇，使其濃度為50^，溫度為5(TC，提取2h。然後離心(3000r/min)，得到乙醇提取液和 脫色小球藻，乙醇提取液進行減壓濃縮回收乙醇，並濃縮得粘稠狀葉綠素，提取率為0. 3%。 脫色小球藻按料液體積比l : 5加入石油醚，並加入中性蛋白酶2.5%。(佔脫色小球藻質量 的百分比)，酶解萃取時間為3h，溫度為50°C。酶解時間結束後離心(3000r/min)，得有機 溶劑相和脫脂小球藻，有機溶劑相減壓濃縮、回收石油醚，然後過濾得小球藻油脂，得率為 5.3%。脫脂小球藻按料液體積比l : 8加入pH為3的稀鹽酸溶液，溫度為5(TC，提取2h。 然後進行離心(3000r/min)，得水相和沉澱，水相經減壓濃縮後醇沉、乾燥得小球藻多糖，得 率為2. 6%。將提取多糖後的沉澱物經真空乾燥，真空度為0. 02MPa，溫度為4(TC，得小球藻 粗蛋白，得率為68.3%。
實施例2 用泵將小球藻培養液導入以聚碸(或陶瓷或聚醚)為膜材料的膜分離系統進行微 孔膜過濾，控制膜分離工藝參數為錯流速度為5cm/s，操作壓力為0. 04MPa，溫度為30°C， 將小球藻濃縮至原體積的0.8%，得小球藻濃縮液。在濃縮液中加入纖維素酶0.2%、果 膠酶0. 3%、木聚糖酶0. 4% (酶添加量為佔小球藻濃縮液中乾物質質量的百分比)，溫度 50°C ，酶解2h進行破壁，得到破壁小球藻濃縮液。在破壁的小球藻濃縮液中加入乙醇，使其 濃度為60%，溫度為55t:，提取3h。然後離心(3000r/min)，得到乙醇提取液和脫色小球 藻，乙醇提取液進行減壓濃縮回收乙醇，並濃縮得粘稠狀葉綠素，提取率為0. 32%。脫色小 球藻按料液體積比l : 8加入石油醚，並加入中性蛋白酶3.5%。(佔脫色小球藻質量的百分 比)，酶解萃取時間為3h，溫度為55°C。酶解時間結束後離心(3000r/min)，得有機溶劑相 和脫脂小球藻，有機溶劑相減壓濃縮、回收石油醚，然後過濾得小球藻油脂，得率為5. 4% 。 脫脂小球藻按料液體積比1 : 8加入pH為4的稀硫酸溶液，溫度為55°C，提取4h。然後 進行離心(3000r/min)，得水相和沉澱，水相經減壓濃縮後醇沉、乾燥得小球藻多糖，得率為 2. 7%。將提取多糖後的沉澱物經真空乾燥，真空度為0. 02MPa，溫度為4(TC，得小球藻粗蛋 白，得率為67.2%。
實施例3 用泵將小球藻培養液導入以聚碸(或陶瓷或聚醚)為膜材料的膜分離系統進行微 孔膜過濾，控制膜分離工藝參數為錯流速度為4cm/s，操作壓力為0. 08MPa，溫度為40°C， 將小球藻濃縮至原體積的1%，得小球藻濃縮液。在濃縮液中加入纖維素酶0.3%、果膠酶 0. 3%、木聚糖酶0. 3% (酶添加量為佔小球藻濃縮液中乾物質質量的百分比)，溫度60°C， 酶解5h進行破壁，得到破壁小球藻濃縮液。在破壁的小球藻濃縮液中加入乙醇，使其濃度 為70%，溫度為5(TC，提取6h。然後離心(3000r/min)，得到乙醇提取液和脫色小球藻，乙 醇提取液進行減壓濃縮回收乙醇，並濃縮得粘稠狀葉綠素，提取率為0. 35% 。脫色小球藻按 料液體積比l : 10加入石油醚，並加入中性蛋白酶8.5%。(佔脫色小球藻質量的百分比)， 酶解萃取時間為7h，溫度為60°C。酶解時間結束後離心(3000r/min)，得有機溶劑相和脫脂 小球藻，有機溶劑相減壓濃縮、回收石油醚，然後過濾得小球藻油脂，得率為5. 8%。脫脂小 球藻按料液體積比1 : 8加入pH為3的稀醋酸溶液，溫度為8(TC，提取4h。然後進行離心 (3000r/min)，得水相和沉澱，水相經減壓濃縮後醇沉、乾燥得小球藻多糖，得率為2. 9% 。將 提取多糖後剩餘的沉澱物經真空乾燥，真空度為0. 02MPa，溫度為40°C ，得小球藻粗蛋白，
6得率為65.0%。
實施例4 用泵將小球藻培養液導入以聚碸(或陶瓷或聚醚)為膜材料的膜分離系統進行 微孔膜過濾，控制膜分離工藝參數為錯流速度為3. 5cm/s，操作壓力為0. 05MPa，溫度為 30°C ，將小球藻濃縮至原體積的0. 6% ，得小球藻濃縮液。在濃縮液中加入纖維素酶0. 5% 、 果膠酶0. 5%、木聚糖酶0. 5% (酶添加量為佔小球藻濃縮液中乾物質質量的百分比)，溫 度60°C ，酶解5h進行破壁，得到破壁小球藻濃縮液。在破壁的小球藻濃縮液中加入乙醇，使 其濃度為60%，溫度為6(TC，提取4h。然後離心(3000r/min)，得到乙醇提取液和脫色小球 藻，乙醇提取液進行減壓濃縮回收乙醇，並濃縮得粘稠狀葉綠素，提取率為0. 33%。脫色小 球藻按料液體積比l : 6加入石油醚，並加入中性蛋白酶7.5%。(佔脫色小球藻質量的百分 比)，酶解萃取時間為5h，溫度為55°C。酶解時間結束後離心(3000r/min)，得有機溶劑相 和脫脂小球藻，有機溶劑相減壓濃縮、回收石油醚，然後過濾得小球藻油脂，得率為5. 8 % 。 脫脂小球藻按料液體積比l : 8加入pH為5的稀鹽酸溶液，溫度為8(TC，提取3h。然後 進行離心(3000r/min)，得水相和沉澱，水相經減壓濃縮後醇沉、乾燥得小球藻多糖，得率為 2. 65%。將提取多糖後的沉澱物經真空乾燥，真空度為0. 02MPa，溫度為4(TC，得小球藻粗 蛋白，得率為66. 1%。 上述實施例1-實施例4中的酸可以為鹽酸、硫酸、草酸或醋酸。
上述實施例1-實施例4中石油醚可用正己烷或環己烷替代。
權利要求
一種小球藻功能成分連續提取的方法，其特徵是1.1)膜分離利用微孔濾膜濃縮小球藻培養液至原體積的0.5～1％，膜分離參數錯流速度為2.4～5cm/s，操作壓力為0.02～0.08MPa，溫度為20℃～40℃；1.2)酶解破壁利用複合酶水解濃縮小球藻液中小球藻的細胞壁，所述的複合酶為纖維素酶、果膠酶、木聚糖酶，酶解工藝參數為溫度40℃～60℃，每種酶添加量為小球藻濃縮液中乾物質質量的0.1～0.5％，酶解時間為1～5h；1.3)色素製備採用乙醇做為提取劑，從破壁小球藻液中提取葉綠素，提取濃度50～70％，提取溫度為，50℃～60℃，提取時間為2～6h，然後離心得到乙醇提取液和脫色小球藻，乙醇提取液再經減壓濃縮得葉綠素；1.4)酶解提油採用酶法結合有機溶劑從脫色小球藻中提取油脂，有機溶劑是石油醚、正己烷或環己烷，脫色小球藻與有機溶液的料液體積比為1∶5～1∶10，中性蛋白酶的添加量為脫色小球藻質量的2.5～8.5‰，溫度為50℃～60℃，中性蛋白酶酶解結合有機溶劑萃取時間為3～7h；離心得到有機溶劑相和脫脂小球藻；1.5)酸法提取小球藻多糖採用酸法從脫脂小球藻中提取小球藻活性多糖，酸的pH值為3～5，提取溫度為50～80℃，提取時間為2～4h；離心得到水相和沉澱，水相經減壓濃縮後進行乙醇沉澱；1.6)乾燥製備小球藻蛋白將提取多糖後的沉澱物在減壓條件下進行乾燥，真空度為0.01～0.03Mpa，溫度為40℃～50℃，得小球藻粗蛋白。
全文摘要
一種小球藻功能成分連續提取的方法，通過膜分離技術將小球藻進行富集，得到濃縮的小球藻漿液，在液相體系中加入適當的酶進行破壁，破壁以後的小球藻溶液利用溶劑萃取葉綠素，可以得到功能性色素產品，並降低後續產品的色值；經過脫色的小球藻，在水相首先進行酶解，然後用溶劑萃取功能性油脂，得到的脫脂小球藻用酸法提取活性多糖後其餘部分進行乾燥獲得小球藻粗蛋白。主要的產品包括葉綠素、小球藻活性多糖、小球藻功能性油脂、小球藻蛋白等，在確保小球藻功能成分的活性基礎上，對工藝進行優化，以獲得較高得率並降低生產成本。
文檔編號C12P7/64GK101736045SQ20091022058
公開日2010年6月16日 申請日期2009年12月3日 優先權日2009年12月3日
發明者何餘堂, 劉昊東, 劉賀, 朱丹實, 郭曉飛 申請人:渤海大學